Produção de fatores de virulência in vitro por espécies patogênicas do gênero Candida

Production of virulence factors in vitro by pathogenic species of the genus Candida

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Produção de fatores de virulência in vitro por espécies patogênicas do gênero Candida

Production of virulence factors in vitro by pathogenic species of the genus Candida

Kelly Cristina Ortolan Rörig; Jean Colacite; Maxwel Adriano Abegg

Curso de Farmácia, Universidade Paranaense, Toledo, PR

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Avaliou-se, in vitro, a capacidade de crescimento em 39ºC e 42ºC, a produção de enzimas hidrolíticas e a atividade hemolítica de 21 cepas clínicas e de referência de sete espécies de Candida spp, Candida dubliniensis e Candida krusei demonstraram menor potencial de virulência e Candida albicans maior.

Palavras-chaves: Candida spp. Fatores de virulência. Enzimas hidrolíticas. Fungos patogênicos.

ABSTRACT

The growth capacity at 39ºC and 42ºC, production of hydrolytic enzymes and hemolytic activity of 21 clinical and reference strains of seven species of Candida spp were evaluated in vitro.Candida dubliniensis and Candida krusei demonstrated lower virulence potential and Candida albicans higher potential.

Key-words: Candida spp. Virulence factors. Hydrolytic enzymes. Pathogenic fungi.

Leveduras do gênero Candida são frequentemente comensais humanos, mas podem, em situações que normalmente envolvem imunodebilidade, causar infecção conhecida como candidíase ou candidose, em diversos sítios anatômicos².

Estas micoses podem ser causadas por diferentes espécies. Candida albicans continua sendo a espécie mais prevalente, mas espécies de Candida não-albicans, particularmente Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei e Candida parapsilosis, tem adquirido importância crescente¹⁶.

Por conseqüência, há interesse nos fatores de virulência destas leveduras, para estabelecer estratégias de controle com antifúngicos e prevenção^{4 11}.

A habilidade de produzir enzimas hidrolíticas é considerada um importante fator de virulência⁵. As principais enzimas produzidas por leveduras do gênero Candida são as proteinases e as fosfolipases^{1 3}.

Diferentes espécies de Candida demonstram atividade hemolítica quando crescidas em ágar-sangue enriquecido^{7 8}.

Outra característica associada com a patogenicidade em humanos é a propriedade de multiplicação a altas temperaturas, como 39ºC e 42ºC⁶.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de virulência in vitro de 21 cepas clínicas e de referência de sete espécies de Candida.

Organismos testados. Foi investigado um isolado de referência e dois isolados clínicos de sete espécies (Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida guilliermondii e Candida dubliniensis) de Candida. Os isolados foram identificados por avaliação morfológica (micromorfologia em ágar fubá-tween 80) e por testes bioquímicos através do Kit Candifast (International Microbio) e API 20 C (bioMérieux).

Pesquisa de enzimas hidrolíticas. A produção de fosfolipase foi verificada utilizando-se o método do ágar gema de ovo em placa, de acordo com Kantarcioglu e Yucel⁴. As placas de Petri foram incubadas a 37ºC e os diâmetros das colônias e das colônias mais zonas de precipitação foram mensuradas após 7 dias de incubação. A zona de atividade de fosfolipase (Pz) foi calculada de acordo com Price cols⁹, em termos do índice do diâmetro da colônia dividido pelo diâmetro da colônia mais a zona de precipitação. A produção de proteinase foi evidenciada através de halos claros em torno das colônias, em placas de ágar contendo albumina de soro bovina (BSA), conforme Kantarcioglu e Yucel⁴. O índice Pz foi determinado da mesma forma que para a fosfolipase.

A atividade de amilase foi testada com meio contendo 3% de amido de batata solúvel, com pH ajustado a 5, de acordo com Tsuyoshi cols¹⁵. Os halos de atividade foram revelados como zonas claras em torno das colônias pela adição de lugol.

A produção de gelatinase foi verificada em placa contendo 0,8% de gelatina e 5% de ágar. Uma alçada de cada isolado foi inoculada na superfície do ágar e este foi incubado a 30ºC por 7 dias. A produção de gelatinase fica evidente pela formação de halos claros em torno das colônias, utilizando ácido tricloroacético como revelador, conforme Kanemitsu cols³.

Crescimento a 39ºC e 42ºC. Para isto, 10µL de caldo Sabouraud com turvação ajustada ao tubo 1 da escala de Mac Farland, obtido de células novas dos isolados, foi inoculado em ágar Sabouraud-dextrose e incubado a 39ºC e 42ºC por 72h, de acordo com Llanos cols⁶.

