Diterpenos tipo abietano isolados de Plectranthus barbatus Andrews

Abitane diterpenoids isolation from Plectranthus barbatus

Resumo

Plectranthus barbatus is largely used in the Northeast region of Brazil by the local population for treatment of digestive problems as substitute of boldo (Pneumus boldus). Phytochemical analysis of the leaf extracts of Plectranthus barbatus (Labiatae) cultivated in this region yielded two abietane diterpenoids, cyclobubatusin (1) and barbatusin (2) and a new one named 7beta-acetyl-12-deacetoxycyclobutatusin (3). The structures of the isolated compounds were established by spectral analysis, using mainly mass spectra and ¹H and 13CNMR (1D and 2D). These procedures permitted the assignment of all chemical shifts in the diterpenoids.

Plectranthus barbatus; Labiatae; abietane diterpenoids

Plectranthus barbatus; Labiatae; abietane diterpenoids

ARTIGO

Diterpenos tipo abietano isolados de Plectranthus barbatus Andrews

Abitane diterpenoids isolation from Plectranthus barbatus

Roberto L. de Albuquerque^I; Marta R. Kentopff^I; Maria Iracema L. Machado^I; Maria Goretti V. Silva^I; Francisco José de A. Matos^I; Selene M. Morais^II; Raimundo Braz-Filho^III,*

^IDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Departamento de Química Analítica e Físico-Química, Universidade Federal do Ceará-Campus do Pici, 60451-970 Fortaleza - CE, Brasil

^IIUniversidade Estadual do Ceará, Campus do Itaperi, 60740-903 Fortaleza - CE, Brasil

^IIISetor de Química de Produtos Naturais, Centro de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Av. Alberto Lamego, 2000, 28013-600 Campos dos Goytacazes – RJ, Brasil

ABSTRACT

Plectranthus barbatus is largely used in the Northeast region of Brazil by the local population for treatment of digestive problems as substitute of boldo (Pneumus boldus). Phytochemical analysis of the leaf extracts of Plectranthus barbatus (Labiatae) cultivated in this region yielded two abietane diterpenoids, cyclobubatusin (1) and barbatusin (2) and a new one named 7b-acetyl-12-deacetoxycyclobutatusin (3). The structures of the isolated compounds were established by spectral analysis, using mainly mass spectra and ¹H and ¹³CNMR (1D and 2D). These procedures permitted the assignment of all chemical shifts in the diterpenoids.

Keywords:Plectranthus barbatus; Labiatae; abietane diterpenoids.

INTRODUÇÃO

O gênero Plectranthus (sin. Coleus) pertencente à família Labiatae (sin. Lamiaceae) envolve cerca de 300 espécies, com ocorrência natural na África, Ásia e Austrália^1,2. Plectranthus barbatus é uma erva ou subarbusto com folhas pencioladas, elípticas e aveludadas³, popularmente conhecida como malva santa, boldo nacional ou boldo falso. O interesse pelo estudo fitoquímico da espécie Plectranthus barbatus foi estimulado pelo amplo uso popular das folhas para tratamento de problemas digestivos^4,5 em substituição ao boldo do Chile. Espécies do gênero Plectranthus apresentam capacidade biossintética para produzir uma variedade de metabólitos secundários, destacando-se entre estes os diterpenos, inclusive alguns com propriedades biológicas comprovadas relevantes^6-15. Barbatusina, ciclobutatusina¹⁶, 6b-Hidroxicarnosol¹⁷, barbatusol¹⁸, plectrina¹⁹, cariocal²⁰, coleonon E, coleon F, plectrinona A, plectrinona B²¹, e 12,9(10®20)-abeo-abieta-8,11,13-trien-10b,11,12-triol ²² são constituintes identificados em P. barbatus, que apresentam importância farmacológica ou química. Por sua vez o estudo do óleo essencial da parte aérea e raízes da espécie P. barbatus apresentou a-pineno, b-felandreno, (Z)-b-ocimeno, manol e abietatrieno^{23, 24}. Neste trabalho, relata-se o isolamento e elucidação estrutural de três diterpenos do tipo abietano, da espécie Plectranthus barbatus (Coleus barbatus) Andr, cultivada no Horto de Plantas Medicinais Prof. Francisco José de Abreu Matos, da Universidade Federal do Ceará (HPMFJAM/UFC) - ciclobutatusina (1), barbatusina (2) e 7b-acetil-12-desace-toxiciclobutatusina (3), este inédito na literatura. As estruturas foram estabelecidas com base na análise de dados espectrais, notadamente os obtidos de espectros de RMN ¹H e ¹³C (1D e 2D) e de massas. A análise detalhada dos espectros 1D e 2D de RMN ¹H e ¹³C foi também utilizada na atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio (¹H) e carbono-(¹³C) de 1, 2 e 3 (Tabelas 1, 2 e 3).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato clorofórmico proveniente da infusão das folhas de P. barbatus foi submetido a fracionamento cromatográfico e forneceu o diterpeno ciclobutatusina (1) e 7b-acetil-12-desace-toxiciclobutatusina (3). A barbatusina (2) foi isolada do extrato hexânico das folhas de P. barbatus, após emprego de sucessivas colunas cromatográficas.

