Diversidade de policetídeos produzidos por espécies de Penicillium isoladas de Melia azedarach e murraya paniculata

Diversity of polyketides produced by Penicillium species isolated from Melia azedarach and Murraya paniculata

polyketide; endophytic fungus; Penicillium

ARTIGO

Diversidade de policetídeos produzidos por espécies de Penicillium isoladas de Melia azedarach e murraya paniculata

Diversity of polyketides produced by Penicillium species isolated from Melia azedarach and Murraya paniculata

Renata Pastre^I; Andrey M. R. Marinho^I; Edson Rodrigues-Filho^I,*; Antônia Q. L. Souza^II; José Odair Pereira^II

^IDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13565-905 São Carlos - SP, Brasil

^IIDepartamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13565-905 São Carlos - SP, Brasil

ABSTRACT

Eight compounds comprising four groups of polyketides, the xanthone fusarindin, the mixed peptide alkaloid-polyketide GKK1032, the anthraquinones crisophanol, citreoveridin and janthinone, and the azaphylones dihydrocitrinone, citrinin and citrinin H-1, were identified in Penicillium species isolated as endophytic fungi from Melia azedarach and Murraya paniculata. The antibacterial activity of the azaphylones was tested and showed that citrinin H-1 is more active than citrinin.

Keywords: polyketide, endophytic fungus; Penicillium.

INTRODUÇÃO

Os policetídeos de origem fúngica constituem uma grande classe de metabólitos secundários, apresentando uma das maiores diversidades estruturais entre os produtos naturais¹. A maioria desses compostos é ativa em diversos sistemas biológicos². Portanto, a busca de policetídeos em microorganismos vem sendo apontada como uma boa estratégia para pesquisas de substâncias bioativas.

Os policetídeos são biossintetisados por um conjunto de enzimas usualmente denominadas de "policetídeo sintases" (ou PKS, "Polyketide Synthase"). Segundo Hertweck², as enzimas, cetosintase (KS), aciltransferase (AT), proteína carregadora de grupo ácido (ACP), cetoredutase (KR) e deidratase (DH) devem fazer parte do conjunto PKS. A ação dessas enzimas em conjunto ou uma expressão diferenciada de alguma delas deve resultar em diferentes classes de policetídeos. Dada a grande importância dos policetídeos, esforços vêm sendo feitos para se conseguir a expressão controlada dos genes que codificam as enzimas PKS². Na natureza, a expressão dos genes PKS é dependente de uma série de fatores ainda pouco conhecidos. Conforme a atuação do conjunto das enzimas PKS durante a biossíntese, os policetídeos podem ser compostos aromáticos poliidroxilados (como a maioria dos pigmentos fúngicos), compostos alifáticos pouco oxigenados (ou policetídeos parcialmente reduzidos, como a lovastatina) e alifáticos altamente reduzidos (e.g. ácidos graxos)^3,4. O entendimento de como esses fatores de expressão gênica atuam é um grande desafio. A busca por policetídeos em cepas fúngicas selvagens pode auxiliar nesses estudos, além de apontar novas fontes para compostos de reconhecida importância pelas atividades biológicas.

Em trabalhos anteriores relacionados ao estudo do metabolismo secundário de microorganismos endofíticos isolados de Melia azedarach, foram isolados vários policetídeos bioativos do fungo Penicillium janthinellum⁵. Um desses compostos, a citrinina, mostrou importante atividade inibitória de crescimento de Leishmania mexicana, e outros compostos mostraram significativos efeitos inibidores do crescimento de bactérias. Na busca por uma maior diversidade estrutural desses compostos em fungos, está sendo relatada agora a identificação dos policetídeos emodina (1), citreoroseina (2), janthinona (3), diidrocitrinona (4) e citrinina H-1 (6) produzidos por P. herquei, isolados de M. azedarach, citrinina (5), e fusarindina (7), e GKK1032 (8), produzidos por dois isolados de Penicillium encontrados em Murraya paniculata. Uma comparação do efeito antibiótico entre citrinina (5) e citrinina H-1 (6), mostrou que a última é um forte bactericida para Escherichia coli.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os dados de espectros de RMN de ¹H e ¹³C (1D e 2D) foram obtidos em um espectrômetro Bruker DRX400 operando a 400 MHz para o núcleo de ¹H e em 100 MHz para o núcleo de ¹³C; Acetona-d₆ ou CDCl₃ foram usados como solvente e TMS como referência interna. Os espectros de massas foram obtidos usando um espectrômetro de massas de baixa resolução da Waters - Modelo QuattroLC, com ionização por electrospray. As separações cromatográficas por CLAE em escala analítica foram realizadas em equipamento Shimadzu (bombas LC10Ad) conectado a um detector de arranjos de diodos (Sil10Ad), utilizando coluna analítica Phenomenex Sinergy (250 x 4,60 mm; 5 mm). Nas separações cromatográficas em escala preparativa foram usadas colunas abertas sob pressão atmosférica empacotadas com sílica gel (45 – 60 mm) e Sephadex LH-20 (Merck). Os espectros de absorção no UV foram obtidos em solução (CH₂Cl₂) usando um aparelho da Hewllet Packard (modelo 8452-A); os espectros de absorção no infravermelho foram obtidos em um aparelho Bomen modelo MB-102 em pastilhas de KBr.

