Variabilidade genética de populações naturais de caroá por meio de marcadores RAPD

Genetic variability estimated among caroá populations through RAPD markers

GENÉTICA

Variabilidade genética de populações naturais de caroá por meio de marcadores RAPD

Genetic variability estimated among caroá populations through RAPD markers

Daniela Garcia Silveira^I; Edson Perito Amorim^II; Onildo Nunes de Jesus^III; Fernanda Vidigal Duarte Souza^II; Kátia Nogueira Pestana^IV; Vânia Jesus dos Santos^IV; José Raniere Ferreira de Santana^I

^IUniversidade Estadual de Feira de Santana, Departamento de Ciências Biológicas, Avenida Universitária, s/nº , CEP 44031-460 Feira de Santana, BA. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Caixa Postal 007, CEP 44380-000 Cruz das Almas, BA. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IIIUniversidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Departamento de Genética, Caixa Postal 83, CEP 13400-970 Piracicaba, SP. E-mail: [e-mail]

^IVUniversidade Federal do Recôncavo da Bahia, Departamento de Ciências Agrárias, Caixa Postal 082, CEP 44380-000 Cruz das Almas, BA. E-mail: [e-mail], [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi quantificar a variabilidade genética entre e dentro de populações de caroá (Neoglaziovia variegata), por meio de marcadores "random amplified polymorphic DNA" (RAPD). Foram analisados 180 genótipos de caroá, provenientes dos municípios de Guanambi, Juazeiro e Valente, no Estado da Bahia. Foi observado elevado polimorfismo entre as populações de caroá. As dissimilaridades genéticas entre os genótipos variaram de 0,08 a 0,95, com média de 0,44.Avariância molecular mostrou que 56% da variação total foi explicada pelas diferenças entre indivíduos dentro de locais. As diferenças entre municípios explicaram 17% da variação total, enquanto as diferenças entre locais dentro dos municípios explicaram 26% da variação.

Termos para indexação:Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae, divergência genética, marcadores moleculares.

ABSTRACT

The objective of this work was to quantify the genetic variability within and among populations of caroá (Neoglaziovia variegata) using random amplified polymorphic DNA(RAPD) markers. One hundred eighty caroá genotypes from Guanambi, Juazeiro and Valente counties in the state of Bahia, Brazil, were analyzed. A high polymorphism was observed among the caroá populations. The genetic dissimilarities among all genotypes ranged from 0.08 to 0.95 with an average of 0.44. The molecular variance showed that 56% of the total variation was explained by the differences among individuals with in locations.The differences among counties explained 17% of the total variation, while the differences among places within counties explained 26% of the variation.

Index terms:Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae, genetic divergence, molecular markers.

Introdução

Neoglaziovia variegata (Arr. Cam.) Mez, conhecida vulgarmente como caroá, é uma bromeliácea endêmica da Caatinga, distribuída por todo o Semiárido do Nordeste brasileiro (Ribeiro, 2007). Essa espécie já teve papel importante na economia nordestina, na primeira metade do século passado, pela produção de fibra por indústrias têxteis, porém sua exploração foi abandonada como surgimento das fibras sintéticas (Ribeiro, 2007). Atualmente, as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de emprego e renda para diversas famílias nordestinas, com a fabricação artesanal de chapéus, bolsas, entre outros produtos.

O uso dessa planta em larga escala, de forma extrativista, desde o século passado, e a devastação da Caatinga para desenvolvimento de atividades agropecuárias reduziram de forma drástica a população de plantas de caroá. Há, portanto, necessidade urgente de estudos para elaborar estratégias de conservação genética desta espécie. Atualmente, o conhecimento da estrutura genética de populações naturais de plantas é uma etapa fundamental para a realização de programas conservacionistas, nos quais os dados gerados podem ser utilizados para definir unidades de conservação e prioridades para o manejo de recursos genéticos (Mamuris et al.,2001), além de ser fundamental para o estabelecimento de formas de exploração econômica e racional (Lacerda et al., 2001). Os rápidos avanços na área da biologia molecular têm fornecido uma série de novos métodos para estudos genéticos de populações naturais. Contudo, até o momento, nenhuma pesquisa foi publicada sobre o uso de marcadores moleculares para estimar a diversidade genética em caroá. Assim, a caracterização da variabilidade entre e dentro das populações naturais dessa espécie podem trazer subsídios para a implantação de estratégias de conservação e de programas de melhoramento genético.