A fórmula molecular C₂₄H₃₂O₉ da ciclobutatusina (1) foi deduzida a partir dos espectros de massas ([M]⁺, m/z= 464) e de RMN ¹H e ¹³C envolvendo experiências 1D e 2D. A análise comparativa dos espectros de RMN ¹³C–{¹H} e RMN ¹³C-DEPT-135º permitiu identificar seis sinais de carbonos metílicos, dois metilênicos, sete metínicos incluindo três ligados a átomos de oxigênio: d_C 74,78 (CH-7), 74,90 (CH-6) e 77,16 (CH-12) e nove não hidrogenados. Baseado nestes dados, e dispondo da fórmula molecular estabeleceu-se o índice de deficiência de hidrogênio igual a nove, que foi atribuído a quatro carbonilas [duas cetônicas em d_C 212,89 e 211,12 e duas de éster em d_C 171,10 e d 170,76] além de cinco anéis, caracterizando-se um esqueleto diterpênico pentacíclico¹⁶. Todas as informações obtidas através das análises espectrais de RMN de 1 comparadas com os dados de RMN¹H da literatura²⁵ permitiram caracterizar esta substância como o diterpeno ciclobutatusina (1), confirmada pelos dados de RMN bidimensionais de correlação heteronuclear através de uma ligação (¹J_CH) e a longa distância (²J_CH e ³J_CH) fornecidos pelos espectros HMQC (¹J_CH) e HMBC (²J_CH e ³J_CH), respectivamente. As experiências 1D (RMN¹H, RMN¹³C-{¹H} e RMN¹³C-DEPT) e 2D [¹H-¹H-COSY, ¹H-¹³C-COSY-ⁿJ _CH (n=1, HMQC; n=2 e 3, HMBC) e ¹H-¹H-NOESY] de RMN (homo e heteronuclear) foram utilizadas também para atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos de todos os átomos de hidrogênio e carbono de 1 (Tabela 1). A interação dipolar (proximidade espacial) do H-12 [5,55 (s)] e os 3H-17 [1,17(d; 6,5)] foi revelada pelo efeito NOE observado no espectro 2D ¹H-¹H-NOESY de 1.

A fórmula molecular C₂₄H₃₀O₈ da barbatusina (2) foi determinada com base na análise dos espectros de massas ([M]⁺, m/z 446) e de RMN (¹H: 1D e 2D ¹H-¹H-COSY; ¹³C: {¹H} e DEPT-135º). A análise comparativa dos espectros de RMN¹³C-{¹H} e RMN¹³C-DEPT-135º permitiu identificar dez sinais de carbonos não hidrogenados, cinco metínicos, três metilênicos e seis metílicos. A fórmula molecular resultante permitiu deduzir o índice dez de deficiência em átomos de hidrogênio (C₂₄H₅₀O₈ - C₂₄H₃₀O₈ = H₂₀ = 10), que foi atribuído a três carbonilas cetônicas (d_C 214,61 e duas conjugadas em d_C 195,13 e 193,92); duas carbonilas de éster (d_C 169,81 e 169,32), uma ligação dupla tetra-substituída (d_C 140,59 e d 152,74) conjugada com grupo carbonila e quatro ciclos, caracterizando-se o esqueleto de um diterpeno tetracíclico. A comparação dos dados de RMN¹H com valores descritos na literatura para a barbatusina¹⁶ e a análise dos espectros de 1D de RMN¹³C ({¹H} e DEPT) e 2D homonuclear ¹H-¹H-COSY e heteronuclear ¹H-¹³C-COSY-ⁿJ _CH (n=1, HMQC; n=2 e 3, HMBC), (Tabela 2) foram utilizados para confirmação da estrutura do composto 2, diterpeno tetracíclico conhecido como barbatusina. Análise de raios X e somente dados de RMN¹H foram usados anteriormente na dedução estrutural da barbatusina (1)^16,25.

O deslocamento químico do H-6 [5,23 (sl)] e sua interação a longa distância com o carbono C-4 (d_C 46,23) indicaram a presença de um grupo acetoxílicos no átomo de carbono C-6. A localização dos grupos carbonílicos nos carbonos C-11 e C-14 e do anel espirociclopropânico foi confirmada pelas interações a longa distância de: a) C-13 (d_C 34,15) com ambos H-12 [4,94 (s)] ²J_CH e 3H-17 [1,08 (d; 6,0)] ³J_CH; b) C-11 (d_C 193,92) com H-12 [4,94 (sl)] ²J_CH;) e c) C-14 (d_C 195,13) com ambos H-12 [4,94 (s) ²J_CH e H-16 [0,99 (m) ³J_CH). Outras interações a longa distância (²J_CH e 3J_CH) de átomos de carbono e hidrogênio deduzidas do espectro HMBC de 2 encontram-se resumidas na Tabela 2. Resultados obtidos por subtração de espectros de RMN¹H revelaram a presença de efeito NOE entre os átomos de hidrogênio H-12 [4,94 (s) e 3H-17 [1,18 (d; 6,0)], consistente com as configurações relativas 12(S),16(S).