Material vegetal e cepas fúngicas

O fungo P. herquei, isolado de Melia azedarach, bem como as duas cepas de Penicillium [Penicillium sp(a) e Penicillium sp(b)] isoladas de Murraya paniculata, foram obtidas da coleção do Laboratório de Bioquímica Micromolecular de Microorganismos (LaBioMMi) do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). As plantas Melia azedarach e Murraya paniculata foram coletadas no campus da UFSCar. As amostras (folhas, caule e frutos) foram submetidas aos procedimentos de isolamento dos microorganismos endofíticos imediatamente após a coleta. Santos⁶ e Souza⁷ descreveram detalhadamente os procedimentos experimentais envolvidos na obtenção e identificação dos fungos.

Cultivo dos microrganismos e isolamento dos policetídeos

45 frascos de erlenmeyer (500 mL), contendo 90 g de arroz (Uncle's beens) e 75 mL de água destilada por frasco, foram autoclavados duas vezes consecutivas a 121 ºC por 40 min. Pequenos discos de meio BDA em placa de Petri contendo micélios dos Penicillium foram transferidos sob condições estéreis para 42 frascos de erlenmeyer contendo milho esterilizado. Três frascos foram mantidos como controle. Depois de 20 dias de crescimento a 25 ºC, metanol (200 mL) foi adicionado a cada frasco e deixado sob repouso por 5 h e, então, filtrados sob gravidade. O metanol foi evaporado sob pressão reduzida, produzindo um resíduo amarelo (17,5 g). Parte desse resíduo (8,0 g), foi submetido à separação cromatográfica em coluna empacotada com sílica gel e eluída de forma gradiente com n-hexano, acetato de etila e metanol. As frações de polaridade média foram recromatografadas em colunas de sílica [n-hexano:acetato de etila:metanol (60:35:05), isocrático) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) [cloro-fórmio:metanol (96:04)]. Dessas frações foram isolados os policetídeos emodina (1) (32,1 mg), citreoroseina (2) (2,8 mg), janthinona (3) (5,3 mg), diidrocitrinona (4) (9,3 mg) e citrinina H-1 (6) (23,2 mg) produzidos P. herquei, e fusarindina (7) (2,2 mg), citrinina (5) (93,2 mg) e GKK1032 (8) (19,3 mg) produzidos por Penicillium sp, encontrado em M. paniculata.

Análises por CLAE

Alíquotas dos extratos brutos obtidos conforme descrito foram submetidos à extração ácido/base para análise de policetídeos ácidos. A uma suspensão contendo cerca de 100 mg de cada extrato foram adicionados 2,0 mL de solução aquosa de hidróxido de sódio 1,0 mol L^-1. Essa solução alcalina foi lavada com 2,0 mL de clorofórmio. A fase aquosa alcalina foi separada, acidificada com ácido clorídrico 1,0 mol L^-1 e extraída com 1,0 mL de acetato de etila. A solução acetoetílica, a qual apresentou coloração amarelo-aver-melhada, foi evaporada, redissolvida em metanol/acetonitrila (1:1) e analisada por CLAE. O solvente acetonitrila, utilizado nas análises por CLAE, foi filtrado em membrana de nylon (0,45 µm), enquanto a água utilizada foi purificada em um aparelho Millipore Milli-Q; ambos foram posteriormente imersos em banho em ultra-som por 30 min. Fui utilizada eluição gradiente de acetonitrila (B) e água (A), em 50 min, iniciando a 40% do solvente B até 100%, aguardando-se um tempo de 20 min entre cada injeção para a estabilização da coluna. Todas as análises foram feitas utilizando-se um fluxo de 1,0 mL min^-1, injeção de 50 µL de amostra.

