Efeito de agentes fumigantes sobre o bolor azul e o mofo cinzento em frutos de maçã

Effect of fumigants on blue and gray molds of apple fruit

COMUNICAÇÃO SHORT COMMUNICATION

Efeito de agentes fumigantes sobre o bolor azul e o mofo cinzento em frutos de maçã

Effect of fumigants on blue and gray molds of apple fruit

Guilherme Telésforo Osório; Bruno Salvador Oliveira; Robson Marcelo Di Piero

Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Catarina, Cx. Postal 476, 88040-900, Florianópolis, SC, Brasil

RESUMO

O bolor azul (Penicillium expansum) e o mofo cinzento (Botrytis cinerea) causam perdas significativas em pós-colheita de frutos de maçã. Como alternativa de controle, avaliou-se o efeito da fumigação de ácido acético, acetaldeído, benzaldeído, d-limoneno, timol, metil jasmonato e álcool etílico nas concentrações de 8 e 15 µL/L de ar sobre a germinação de esporos e sobre a incidência e a severidade dessas podridões em maçãs 'Fuji'. A germinação de esporos foi avaliada em lâminas escavadas, dispostas no interior de caixas plásticas, onde um agente fumigante atuou durante 60 min. Com microscópio ótico, observou-se, 24 h depois, que o ácido acético a 8 µL/L de ar inibiu totalmente a germinação de esporos de P. expansum, enquanto limoneno, timol, benzaldeído e metil jasmonato reduziram-na parcialmente. Apenas ácido acético e benzaldeído apresentaram efeito inibitório sobre B. cinerea. Nos testes in vivo, a fumigação ocorreu em caixas plásticas contendo quatro frutos previamente inoculados por parcela. Ácido acético reduziu a incidência de bolor azul e de mofo cinzento em 44% e 100%, respectivamente, a 8 µL/L de ar, porém causou fitotoxidez nos frutos, mostrando potencial uso para a redução de inóculo de Penicillium e Botrytis, principalmente na desinfestação das câmaras.

Palavras-chave: Botrytis cinerea, Penicillium expansum, ácido acético, compostos voláteis, fumigação.

ABSTRACT

Blue mold (Penicillium expansum) and gray mold (Botrytis cinerea) cause significant post-harvest losses of apple fruit. As a control alternative, the effects of fumigation with acetic acid, acetaldehyde, benzaldehyde, d-limonene, thymol and methyl jasmonate, at 8 and 15 µL/L of air, on the germination of spores and the incidence and severity of blue and gray mold in 'Fuji' apples were evaluated. The germination of spores was evaluated in excavated slides arranged onto plastic boxes, where the fumigant agent acted for 60 min. With optical microscopy, it was observed after 24 h that acetic acid at 8 µL/L completely inhibited spore germination of P. expansum, while limonene, thymol, benzaldehyde and methyl jasmonate partially reduced it. Only acetic acid and benzaldehyde showed an inhibitory effect on B. cinerea. In in vivo tests, fumigation was conducted in plastic boxes containing four previously inoculated fruits per plot. Acetic acid reduced the incidence of blue mold and gray mold by 44% and 100%, respectively, at 8 µL/L of air. However, it caused phytotoxicity on fruits, indicating a potential use for reduction of inoculum of Botrytis and Penicillium in the disinfestation of chambers.

Key words:Botrytis cinerea, Penicillium expansum, acetic acid, fumigation, volatile compounds.

A macieira (Malus domestica Borkh.) é uma das mais importantes culturas agrícolas no sul do Brasil, um dos 10 maiores produtores mundiais em 2010 (FAOSTAT, 2011), com 1,27 milhões de toneladas de maçãs colhidas em 38,6 mil hectares. Devido ao curto período de colheita, longos períodos de armazenamento são essenciais para a regulação do mercado, sendo elevados os investimentos em câmaras frias e atmosferas controladas visando minimizar deteriorações fúngicas nos frutos (Pereira et al., 2010).