Atividade hemolítica. Foram utilizadas placas de Ágar Sabouraud dextrose contendo 3mL de hemácias de sangue humano lavadas 3 vezes com tampão salina-fosfato (PBS)⁸. Discos de papel filtro com 6mm de diâmetro foram posicionados em pontos eqüidistantes na placa e inoculados com 10µL de cultivo das células em caldo Sabouraud com turvação ajustada ao tubo 1 da escala de Mac Farland. Todos os testes foram realizados em triplicata para cada isolado.

A Tabela 1 mostra que os isolados de Candida albicans produziram mais proteinase e fosfolipase que as demais espécies. Esta observação concorda com os resultados de Silva cols¹³, que, comparando a produção enzimática de Candida albicans (nº=31) e Candida parapsilosis (nº=6), observaram que 100% dos isolados de Candida albicans foram produtores de proteinase e 83,8% de fosfolipase. Kantarcioglu e Yucel⁴, estudando a produção de fosfolipase e proteinase em 95 isolados clínicos de várias espécies de Candida (Candida albicans, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lipolytica, Candida lusitaniae, Candida parapsilosis, Candida rugosa e Candida tropicalis), igualmente observaram que Candida albicans apresentou um percentual significativamente maior de isolados produtores de proteinase e fosfolipase.

Linares cols⁵ estudaram a atividade enzimática e capacidade hemolítica de Candida dubliniensis (nº=18) frente à Candida albicans (nº=30). Semelhante ao observado em nosso estudo, claramente Candida albicans é maior produtora de fosfolipase e proteinase e também apresenta maior capacidade hemolítica que esta outra espécie.

Tamura cols¹⁴ avaliaram a produção de fatores de virulência (hidrofobicidade da superfície celular, aderência, atividades de proteinase e de fosfolipase) em 23 amostras de: Candida albicans (nº=7), Candida tropicalis e Candida parapsilosis (nº=6) cada, e Candida lusitaniae e Candida glabrata (nº=2). A maior atividade de fosfolipase e de proteinase (Pz menor) foi de Candida parapsilosis isolada de cateter venoso central. A espécie Candida albicans apresentou atividade levemente inferior (Pz maior) à de Candida parapsilosis. De fato, neste estudo Candida albicans não se destacou como a maior produtora destas enzimas, sendo sua produção até levemente inferior à de Candida tropicalis e Candida glabrata.

Estudando espécies de Candida quanto à atividade amilásica, Tsuyoshi cols¹⁵ não observaram atividade amilásica em Candida glabrata. Rosa cols¹⁰ não observaram atividade de amilase em cinco espécies de Candida avaliadas (Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii).

Nos testes feitos a 42ºC, observou-se que somente os isolados de Candida dubliniensis e dois isolados de Candida krusei não obtiveram resultados positivos. Já em 39ºC, que é uma temperatura de pacientes febris, observou-se que todos os isolados de Candida dubliniensis não apresentaram crescimento, isto significa que pacientes imunodebilitados, com temperatura a 39ºC podem desenvolver candidíase por certas espécies do gênero. Esta sensibilidade de Candida dubliniensis a temperaturas elevadas parece responder em parte pela sua reduzida capacidade invasiva, mesmo em pacientes severamente imunodebilitados.

Somente os isolados de Candida parapsilosis e Candida albicans apresentaram atividade hemolítica neste estudo.

Diferentemente, Luo cols⁷ não observaram capacidade hemolítica em cinco isolados de Candida parapsilosis avaliados, enquanto reportaram atividade hemolítica em outras espécies. Igualmente neste estudo Candida albicans demonstrou ter maior capacidade hemolítica que as demais espécies. Os autores usaram sangue de carneiro, enquanto que neste estudo foi utilizado sangue humano na preparação do meio de cultura. O sangue humano ou o processamento dos cultivos de Candida podem ser fatores que dificultam a manifestação da capacidade hemolítica por espécies que não Candida albicans.

Esta atividade de enzimas hidrolíticas elevada de Candida albicans está de acordo com sua maior virulência em infecções sistêmicas in vivo¹⁰. No entanto, Samaranayake cols¹¹, avaliando a expressão de fosfolipase B em 30 isolados de Candida albicans, usando placas e teste em caldo, de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), não observaram associação significativa da produção desta enzima com outros quatro fatores de virulência avaliados.

Recebido para publicação em 17/03/2008

Aceito em 05/03/2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Maio 2009
• Data do Fascículo
  Abr 2009

Histórico

• Aceito
  05 Mar 2009
• Recebido
  17 Mar 2008