Deleção 22q11.2 em pacientes com defeito cardíaco conotruncal e fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2

Resumos

BACKGROUND: The 22q11.2 deletion syndrome is the most frequent human microdeletion syndrome. The phenotype is highly variable, being characterized by conotruncal heart defect, facial dysmorphisms, velopharyngeal insufficiency, learning difficulties and mental retardation. OBJECTIVE: The objective of this study was to investigate the frequency of deletion 22q11.2 in a Brazilian sample of individuals with isolated conotruncal heart defect and 22q11.2 deletion syndrome phenotype. METHODS: Twenty-nine patients were studied by classical cytogenetics, by fluorescence in situ hybridization (FISH), and by molecular techniques. RESULTS: Cytogenetic analysis by G-banding revealed a normal karyotype in all patients except one who presented a 47,XX,+idic(22)(q11.2) karyotype. Using molecular techniques, a deletion was observed in 25% of the patients, all exhibiting a 22q11.2 deletion syndrome phenotype. In none of the cases the deletion was inherited from the parents. The frequency of 22q11.2 deletion was higher in patients with the clinical spectrum of the 22q11.2 deletion syndrome than in patients with isolated conotruncal heart defect. CONCLUSION: Investigating the presence of the deletion and its correlation with the patients' clinical data can help the patients and their families to have a better genetic counseling and more adequate clinical follow-up.

Chromosome deletion; phenotype; heart defects, congenital; genetic markers

FUNDAMENTO: El síndrome de la deleción 22q11.2 es el más frecuente síndrome de microdeleción humana. El fenotipo, altamente variable, se caracteriza por defecto cardiaco conotruncal, dismorfias faciales, insuficiencia velofaríngea, dificultad de aprendizaje y retardo mental. OBJETIVO: El objetivo de este trabajo fue investigar la frecuencia tanto de la deleción 22q11.2 en una muestra brasileña de individuos portadores de cardiopatía conotrucal aislada, como del fenotipo del síndrome de la delación 22q11.2. MÉTODOS: Se estudiaron a 29 pacientes por medio de citogenética clásica, por hibridación in situ fluorescente (FISH) y también por técnicas moleculares. RESULTADOS: El análisis citogenético por medio de bandeo G reveló cariotipo normal en todos los pacientes, con excepción de uno, que presentó cariotipo 47,XX,+idic(22)(q11.2). Con la utilización de técnicas moleculares, se observó la deleción en el 25% de los pacientes, todos portadores del fenotipo del síndrome de la deleción 22q11.2. En ningún de los casos, la deleción se heredó de los padres. La frecuencia de la deleción 22q11.2 en el grupo de pacientes portadores del espectro clínico de este síndrome resultó mayor que en el grupo de pacientes con cardiopatía conotruncal aislada. CONCLUSIÓN: La investigación de la presencia de deleción y su correlación con los datos clínicos de los pacientes pueden auxiliar los pacientes y sus familias a tener un mejor aconsejamiento genético, así como un seguimiento clínico más adecuado.

Deleción cromosómica; fenotipo; cardiopatías congénitas; marcadores genéticos

ARTIGO ORIGINAL

PATOLOGIAS DA AORTA

Deleção 22q11.2 em pacientes com defeito cardíaco conotruncal e fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2

Sintia Iole Nogueira Belangero; Fernanda T.S. Bellucco; Leslie Domenici Kulikowski; Denise M. Christofolini; Mirlene C. S. P. Cernach; Maria Isabel Melaragno

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTO: A síndrome da deleção 22q11.2 é a mais freqüente síndrome de microdeleção humana. O fenótipo é altamente variável e caracterizado por defeito cardíaco conotruncal, dismorfias faciais, insuficiência velofaríngea, dificuldade de aprendizagem e retardo mental.

OBJETIVO: O objetivo deste trabalho foi investigar a freqüência da deleção 22q11.2 em uma amostra brasileira de indivíduos portadores de cardiopatia conontrucal isolada e do fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2.

MÉTODOS: Vinte e nove pacientes foram estudados por meio de citogenética clássica, por hibridação in situ fluorescente (FISH) e por técnicas moleculares.