Ensaios de inibição de bactérias

As suscetibilidades de microorganismos aos policetídeos foram determinadas pelo método de diluições sucessivas em caldo, conforme recomendado pelo "Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing" do "US National Committee for Clinical Laboratory Standards" (NCCLS)⁸. O bioensaio foi realizado em placas de 96 poços com 100 µL de caldo Mueller Hinton (MHB), 100 µL de solução de composto teste e 5 µL de suspensão da bactéria teste a 1.0 x 10⁷ UFC mL^-1, seguido por incubação a 37 ºC (24 h). As substâncias teste obtidas das culturas dos fungos foram dissolvidas em dimetilsulfóxido a uma concentração inicial de 500 µg mL^-1. Os microorganismos testados foram Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis (obtidos da Universidade Estadual de Maringá - PR, Brasil). A bioatividade foi registrada como ausência de coloração nos poços depois da adição de 10 µL de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (2,0%). Os microorganismos testados foram subcultivados em meio MHB. As atividades dos compostos testados foram classificadas como bacteriostática ou bactericida, de acordo com o comportamento do microorganismo na subcultura. Penicilina, vancomicina e tetraciclina (25 µg mL^-1 cada um) foram usados como controle positivos; o cultivo em meio MHB, sem aditivos, foi usado como controle negativo.

Diidrocitrinona (4), sólido amarelo amorfo, RMN ¹H (400 MHz, Acetona-d₆): d1,25 (d, J 7,2 Hz, H-10), 1,33 (d, J 6,7 Hz, H-9), 2,06 (s, CH₃-11), 3,04 (q, J 7,1 Hz, H-4), 4,73 (q, J 6,6 Hz, H-3), ESIMS (Full scan): m/z 265 ([M-H]^-, 100%).

Citrinina H-1 (6), sólido vermelho, UV l_max/nm (EtOH): 271, 322 e 423; IV n_max/cm^-1: 3404, 2971, 2928, 1716, 1653, 1638, 1595, 1259, 1186, 1133 and 1112 (KBr), RMN ¹H (400 MHz) e ¹³C (100 MHz) em Acetona-d₆: Tabela 1, APCI-MS/MS (15 eV): m/z 425 ([M-H]^-, 28%), 381 (18), 335 (100); (APCI-MS/MS (20 eV): m/z 335 (100%), 320 (77), 305 (42), 253 (15).

Fusarindina (7), sólido alaranjado, RMN ¹H (400 MHz, Acetona-d₆): d 2,77 (s, CH₃-10), 6,45 (d, J 2,0 Hz, H-5), 6,70 (d, J 2,6 Hz, H-4), 6,79 (d, J 2,6 Hz, H-2), 7,35 (d, J 2,0 Hz, H-7); ESIMS (Full scan): m/z 257 ([M-H]^-, 100%).

GKK1032 (8), sólido branco amorfo; UV l_max/nm (EtOH): 204, 229, 269; IV n_max/cm^-1: 3404, 2971, 2928, 1716, 1653, 1638, 1595, 1259, 1186, 1133 and 1112 (KBr); RMN ¹H (400 MHz) e ¹³C (100 MHz) em CDCl₃: Tabela 1; ESI-MS/MS (30 eV): m/z 500 ([M-H]^-, 65%), 394(100), 323 (28).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste trabalho, relatamos estudos químicos de cepas fúngicas isoladas de folhas de Murraya paniculata e Melia azedarach. As cepas isoladas de M. paniculata apresentaram caracteres morfológicos visivelmente distintos e, embora não se tenha uma conclusão definitiva da identificação das espécies, são espécies diferentes. Nenhuma das duas plantas é muito boa produtora de policetídeos. Os constituintes principais descritos para M. azedarach são terpenoídicos⁹, com destaque para os limonóides, os quais são importantes inseticidas naturais. Por sua vez, Murraya paniculata, espécie introduzida no Brasil para ornamentação de vias públicas, é boa produtora de flavonóides e cumarinas⁹.