Perdas significativas em pós-colheita são causadas por Penicillium expansum (Link) Thom. e Botrytis cinerea Persoon ex Fries, agentes causais do bolor azul e do mofo cinzento, aquele pela extrema agressividade e este por sobreviver na forma de escleródios e ser ativo a baixas temperaturas, ocorrendo contaminações principalmente nas câmaras frias (Amiri & Bompeix,2005). Devido às crescentes preocupações com a ecologia, saúde do consumidor e a seleção de isolados resistentes aos fungicidas, métodos alternativos de controle têm sido estudados (Jacometti et al., 2010).

A fumigação é empregada no controle fitossanitário em diferentes frutos, sementes, grãos, madeiras, além da desinfestação de galpões e equipamentos. Entre as substâncias mais utilizadas, estão o dióxido de enxofre (Austin et al., 1997) e a fosfina (Rajendran & Muralidharan, 2001). Por fazerem parte da composição de diversos vegetais e da dieta humana, sugerindo baixa toxidez, substâncias voláteis como ácido acético, acetaldeído, benzaldeído, d-limoneno, timol, metil jasmonato e etanol são candidatas à utilização comercial com a finalidade de proteção de culturas.

Ácido acético, principal constituinte dos vinagres, vem sendo estudado no controle de podridões através da fumigação de frutos, como damascos e ameixas (Liu et al., 2002), assim como etanol e acetaldeído (Pesis, 2005). Limoneno faz parte dos óleos essenciais de frutas cítricas, exibindo efeito anti-inflamatório, antioxidante e antifúngico (Singh et al., 2010), enquanto timol, encontrado em tomilho e manjericão, possui atividade antioxidante e antimicrobiana (Bagamboula et al., 2004). A síntese de ácido abscísico, envolvido nas respostas de defesa a fitopatógenos em plantas, depende de substratos como benzaldeído e acetaldeído (Omarov et al., 1999), sugerindo indução de resistência. Metil jasmonato elicita defesas em plantas sadias quando é liberado no ambiente por aquelas atacadas por patógenos e herbívoros (Karban et al., 2000).

Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antifúngica de compostos voláteis sobre P. expansum e B. cinerea, em experimentos in vitro e in vivo.

As substâncias timol, acetaldeído, benzaldeído e d-limoneno foram obtidas da empresa VETEC Química Fina Ltda.; metil jasmonato, da Sigma-Aldrich Ltda.; álcool etílico absoluto, da Synth Produtos para Laboratório Ltda.; ácido acético glacial, da CAQ - Casa da Química Indústria e Comércio Ltda.

Os fungos utilizados foram isolados de frutos infectados de maçã e mantidos em meio batata-dextrose-ágar (BDA), a 25 ± 1ºC e fotoperíodo de 12 h. Periodicamente, os fitopatógenos foram reisolados de frutos inoculados e sintomáticos para manter a patogenicidade. Esporos de P. expansum foram raspados de colônias de 12 dias com alça de platina e depositados em água destilada ou suco de maçã a 4% para obter suspensões destinadas aos testes in vivo ou in vitro, respectivamente. Para a coleta de esporos de B. cinerea, discos com estruturas fúngicas obtidos de culturas de 30 dias em BDA, com esporulação abundante, foram agitados em água destilada. Após filtração em gaze, as suspensões de esporos tiveram suas concentrações ajustadas com hemacitômetro.