RESULTADOS: A análise citogenética por meio de bandamento G revelou cariótipo normal em todos os pacientes, com exceção de um que apresentou cariótipo 47,XX,+idic(22)(q11.2). Com o uso de técnicas moleculares, a deleção foi observada em 25% dos pacientes, todos portadores do fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2. Em nenhum dos casos, a deleção foi herdada dos pais. A freqüência da deleção 22q11.2 foi maior no grupo de pacientes portadores do espectro clínico da síndrome da deleção 22q11.2 do que no grupo de pacientes com cardiopatia conotruncal isolada.

CONCLUSÃO: A investigação da presença da deleção e sua correlação com os dados clínicos dos pacientes podem auxiliar os pacientes e suas famílias a terem um melhor aconselhamento genético e um seguimento clínico mais adequado.

Palavras-chave: Deleção cromossômica, fenótipo, cardiopatias congênitas, marcadores genéticos.

Introdução

As síndromes de DiGeorge (DGS), velocardiofacial (VCFS) e de anomalias faciais e conotruncais (CAFS) durante muitos anos foram consideradas como sendo síndromes distintas. No entanto, por possuírem a mesma etiologia, a deleção da região q11.2 do cromossomo 22, são atualmente classificadas como sendo variações de um mesmo espectro clínico, com sobreposição de fenótipo e expressividade variável, denominado síndrome da deleção 22q11.2¹. Uma das características mais freqüentes dessa síndrome é a presença de malformação cardíaca conotruncal, porém outras alterações podem estar presentes, tais como palato fendido, hipoplasia de timo e de glândula paratireóide, dismorfias faciais, voz nasalada, dificuldade de aprendizagem, doenças psiquiátricas e retardo mental leve².

A freqüência da deleção 22q11.2 é de aproximadamente 1:4000 nascidos vivos³ e está presente em cerca de 90% dos pacientes com o fenótipo da síndrome⁴. A deleção é esporádica em aproximadamente 90% dos casos e herdada de um dos pais em 10% deles⁵. A grande maioria dos pacientes (87%) apresenta uma deleção de 3Mb (megabases)⁴. Não é possível detectar a deleção por meio de citogenética clássica (cariótipo), sendo necessária a utilização de outras técnicas, tais como a de hibridização in situ fluorescente (FISH) e a de marcadores polimórficos de DNA.

A identificação de uma deleção esporádica implica em baixo risco de recorrência (1 a 3%), enquanto que em uma deleção herdada, há um risco de 50% de transmissão da deleção^1,6. Dessa forma, investigações citogenéticas e moleculares nos indivíduos afetados e seus pais são fundamentais para um diagnóstico preciso, bem como para um aconselhamento genético adequado.

O objetivo deste estudo foi avaliar a constituição cromossômica e a freqüência da deleção 22q11.2 em pacientes portadores de cardiopatia conotruncal isolada e em portadores do espectro clínico da síndrome da deleção 22q11.2. Nos casos em que a deleção estava presente, verificamos se era a forma herdada ou não. Além disso, comparamos a eficiência das metodologias de FISH e de marcadores polimórficos de DNA para a detecção da deleção 22q11.2.

Casuística

A amostra consistia de 29 pacientes (Tabela 1). Os critérios clínicos para inclusão foram: (I) malformação cardíaca conotruncal associada a outros aspectos clínicos da síndrome da deleção 22q11.2 (13 pacientes); (II) fenótipo característico da síndrome da deleção 22q11.2, sem cardiopatia (10 pacientes); e (III) malformação cardíaca conotruncal isolada (6 pacientes). A maioria dos pacientes era proveniente do berçário e do Centro de Genética Médica, ambos do Hospital São Paulo; os outros foram provenientes de outros hospitais de São Paulo. Dezessete famílias foram compostas por probando e seus genitores, sete por probando e mãe e cinco, apenas pelo probando.

Os pais dos pacientes, quando disponíveis, também foram estudados pela técnica de marcadores de DNA e, quando a criança apresentava deleção, eles também foram estudados por FISH, com a finalidade de investigar se a deleção era herdada ou não. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo. Todas as famílias dos probandos deram o consentimento informado para participação nesta pesquisa.

Métodos

Análise citogenética

Culturas de linfócitos foram realizadas para a análise de cariótipo⁷. Quinze metáfases foram analisadas por indivíduo. Os cromossomos metafásicos, com resolução de 400-550 bandas cromossômicas, foram classificados conforme o ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) (2005). Técnicas adicionais de bandamento C e de coloração das regiões organizadoras de nucléolo (NOR) foram usadas quando necessário.