Em outros trabalhos, foi constatado que microorganismos isolados de M. azedarach produzem policetídeos quando cultivados em milho e arroz como substratos⁵. Assim, as espécies de Penicillium escolhidas para este estudo foram cultivadas em arroz autoclavado. Após uma extração dirigida para a obtenção dos compostos ácidos e fenólicos (extração ácido/base) e análise comparativa dos extratos, usando CLAE, foi observado que os fungos produzem uma série de policetídeos. Dois cromatogramas típicos são mostrados na Figura 1. Uma amostra padrão de fusarindina (7) produz um pico intenso, cujo espectro de absorção no UV apresenta máximos de absorção a 235, 250, 288, 298 e 345 nm. Uma substância com idêntico comportamento cromatográfico é detectada também em um dos extratos. Por sua vez, citrinina (5), cujos máximos de absorção ocorrem em 245, 280 e 330 nm, é prontamente identificada no extrato. Usando essa estratégia, vários compostos puderam ser rapidamente identificados nos extratos fúngicos.

Os extratos brutos obtidos foram submetidos a procedimentos cromatográficos de separação usando uma combinação de cromato-grafia em coluna e em camada delgada. Por esses procedimentos, os compostos 1 - 8 foram isolados e identificados usando outros dados físicos como IV, EM e RMN. Uma descrição da identificação dos compostos 1 - 3 e 5 foi feita em um trabalho prévio⁵.

A substância 4 apresenta um espectro de RMN ¹H muito parecido com o obtido para citrinina (5). Os dois dubletos para hidrogênios metílicos a d 1,25 (J = 7,2 Hz) e 1,33 (J = 6,7 Hz), juntamente com o singleto a d 2,06, e os dois quadupletos em d 3.04 (J = 7.2 Hz) e 4,73 (J = 6.7 Hz) são as principais características vistas no espectro. No entanto, o sinal a c.a. d 8,25 referente a H-1 da citrinina (5) não está presente neste espectro. Com auxílio dos dados de espectrometria de massas obtidos por ESI-MS/MS no modo negativo ([M-H]^- a m/z 265), e comparação com os dados relatados na literatura, concluiu-se que esse policetídeo é a diidrocitrinona (4)^10,11.

A metilxantona 7, foi detectada por CLAE nos extratos obtidos de uma cepa de Penicillium (spA) isolada de M. paniculata. A presença de quatro sinais para hidrogênios aromáticos formando dois sistemas de spins, os dois em posições relativas meta em dois anéis aromáticos diferentes [d 7,35 e 6,79 (J = 2,6 Hz; d 6,70 e 6,45 (J = 2,0 Hz)], bem como o sinal dos hidrogênios metílicos benzílicos a d 2,77 (s), indicaram rapidamente a presença de um núcleo xantônico. Essa substância tem uma massa molecular de 258 Da, conforme determinado por espectrometria de massas ([M-H]^- a m/z 257). Um busca na literatura revelou que essa xantona foi isolada de Penicillium patulum¹² e seus dados de RMN ¹³C são idênticos aos descritos por Sundholm¹³.

Uma substância apresentando espectro de absorção parecido com aquele observado para citrinina (5) (Figura 1), mas com um tempo de retenção bem maior quando analisada por CLAE, foi isolada dos extratos de Penicillium herquei. Sua massa molecular (426 Da), determinada após a interpretação do espectro de massas por electrospray ([M-H]^- a m/z 425), com auxílio dos dados de RMN (onde foram contados os números de núcleos de carbono e hidrogênio presentes na molécula), permitiu supor C₂₄H₂₆O₇ como uma possível fórmula molecular para 6. Uma busca no Chemical Abstracts revelou a citrinina H-1 como provável estrutura para esse policetídeo. Uma análise comparativa dos dados de RMN de ¹H e ¹³C (Tabela 1) com aqueles registrados na literatura¹⁴ ratificou essa proposta estrutural. Os sinais referentes aos hidrogênios metílicos em d 1,23 (H-9, d, J = 6,3 Hz com H-3 a d 4,00), 1,30 (H-10, d, J = 7,2 Hz com H-4 a d 2,94), 1,31 (H-8', d, J = 6,9 com H-7' a d 3,19) e 1,37 (H-10', d, J = 6,2 Hz com H-9' a d 5,45), quando comparados com os relatados na literatura, bem como a correlação observada no espectro de gHMBC entre o hidrogênio a d 7,94 (s, H-12') e o carbono a d 73,2 (C-9'), estabelecendo a posição do grupo formiato no policetídeo, foram determinantes para identificação do policetídeo como citrinina H-1. A citrinina H-1 é relatada na literatura como um produto de dimerização da citrinina (5) quando ela é aquecida em metanol acima de 100 ºC^14-16. No entanto, no presente trabalho, os extratos foram obtidos por evaporação do solvente sob pressão reduzida a 45 ºC. Se a substância 6 é um artefato oriundo de 5, o processo de dimerização deve ter sido outro diferente daquele observado por Hirota¹⁵.