Entre os marcadores moleculares, a técnica de RAPD ("random amplified polymorphic DNA"), desenvolvida por Williams et al. (1990), mostra-se como uma ferramenta útil para a análise da diversidade genética molecular em populações naturais de plantas.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade intra e interpopulacional de caroá, por meio de marcadores RAPD, para subsidiar futuras atividades de coleta, caracterização, conservação e uso dessa espécie.

Material e Métodos

Foram coletadas três populações de caroá, nos municípios de Guanambi, Juazeiro e Valente, no Estado da Bahia. Cada população foi representada por 60 indivíduos. Em cada município, foi realizada a coleta dos genótipos em três locais distintos, com 20 amostras cada (Tabela 1). A distância entre esses locais variou entre 1 e 20 km, e a distância entre as plantas coletadas, entre 1 e 5 m. Não foram coletadas plantas da mesma touceira.

O DNA genômico dos 180 genótipos foi extraído de folhas jovens, pelo método CTAB ("cetyltrimethyl ammonium bromide") (Doyle & Doyle, 1990). A avaliação da quantidade e qualidade do DNA foi realizada mediante análise comparativa das amostras em géis de agarose 0,8%, corados com brometo de etídio, que foram diluídas em TE (10 mM Tris-HCL e 1 mM EDTA pH 8) e padronizadas em 10 ng µL^-1.

Uma pré-seleção de 48 iniciadores foi realizada em seis genótipos, e os mais polimórficos foram aplicadosnapopulação.Asreaçõesdeamplificação foram completadas para o volume final de 16 µL, com KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl₂ 3 mM,100 µM de cada um dos dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 0,4 µM de cada iniciador, 15 ng de DNA e uma unidade de Taq DNA polimerase.

As reações foram realizadas em termociclador Perkin Elmer modelo 9700, de acordo com a seguinte programação: 3 min a 94ºC, 40 ciclos a 94ºC por 30 s, 35ºC por 30 se 72ºC por 1 min, inclusive uma extensão final de 3 min a 72ºC.

Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese horizontal a 100 V, por 2 horas, com gel de agarose a 1,5%, e corados com brometo de etídio. Os fragmentos amplificados foram avaliados como ausência (0) e presença (1). A dissimilaridade genética entre os 180 genótipos foi calculada a partir do coeficiente de Jaccard (1908).

As dissimilaridades genéticas foram utilizadas para a análise de agrupamento dos genótipos pelo método UPGMA ("unweighted pair group method with arithmetic averages"), por meio do programa NTSYS-pc (Rohlf, 2000). O dendrograma foi gerado combasenamatrizdedistânciasnoprogramaMEGA4 (Tamura et al., 2007). O método de reamostragens ("bootstrap") foi realizado para verificar se o número de marcadores foi suficiente para determinar com precisão as estimativas de dissimilaridade genética entre os genótipos, pelo programa GQMol (Cruz & Shuster, 2004).

A segunda análise foi realizada no programa Structure 2.2 (Pritchard et al.,2000), que se fundamenta no modelo bayesiano e gera uma distribuição posterior com base na cadeia de Markov que identifica a presença de estrutura na população, bem como a proporção do genoma de cada acesso advindo de outros grupos. Para essa análise, foi considerado o modelo de informação a priori da população, para a definição dos grupos e frequências alélicas independentes. Considerou-se, em todas as análises efetuadas, um número fixo de 100 mil iterações MCMC ("Monte Carlo Markov Chain")com descarte ("burn-in") das 10 mil primeiras interações.

Os componentes de variância, atribuídos às diferenças entre as três populações (municípios), entre locais dentro de municípios e entre indivíduos dentro de locais, foram estimados pelo programa Arlequin v.3.0 (Excoffier et al., 1992). As significâncias dos componentes de variâncias foram obtidas por meio de 10 mil permutações.

Resultados e Discussão

Os 36 iniciadores selecionados (Tabela 2) geraram 501 produtos de amplificação, dos quais 93% polimórficos, com média de 13 bandas por iniciador. O iniciador OPD-09 amplificou o maior número de bandas (19), enquanto o menor número ocorreu no iniciador OPD-10 (5 bandas).