Hibridização in situ fluorescente (FISH)

A técnica de FISH foi realizada, a partir da cultura de linfócitos, com sonda comercial que resulta na marcação simultânea da região cromossômica da DGS que inclui o gene TUPLE1 (marcação em vermelho) e da região terminal do cromossomo 22 como controle (marcação em verde) (Cytocell^®- Cambridge) (figura 1). Vinte metáfases e/ou 100 núcleos interfásicos de cada paciente foram analisados. No caso em que havia um cromossomo marcador, foi utilizada a sonda para centrômero dos cromossomos 14/22 (D14Z1/D22Z1 - Vysis^®) e sondas de cosmídeos (c106e4 e c103a2) para região crítica da síndrome cat eye.

Estudo por marcadores polimórficos de DNA

O DNA foi extraído a partir de linfócitos de sangue periférico⁸ e a técnica de PCR⁹ foi realizada utilizando primers para três loci polimórficos localizados na região comumente deletada: D22S941, D22S944N e D22S264^10-12 (Figura 1). Os produtos da PCR foram testados em gel de agarose a 1% para verificar a presença da amplificação e em seguida, os polimorfismos de tamanho foram avaliados em gel de poliacrilamida desnaturante de alta resolução (GeneGel HyRes-Amersham Biosciences^®) corado com nitrato de prata.

Este trabalho foi financiado pela CAPES, FADA e FAPESP.

Resultados

Dentre os 29 pacientes estudados, 13 eram do sexo feminino e 16 do masculino, com idades variando entre um dia e 28 anos (Tabela 1).

A análise do cariótipo foi realizada em 28 dos 29 pacientes (não foi possível coletar sangue periférico de um dos pacientes) e todos apresentaram resultados normais, com exceção de um dos pacientes (S77) que apresentou o cariótipo 47,XX,+mar. Após a realização das técnicas de FISH e de bandamento C e NOR, esse cariótipo foi dado como 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter).

Entre os pacientes com cariótipo normal, a deleção 22q11.2 foi observada em 25% (7/28) dos pacientes estudados. Entretanto, quando analisamos os grupos separadamente, a deleção estava presente em aproximadamente 42% (5/12) dos pacientes com fenótipo da síndrome associado à cardiopatia, em 20% (2/10) dos indivíduos com fenótipo da síndrome, mas sem cardiopatia e em nenhum dos pacientes (0/6) com cardiopatia conotruncal isolada. Verificamos que nenhuma das deleções era herdada.

Considerando os dados dos três marcadores polimórficos de DNA conjuntamente, um resultado informativo quanto à presença da deleção foi obtido em 94% (16/17) das famílias compostas por pacientes e ambos os genitores, em 71% (5/7) das famílias compostas por paciente e mãe e em 25% (1/4) dos casos em que estudamos só o probando. Quando consideramos todos os casos, encontramos resultados informativos dos marcadores em 79% dos casos (22/28).

Discussão

A deleção 22q11.2 não foi detectada pela análise do cariótipo, reforçando a idéia de que essa técnica é pouco eficaz para a investigação da deleção. No entanto, o exame de cariótipo é necessário para a investigação de outras aberrações cromossômicas relacionadas à cardiopatia, como no caso da paciente que apresentou cariótipo 47,XX,+idic(22)(pterq11.2::q11.2pter). A hipótese diagnóstica inicial para essa paciente foi a síndrome da deleção 22q11.2, devido à presença de anomalias fenotípicas e interrupção do arco aórtico tipo B, um defeito cardíaco que está presente em 50% dos casos de deleção 22q11.2¹³. Entretanto, como o cariótipo revelou a presença de um marcador isodicêntrico derivado do cromossomo 22, o diagnóstico final foi a tetrassomia parcial do cromossomo 22 ou síndrome cat eye (CES), uma síndrome malformativa rara, cujo diagnóstico é baseado na presença de um cromossomo marcador extra, derivado do cromossomo 22¹⁴. Nesse caso, a técnica de FISH também se mostrou eficiente para o aprimoramento do diagnóstico citogenético.

A freqüência da deleção 22q11.2 associada à síndrome da deleção 22q11.2 ainda não está bem estabelecida na literatura e pode variar, entre outros fatores, de acordo com a amostra estudada e com a técnica utilizada para a detecção. A análise molecular, incluindo marcadores de DNA e FISH, mostra que a deleção está presente em cerca de 80-90% dos casos da síndrome^2,15,16. Em nosso estudo, a deleção 22q11.2 foi encontrada em 25% da amostra, freqüência menor do que a relatada na literatura.