A substância 8 foi detectada nas análises por CLAE, porém mostrou um espectro de absorção no UV bastante diferenciado dos demais policetídeos, apresentando máximos de absorção em comprimentos de onda curtos (269 nm). Seu espectro de RMN ¹³C apresentou trinta e dois sinais sendo dez deles típicos de carbonos hibridizados na forma sp², envolvidos em duplas ligações carbono-carbono, e três carbonílicos. No espectro de RMN ¹H, com o auxílio do mapa de contornos obtidos via gHSQC, contam-se claramente, através da integração dos sinais, trinta e oito núcleos de hidrogênio. Um hidrogênio adicional, ligado a heteroátomo, conforme observado pela absorção na região do infravermelho a 3404 cm^-1, foi considerado na fórmula molecular. A análise cuidadosa desses dados, avaliando os deslocamentos químicos dos núcleos de ¹³C no espectro de RMN, juntamente com a interpretação do espectro de massas obtido por electrospray no modo negativo ([M-H]^- a m/z 500) permitiu sugerir a fórmula molecular C₃₂H₃₉NO₄ (501 Da) para essa substância. Uma busca no Chemical Abstracts para substâncias com essa fórmula retornou inúmeras sugestões estruturais, entre as quais a estrutura 8 que foi a que se mostrou compatível com os dados físicos obtidos, principalmente os dados de RMN (Tabela 1). Essa substância foi isolada de uma espécie de Penicillium, de origem não informada, e foi denominada GKK1032¹⁷. Sua origem biossintética foi elucidada recentemente¹⁸, revelando que GKK1032 é formada a partir do aminoácido tirosina, condensada com uma cadeia policetídica e alquilada com metionina. A unidade oriunda da tirosina é incorporada formando um sistema aromático para-dissubstituído. No entanto, os dados de RMN (Tabela 1) mostram que esse sistema é atípico em GKK1032. Em geral, hidrogênios em uma estrutura parcial deste tipo formam um sistema de spins do tipo aa'bb'. No entanto, neste policetídeo os hidrogênios são observados formando dois sistemas AX, com os quatro sinais bastante visíveis no espectro de RMN ¹H, assim como os seis átomos de carbono do anel aromático são detectados em sinais individuais no espectro de RMN ¹³C (Tabela 1). Isso é justificado pelo fato de que o anel aromático faz parte de um ciclo de nove membros, com rotação restrita em torno das ligações benzílicas. Os demais sinais de RMN descritos na Tabela 1 para 8 estão de acordo com o relatado para GKK1032.

Os policetídeos 1 - 8 são todos biologicamente ativos. Entre outras atividades, os compostos 1, 2, 3, 4, 6 e 7 são antibióticos. Citrinina (5) é uma micotoxina bastante tóxica aos seres humanos e é considerada um dos grandes contaminantes de origem biológica em alimentos, principalmente em cereais¹⁹. Embora essa substância tenha boas propriedades antibióticas, uma série de estudos vem sendo feita visando a diminuição da sua toxicidade. Citrinina H-1 (6) é considerada um produto menos tóxico da citrinina (5)¹⁵. No entanto, sua ação antibiótica ainda não foi avaliada. No presente estudo, as substâncias 5 e 6 foram testadas frente a três bactérias (Eschericha coli, Pseudomonas auraginosa e Bacilos subtillus). Conforme mostra a Tabela 2, para E. coli a citrinina H-1 (6) é bactericida até a concentração de 15,63 µg L^-1. Para as outras bactérias, sua atividade é comparável àquela apresentada pela citrinina (5).