Inicialmente, foram avaliados ácido acético glacial, acetaldeído, benzaldeído, limoneno, metil jasmonato e água destilada, a 8 µL/L de ar, sobre a germinação de esporos e o crescimento do tubo germinativo de P. expansum e B. cinerea. Posteriormente, foram testados ácido acético glacial, acetaldeído, benzaldeído, timol, etanol e água destilada, a 15 µL/L de ar, sobre os dois fitopatógenos. Para tanto, 60 µL/L de suspensão de esporos (1 x 10⁵ esporos/mL) foram depositados em lâminas escavadas de microscopia, colocadas no interior de caixas plásticas de 10 L (400 x 270 x 133 mm), em uma das suas extremidades. Na outra extremidade, foram colocadas placas de Petri contendo 80 ou 150 µL de uma das substâncias avaliadas. As caixas foram fechadas, vedadas com filme plástico e incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Logo após, as lâminas foram retiradas, mantidas em capela de exaustão por 15 min e incubadas em placas de Petri sob alta umidade, a 25 ± 1ºC e fotoperíodo de 12 h. Avaliou-se a germinação de 100 esporos e o comprimento de 30 tubos germinativos por repetição, 24 h após, utilizando ocular micrométrica em aumento de 100 vezes. Cada escavação da lâmina contendo uma gota da suspensão de esporos representou uma repetição, sendo quatro por tratamento.

Para os testes in vivo, frutos de maçã da cultivar Fuji, categoria 1, classe 120, cedidos pela cooperativa COOPERSERRAde São Joaquim (SC), foram desinfestados em hipoclorito de sódio a 0,5% por 3 min, lavados em água corrente e secos à temperatura ambiente antes de serem utilizados. Foram feitos dois círculos de 3 mm de diâmetro com caneta esferográfica na região equatorial dos frutos, onde foram depositadas gotas de 15 µLde suspensão de esporos (1 x 10⁶ esporos/mL). Após a secagem das gotas, quatro frutos inoculados foram colocados no interior de caixas plásticas de 10 L (400 x 270 x 133 mm), constituindo uma unidade experimental. No centro das caixas, foram dispostas placas de Petri contendo 80 ou 150 µL de um composto volátil a ser avaliado. As caixas foram fechadas e vedadas com filme plástico, realizando-se a fumigação do composto por uma hora à temperatura ambiente. Posteriormente, foram feitos ferimentos nos locais marcados nos frutos com agulha de 1 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade. As caixas foram fechadas e incubadas a 25 ± 1ºC no escuro, sob alta umidade relativa. A câmara úmida foi obtida pela deposição de duas folhas de papel toalha, umedecidas com 10 mL de água destilada, no fundo de cada caixa.

Em experimentos independentes, foram avaliadas as severidades do bolor azul e do mofo cinzento em frutos submetidos à fumigação de ácido acético glacial, acetaldeído, benzaldeído, timol, etanol, limoneno, metil jasmonato e água destilada, todos na concentração de 8 µL/L de ar. Posteriomente, em experimentos adicionais, foram avaliados ácido acético glacial, acetaldeído, benzaldeído, timol, etanol e água destilada a 15 µL/L de ar. Finalmente, avaliou-se o efeito do ácido acético a 0, 1, 2, 4, 8 e 16 µL/L de ar para o controle das doenças.

A avaliação das podridões em cada experimento foi feita através da mensuração do diâmetro das lesões a cada quatro dias, durante um período de 12 dias, utilizando-se um paquímetro. A severidade final foi calculada através da área abaixo da curva de progresso da doença descrita por Shanner & Finney (1977), pela equação AACPD = Σ [(y_i + y_i+1)/2 x (t_i+1- t_i)], em que yé o diâmetro médio da lesão no tempo t_i, e y_i+1o diâmetro médio no tempo t_i+1. A incidência das podridões foi avaliada na última mensuração das lesões, sendo calculada a partir do número de ferimentos exibindo podridão em relação ao número total de ferimentos inoculados.

Todos os experimentos foram conduzidos em delineamento completamente casualizado, com quatro repetições. As análises de variância e o teste de separação de médias (Tukey, α < 0,05) foram realizados com auxílio do software Statistica 6.0 (STATSOFT).

Nos testes in vitro, a 8 µL/L, ácido acético inibiu completamente a germinação de esporos de P. expansum, enquanto metil jasmonato, benzaldeído, timol e limoneno inibiram-na em 24, 25, 33 e 34%, respectivamente. Aumentando a concentração dos voláteis para 15 µL/L, não houve aumento no nível de inibição. Por outro lado, acetaldeído e etanol não exibiram efeito significativo sobre a germinação do fungo nem na maior concentração testada (Tabela 1). Nas medições de tubos germinativos, a 8 µL/L de ar, acetaldeído, benzaldeído, timol, limoneno e metil jasmonato diminuíram significativamente o crescimento dos tubos em 34, 16, 18, 50 e 28% enquanto a 15 µL/L de ar, acetaldeído, benzaldeído, timol e etanol reduziram o crescimento em 19, 24, 39 e 34%, respectivamente (Tabela 1).