Na análise de reamostragens, 315 bandas foram suficientes, para uma estimativa precisa da variabilidade genética entre os 180 genótipos de caroá. A correlação entre a matriz com todas as 467 bandas e a matriz com 315 bandas foi de 0,95, com valor de estresse (E) de 0,047 (Figura 1). De acordo com Kruskal (1964), um valor de E<0,05 é indicativo de excelente precisão nas estimativas.

Em trabalhos realizados com outras espécies da família do caroá (Bromeliaceae), verificou-se, também, que existe grande variação em relação ao número de bandas polimórficas geradas pela amplificação de iniciadores RAPD, que resulta em altas taxas de polimorfismo. Costa et al. (2002) caracterizaram geneticamente o curauá (Ananas erectifolius) - bromeliácea produtora de fibra utilizada na indústria automobilística - por meio de sete iniciadores RAPD, que geraram 104 bandas, das quais 76% foram polimórficas. Pereira & Kerr (2001) analisaram 12 genótipos de abacaxizeiro, por meio de 11 iniciadores RAPD, e obtiveram 79 bandas polimórficas. Cavallari et al. (2006), ao avaliar populações naturais de três espéciesdogênero Encholirium, bromélias ameaçadas de extinção e endêmicas do Brasil, obtiveram aproximadamente 60 bandas polimórficas geradas por cinco iniciadores RAPD, o que representa 90% do total de bandas. Gottardi et al. (2001) criaram genótipos de plantas matrizes do abacaxi cv. Smooth Cayene, com 43 iniciadores RAPD que amplificaram 777 bandas, das quais 99% foram polimórficas.

O elevado polimorfismo detectado nas populações de caroá, analisadas neste trabalho, pode ser resultado da ação e das interações de mecanismos evolutivos e ecológicos, entre eles a seleção natural e o fluxo gênico. Essa espécie ainda é pouco estudada. Ela se propaga principalmente por via assexuada, pelo desenvolvimento de gemas e rizomas laterais, com formação de densos agrupamentos, e possui um sistema sexual hermafrodita (Machado & Lopes, 2004). A floração ocorre nos meses de outubro a dezembro, e a polinização é feita preferencialmente por pássaros (Leal et al., 2006). Em cada planta, abrem-se de duas a três flores por dia, com duração de 12 horas (Leal et al.,2006). A inflorescência do caroá é simples, com escapo ereto e flores protegidas por brácteas com coloração viva, com três sépalas e três pétalas, e frutos em bagas suculentas (Smith & Downs, 1979). Com base nessas informações e no elevado polimorfismo, é possível inferir que essa espécie apresenta sistema reprodutivo preferencialmente alógamo. Assim, seu germoplasma deve ter sofrido baixa pressão de seleção, o que pode garantir ganhos genéticos significativos com a seleção (Oliveira et al.,2007).

As dissimilaridades genéticas, entre os 180 genótipos de caroá, variaram de 0,08 a 0,95, com média de 0,44 (Tabela 3). Os menores valores de dissimilaridade foram registrados entre os genótipos coletados no Município de Juazeiro (0,12). A maior dissimilaridade genética foi observada entre genótipos coletados nos municípios de Guanambi (0,52) e Valente (0,60). O local 2 do município de Juazeiro foi o que apresentou a maior variabilidade genética, entre todos os seis locais de coleta (0,16 a 0,90), com média de 0,41. Para os municípios de Guanambi e Valente, maior variabilidade genética foi observada nos locais 2 e 1, respectivamente. Essas diferenças podem estar associadas a mutações ocorridas no germoplasma nos locais de coleta, à reprodução sexual ocasional, o que gera novos genótipos que são mantidos e propagados vegetativamente, e ao efeito do ambiente, em especial, diferenças nafertilidade do soloe no clima.

Por meio do dendrograma das dissimilaridades genéticas, com base em marcadores RAPD (Figura 2), é possível observar a formação de grupos conforme os municípios de coleta do germoplasma, com exceção de 18 genótipos que formaram agrupamentos fora dos municípios onde foram coletados.

No Município de Valente, foi observada a formação de agrupamentos conforme os locais de coleta, o que permite inferir que os genótipos coletados nesses locais apresentam diferenças genéticas. Comportamento semelhante foi observado nos municípios de Juazeiro e Guanambi, porém alguns genótipos formaram agrupamentos fora do seu local de coleta (Figura 2). Pelos resultados, os marcadores RAPD utilizados neste trabalho foram eficientes em separar os genótipos de caroá, de acordo com os municípios e locais de coleta.