O policetídeo 8 é um dos compostos conhecidos por apresentar atividade biológica mista antibiótica-anticâncer¹⁸. Embora o processo de obtenção esteja patenteado, sua síntese in vitro vem sendo tentada²⁰ devido ao baixo rendimento na produção pela cepa de Penicillium usada. Por isso, novas fontes dessa substância devem ser investigadas.

CONCLUSÕES

As análises cromatográficas e o isolamento e identificação dos compostos produzidos pelas cepas de Penicillium estudadas mostraram que esses fungos produzem uma grande diversidade de police-tídeos. Os compostos 1, 2 e 3 são antraquinonas, embora 3 seja diferenciado por uma lactonização; os compostos 4 - 6 são azafilonas e o composto 7 é uma xantona. Os compostos 1 - 7 são policetídeos que não sofreram a ação de enzimas redutoras. Já a produção de 8 foi acompanhada da expressão da enzima cetoredutase (KR).

A produção desses policetídeos aparentemente não é discriminada pela origem da cepa, uma vez que os policetídeos antra-quinônicos e as azafilonas são produzidos pelas três cepas de Penicillium estudadas. Uma análise mais detalhada, usando uma técnica de detecção mais sensível como a espectrometria de massas, deve ser empregada na pesquisa de policetídeos do tipo 8 nas demais cepas.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo suporte financeiro e bolsas de estudo.

Recebido em 25/9/06; aceito em 23/5/07; publicado na web em 9/11/07

• 1. Hertweck, C.; Schuman, J.; J. Biotec. 2006, 124, 690.
• 2. Weissman, K. J.; Philos. Transact A Math Phys Eng Sci 2004, 362, 2671.
• 3. Kealey, J. T.; Front. Biosci 2003, 8c, 1.
• 4. Mann, J.; Chemical Aspects of Biosynthesis, 1^st ed.; Oxford University Press Inc., 1994.
• 5. Marinho, A. M. R.; Rodrigues-Filho, E.; Moitinho, M. L. R.; Santos, L. S.; J. Braz. Chem. Soc 2005, 16, 280.
• 6. Santos, R. M. G; Rodrigues-Filho, E.; Rocha, W. C.; Teixeira, M. F. S.; World Journal of Microbiology & Biotechnology 2003, 19, 767.
• 7. Souza, A. Q. L.; Tese de Doutorado, Universidade Federal de São Carlos, Brasil, 2006.
• 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards; Methods for dilution and antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, NCCLS Approved Standard M7-A4. Wayne, P. A., 1997.
• 9. Waterman, P. G.; Grundon, M. F.; Chemistry and Chemical Taxonomy of the Rutales, Academic Press: London, 1983.
• 10. Petterson, M. F.; Damoglou, A. P.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987, 26, 574.
• 11. Dunn, B. B.; Stack, M. E.; Park, D. L.; Joshi, A.; Environmental Helth 1983, 12, 283.
• 12. Broadbent, D.; Mabelis, R. P.; Spencer, H.; Phytochemistry 1975, 14, 2082.
• 13. Sundholm, E. G.; Acta Chemica Scandinavica 1978, B32, 177.
• 14. Trevedi, A. B.; Hirota, M.; Dói, E.; Kitabatake, N.; J. Chem. Soc. PT1 1993, 2167.
• 15. Hirota, M.; Menta, A. B.; Yoneyama, K.; Kitabatake, N.; Biosci., Biotecchnol., Biochem. 2002, 66, 206.
• 16. Benjamin, C. R.; Capon, R. J.; Lacey, E.; Tennant, S.; Gill, J. H.; Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 1520.
• 17. Hasegawa, A.; Koizumi, F.; Takahashi, Y.; Ando, K.; Ogawa, T.; Hara, M.; Yoshida, M.; Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 2001, 43, 467.
• 18. Hideaki, O.; J. Org. Chem. 2003, 68, 3552.
• 19. Hajjaj, H.; Klaebe, A.; Loret, M. O.; Goma, G.; Blanc, P. J.; François, J. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 311.
• 20. Asano, M.; Inoue, M.; Katoh, T.; Synlett 2005, 17, 2599.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Jan 2008
• Data do Fascículo
  2007

Histórico

• Recebido
  25 Set 2006
• Aceito
  23 Maio 2007