Botrytis cinerea também não germinou na presença de ácido acético, porém foi menos sensível que P. expansum à maioria dos demais compostos voláteis. Apenas acetaldeído e benzaldeído, na concentração de 15 µL/L, reduziram significativamente a germinação do fungo em 15 e 32% (Tabela 1). O crescimento de tubos germinativos desse fitopatógeno foi diminuído significativamente a 8 µL/L de ar por acetaldeído em 35%, benzaldeído em 26% e limoneno em 38%. A 15 µL/L de ar, acetaldeído mostrou inibição significativa de 15% e benzaldeído de 42% (Tabela 1).

Nos testes em frutos, benzaldeído, timol, etanol, limoneno e metil jasmonato não diminuíram significativamente a severidade das podridões, nas concentrações testadas, enquanto acetaldeído diminuiu em 44% a severidade do mofo cinzento a 8 µL/L de ar, mas não exerceu controle sobre o bolor azul de Penicillium (Tabela 2). O maior nível de controle das podridões foi obtido com o ácido acético, que diminuiu em 74% e 95% a severidade do bolor azul e em 100% e 90% a severidade de mofo cinzento, quando utilizado a 8 e 15 µL/L de ar, respectivamente (Tabela 2).

Avaliando-se diferentes concentrações do ácido acético, observou-se que o controle significativo do bolor azul ocorreu a partir de 8 µL/L, quando houve 44 e 70% de redução na incidência e severidade dessa podridão. No caso do mofo cinzento, a fumigação de ácido acético a 1 µL/L propiciou redução de 72 e 84% na incidência e severidade da doença, com níveis crescentes de inibição à medida que a dose do volátil foi aumentada, chegando-se a 100% de controle com o emprego de ácido acético a 8 µL/L (Tabela 3).

A baixa eficiência da maioria das substâncias testadas para controlar as podridões pode estar relacionada às baixas doses utilizadas (8 e 15 µL/L), que exibiram pequena atividade inibitória sobre a germinação de esporos dos fitopatógenos (Tabela 1). Testando fumigantes em concentrações próximas a 30 µL/L de ar para o controle de B. cinerea em frutos de maçã, Chu et al. (1999) observaram que o etanol não exerceu controle, porém o timol reduziu a incidência do mofo cinzento de 36% para 0,5%. Liu et al. (2002) obtiveram redução na incidência de podridões por Monilinia fructicola em frutos de damasco (Prunus armeniaca L.) e ameixas (Prunus salicina L.) tratados com timol a 5 mg/L. No caso do limoneno, Sharma & Tripathi (2006) definiram a necessidade de pelo menos 400 µL/L para a completa inibição da germinação de esporos de P. expansum, enquanto Bicas & Pastore (2007) demonstraram que muitos microrganismos são resistentes a concentrações acima de 2% de limoneno, inclusive fungos e leveduras, podendo utilizá-lo como única fonte de carbono. Segundo (Alla et al., 2008), a diminuição na incidência de Rhizopus stolonifer em damascos, utilizando-se acetaldeído e benzaldeído, é possível apenas com 2 mL/L.

Metil jasmonato, que poderia controlar doenças por efeito antifúngico e/ou pela indução de resistência, apenas diminuiu em 24% a germinação de P. expansum em relação à testemunha na concentração de 8 µL/L de ar (Tabela 1), não mostrando resultados expressivos in vivo (Tabela 2). Segundo Yao & Tian (2005), essa substância elicitou defesas em pêssegos (Prunus persica L.) e diminuiu o crescimento micelial de P. expansum, porém, de forma semelhante ao presente trabalho, não reduziu a podridão em frutos.