A utilização do modelo, com base em distância e em estatística bayesiana, por meio do programa Structure, permitiu identificar os mesmos grupos, além de permitir a identificação de relações de parentescos entre os indivíduos avaliados. Dos 180 indivíduos avaliados, 63 possuem ancestral em outras populações. No município de Guanambi, nove genótipos apresentaram parte do seu genoma semelhante ao observado em Juazeiro, com variação de aproximadamente 5 a 100% (Figura 3). Isso justifica o agrupamento dos indivíduos 3, 4, 13, 29, 41, 42, 47, 54 e 57 com a população de Juazeiro.

Em relação ao Município de Juazeiro, foram identificados 23 genótipos com fração do genoma da população de Valente, e 26 genótipos com genoma da população de Guanambi (Figura 3). A população de Juazeiro é essencialmente formada de uma misturadas populações de Guanambi e Valente, o que confirma a maior variabilidade genética identificada nesse Município (Figura 2).

No Município de Valente, foram identificados cinco genótipos com fração do genoma da população de Juazeiro (Figura 3).

Apesar de ser propagado principalmente por via vegetativa, com hábito clonal e formação de densos agrupamentos e morfologia uniforme, o caroá apresentou um número elevado de diferentes genótipos, o que contrasta com a participação aparentemente reduzida da reprodução sexuada na formação das populações. Resultados similares foram constatados por Cavallari et al. (2006), que obtiveram elevada variabilidade genética em três espécies de Encholirium, uma bromeliácea endêmica dos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço. Contudo, em uma das espécies, os autores observaram uma floração regular durante todo o ano, o que facilita o fluxo gênico entre as populações. Nas outras espécies, a floração ocorreu de forma irregular, com poucos indivíduos em antese ao mesmo tempo, o que teria contribuído para limitar o fluxo gênico.

As inflorescências do caroá são difíceis de serem observadas, por causa de sua utilização como alimento de animais e pássaros (Xavier,1982). O surgimento das flores só ocorre em um período do ano e com a abertura de duas a três flores por dia, em cada inflorescência, o que pode dificultar a propagação sexual da espécie.

A baixa dissimilaridade genética, observada entre a maioria dos genótipos da população de Valente, deve ter ocorrido como resultado de cruzamentos entre indivíduos aparentados, ou mesmo da autofecundação (Souza, 2002). Também, populações dessa localidade passam por exploração extrativista, e muitos animais, principalmente caprinos, alimentam-se das bagas verdes e maduras, o que reduz a possibilidade da ampliação da variabilidade genética na região. Chung et al. (1999), ao trabalhar com uma espécie da família Anacardiacea, afirmaram que a dispersão de sementes e pólen é determinante para a estrutura genética espacial dentro de populações, fato que pode justificar a separação entre as populações de caroá, obtida por meio de marcadores RAPD.

A análise molecular da variância (AMOVA) mostrou que 56,47% da variação total foi explicada pela variação entre indivíduos dentro de locais. A variação entre municípios foi de 17,41% do total, enquanto entre locais dentro de municípios foi de 26,12% do total (Tabela 4). Pela grande distância existente entre os municípios, pode-se dizer que houve um fluxo gênico moderado, provavelmente em razão do fluxo entre várias populações intermediárias, que não foram amostradas, uma vez que os municípios da Caatinga baiana são centros de origem do caroá. Cavallari et al. (2006) observaram resultados semelhantes em populações de Encholirium subsecundum (Bromeliaceae), coletadas em localidades distanciadas de 117 km.

Esses resultados podem servir como subsídio para nova coleta e caracterização do germoplasma de caroá, a fim de confirmar se a variabilidade observada com marcadores moleculares reflete na qualidade da fibra.

Conclusão

Existe variabilidade genética entre e dentro das populações de caroá, que pode ser explorada para a conservação e exploração comercial da espécie.

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão de bolsa; ao Banco do Nordeste e a Cooperativa Regional de Artesãs Fibras do Sertão, pelo apoio financeiro; a José Lemos, Francisco Pinheiro Neto e Maria Selma Diamantino, pelo auxílio nas coletas.

Recebido em 25 de setembro de 2008 e aprovado em 27 de fevereiro de 2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Maio 2009
• Data do Fascículo
  Mar 2009

Histórico

• Recebido
  25 Set 2008
• Aceito
  27 Fev 2009