Um fator que poderia explicar essa baixa freqüência da deleção é a grande variabilidade fenotípica observada nos pacientes desse estudo, uma vez que a amostra compreende desde pacientes com cardiopatia isolada até pacientes com o quadro completo da síndrome. De acordo com a literatura, a freqüência de deleção 22q11.2 entre os pacientes portadores de cardiopatia conotruncal isolada é de cerca de 29%^17,18, bem menor do que a freqüência de deleção entre os pacientes com cardiopatia associada a outros sinais clínicos (80-90%)^2,15,16. Em nossa casuística, nenhum dos seis pacientes com cardiopatia isolada apresentou deleção 22q11.2, um achado que corrobora o fato da deleção ser mais freqüente em pacientes que apresentam, além da cardiopatia, outros sinais fenotípicos associados^17,18.

Todas as deleções foram encontradas em pacientes com o espectro clínico da síndrome, tanto em portadores de cardiopatia, como nos que não apresentavam cardiopatia. Esses dados mostram que pacientes com características fenotípicas faciais da síndrome, mesmo sem as malformações cardíacas, devem ser investigados quanto à presença da deleção.

A idade dos pacientes também pode ter influenciado a freqüência da deleção, uma vez que os pacientes selecionados apresentaram idades bem variadas e o fato de que em crianças muito pequenas o fenótipo nem sempre é tão evidente.

Vários indivíduos (15/22), apesar de serem portadores de sinais clínicos da síndrome, não apresentaram deleção detectável e, apesar de a deleção 22q11.2 ser a etiologia mais provável, outras causas podem ser responsáveis pelo fenótipo. Entre elas estão as mutações nos genes presentes nessa região (22q11.2) e em genes de outras regiões relacionadas à cardiopatias congênitas conotruncais, tais como 8p23.1¹⁹e 10p13²⁰.

Em relação ao uso de marcadores polimórficos de DNA, de acordo com nossos resultados concluímos que o ideal é estudar o probando e os dois genitores, embora o estudo isolado do paciente possa revelar resultados normais quando o indivíduo é heterozigoto, independente do estudo molecular dos pais. Assim, a avaliação molecular pode ser realizada em crianças com o fenótipo da síndrome da deleção 22q11.2 como primeira triagem para se detectar a deleção 22q, antes de se utilizar a FISH. Além disso, na impossibilidade de colher sangue periférico dos pacientes, os ensaios moleculares podem ser realizados com DNA extraído de outros tecidos.

Neste trabalho, utilizamos três marcadores de DNA localizados na região que está deletada em aproximadamente 98% dos pacientes com o fenótipo da síndrome, o que aumenta a taxa de sucesso na investigação da deleção. No entanto, esses marcadores podem não detectar deleções atípicas, ou seja, deleções de segmentos que estejam fora da região tipicamente deletada, que ocorrem a uma freqüência de 2% em pacientes com o fenótipo da síndrome⁴.

A deleção 22q11.2 não estava presente em nenhum dos genitores das crianças com a deleção, caracterizando assim, todas as deleções dos probandos como esporádicas.

Conclusões

Os dados deste estudo sugerem que a deleção 22q11.2 é mais freqüente em pacientes portadores do quadro clínico da síndrome, do que em pacientes portadores de cardiopatia conotruncal isolada. Quanto às metodologias utilizadas para detecção, a técnica de FISH é mais precisa para se detectar deleção do que a técnica de marcadores de DNA. A técnica de FISH possibilita a investigação da presença de alterações cromossômicas nos pais de crianças portadoras da deleção, o que determina o risco reprodutivo do casal. A investigação da presença da deleção e sua correlação com os dados clínicos dos pacientes podem auxiliar o cardiologista a realizar um melhor seguimento aos pacientes.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado por FAPESP, CNPq e CAPES.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Sintia Iole Nogueira pela Universidade Federal de São Paulo.

Artigo recebido em 17/12/07, revisado recebido em 23/01/08; aceito em 10/04/08.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Jun 2009
• Data do Fascículo
  Abr 2009

Histórico

• Aceito
  10 Abr 2008
• Revisado
  23 Jan 2008
• Recebido
  17 Dez 2007