O acetaldeído exibiu algum nível de controle do mofo cinzento em um dos experimentos, mas não foi eficiente para o bolor azul de Penicillium (Tabela 2). O seu modo de ação pode estar relacionado à sua oxidação a ácido acético em meio aquoso (Bawn & Williamson, 1951), considerando a umidade natural dos frutos. Essa hipótese foi levantada em função de B. cinerea ter se mostrado mais sensível que P. expansum a ácido acético nos testes in vivo (Tabela 3) e a reação de oxidação do acetaldeído, nesse caso, geraria baixas concentrações de ácido acético, suficientes apenas para controlar o mofo cinzento.

Ficou evidenciado que, para exercer um controle significativo das podridões em frutos, um composto volátil necessita apresentar elevada atividade antifúngica in vitro. O ácido acético inibiu totalmente a germinação de esporos de P. expansum e de B. cinerea e reduziu significativamente as podridões em frutos de maçã, sugerindo a antibiose como o seu principal mecanismo de ação. A capacidade desse ácido em controlar doenças já havia sido demonstrada em damascos e ameixas contra Monilinia fructicola, com redução de 95% e 73% nas podridões pela fumigação de ácido acético a 5 e 8 µL/L de ar, respectivamente (Liu et al., 1999). Chu et al. (1999) relataram diminuição de seis vezes na incidência de mofo cinzento em cerejas (Prunus cerasus L.) com 30 µL/L após aplicação durante 25 min a 2ºC.

A fumigação por uma hora de ácido acético a 8 µL/L de ar a 25ºC, no presente trabalho, controlou completamente o mofo cinzento em frutos de maçã e diminuiu em 44% a incidência de bolor azul (Tabela 3), mas os frutos apresentaram lenticelose (dados não apresentados). Por outro lado, Sholberg et al. (2001) observaram que frutos de maçã armazenados a 1ºC exibiram 50% menos bolor azul quando fumigados com ácido acético a 2,7 µL/L de ar, sem danos à qualidade, enquanto Sholberg & Gaunce (1996) relataram fitotoxidez em pêssego com 2,6 µL/L de ar na mesma temperatura.

Provavelmente, as baixas temperaturas associadas a baixas concentrações dos voláteis diminuem a suscetibilidade dos frutos a anomalias fisiológicas através da redução na taxa respiratória. Outros frutos são menos sensíveis, como laranjas (Citrus sinensis Pers.) e tangerinas (Citrus reticulata Blanco), nos quais o ácido acético a 50 e 75 µL/Lde ar controlou a podridão de Penicillium digitatum, e problemas com fitotoxidez ocorreram apenas em frutos fumigados a 100 µL/L de ar, mesmo a 20ºC (Venditti et al., 2009).

Segundo Sholberg et al. (2003), o único meio confiável para a medição da concentração desse volátil em ambientes fechados é a cromatografia a gás, pois os equipamentos mecânicos comuns, que poderiam monitorar automaticamente o processo, perdem a calibração facilmente. Como as podridões causadas por P. expansum são um dos maiores problemas de maçã na região Sul do país, a fumigação com ácido acético seria plausível apenas para desinfestação de câmaras frias, sem a presença de frutos, pois um erro na aplicação poderia levar à perda de várias toneladas de maçãs. Portanto, dentre os compostos voláteis testados, o ácido acético apresenta potencial de uso no controle de P. expansum e B. cinerea através da fumigação.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -CNPq, pelas bolsas dos dois primeiros autores, e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Santa Catarina -FAPESC, pelos recursos financeiros.

Recebido 2 Agosto 2012

Aceito 20 Setembro 2012

Autor para correspondência: Robson M. Di Piero, e-mail: [e-mail]

TPP-2012-0065

Editor de Seção: Adalberto C. Café Filho

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Jan 2013
• Data do Fascículo
  Fev 2013

Histórico

• Recebido
  02 Ago 2012
• Aceito
  20 Set 2012