As experiências de RMN (1D e 2D) aplicadas durante o desenvolvimento deste trabalho permitiram a atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos de todos os átomos de hidrogênio e carbono de 1 e 2 (Tabela 1 e 2).

A fórmula molecular C₂₄H₃₂O₈ de 7b-acetil-12-desace-toxiciclobutatusina (3) foi deduzida a partir dos espectros de massas ([M]⁺, m/z= 448) e de RMN¹H e ¹³C envolvendo experiências 1D e 2D. A análise comparativa dos espectros de RMN¹³C-{¹H} e RMN¹³C-DEPT-135º permitiu identificar oito sinais de carbonos não hidrogenados, oito metínicos, dois metilênicos e seis metílicos. A fórmula molecular resultante, como também os dados de RMN, permitiu deduzir o índice nove de deficiência em átomos de hidrogênio (C₂₄H₅₀O₈ - C₂₄H₃₂O₈ = H₁₈ = 9), que foi atribuído a quatro carbonilas [duas cetônicas em d_C 215,91 e 210,45 e duas de éster em d_C 169,75 e d 170,62] e cinco anéis, análogo a (1), caracterizando assim, mais um diterpeno pentacíclico na espécie.

O espectro de RMN¹H revelou sinais correspondentes à presença de quatro grupos metílicos, sendo três terciários 1,11 (s, 3H-18), 1,06 (s, 3H-19) e 1,35 (s, 3H-20) e um secundário em 1,22 (d; 6,4; 3H-17), correlacionados no espectro HMQC com os sinais em d_C 26,37 (CH₃-18), 19,24 (CH₃-19), 26,54 (CH₃-20) e 14,27 (CH₃-17), respectivamente (Tabela 3). Dois grupos acetoxílicos foram caracterizados pelos sinais simples em 1,99 (s) e 2,03 (s), atribuídos a seus grupos metílicos, que revelaram correlação heteronuclear direta no espectro HMQC com o sinal em d_C 21,77 e 21,04 e envolvendo duas ligações no HMBC com os sinais de carbonos carbonílicos em d_C 170,62 e 169,75 respectivamente (Tabela 3). O espectro 2D ¹H-¹H-COSY revelou com clareza a interações spin-spin do átomo de hidrogênio H-9 [2,67 (d; 11,3) com o H-8 [3,03 (dd; 7,9; 11,3), confirmando a ausência de um grupo hidroxil no C-9; o hidrogênio metínico 1H-12 [ 3,93 (sl)] com o hidrogênio da hidroxila OH-12, confirmando a presença de outro grupo hidroxil em C-12, desta forma estes dois acoplamentos evidenciam diferenças entre 7b-acetil-12-desacetoxiciclobutatusina (3) e ciclobutatusina (1). Observou-se ainda o deslocamento do hidrogênio H-7 [4,20 (dd, 7,9; 2,6)] diferente do mesmo hidrogênio H-7 [3,93 (t, 5,4)] de ciclobutatusina, por este se apresentar ligado um grupamento acetil, que favorece um cone de desproteção química. Este, por sua, vez acoplava vicinal com o hidrogênio H-6 [5,16 (d, 2,6)] na técnica 2D de COSY. A comparação do deslocamento químico de RMN¹³C-{¹H} de 7b-acetil-12-desacetoxiciclobutatusina (3) com ciclobutatusina (1), mostrou diferenças significativas entre elas, principalmente nas absorções em C-7 [d 72,00]; C-9 [d 47,14] e C-12 [d 72,65] de 7b-acetil-12-desacetoxiciclobutatusina em relação às absorções de C-7 [d 74,78]; C-9 [d 77,04] e C-12 [d 77,16] de ciclobutatusina; revelando desta forma outro composto semelhante à ciclobutatusina, porém com diferenças nas posições dos grupamentos acetil (C-7), hidroxil (C-12) e ausência de hidroxila em C-9. O espectro HMBC permitiu comprovar que o átomo de carbono C-11 (d_C 81,12) acoplava com o átomo de hidrogênio do carbono C-12 [d_C 72,65/3,93 (sl) ²J_CH] revelando a presença de duas hidroxilas próximas. Por sua vez, a interação dos átomos de carbono quaternário C-13 (d_C 38,12) e carbono metínico C-15 (d_C 22,59) acoplava com os átomos de hidrogênio 3H-17 [1,22 (dd; 6;4)] a ³J_CH, ²J_CH, respectivamente (Tabela 3), que foram usadas para localização do anel espirometilciclopropânico no carbono C-13. O espectro 2D ¹Hx¹H-COSY através dos acoplamentos geminado do H-16a [1,39 (dd; 8,9; 3,5)] com H-16b [0,61 (dd; 7,1; 3,5)] e vicinais dos dois H-16 com H-15 [1,90; (m)] e de H-15 com os 3H-17 [1,22 (d; 6,4)] forneceu informações adicionais que contribuíram para tais deduções (Tabela 3). Outras interações a longa distância (²J_CH e 3J_CH) de átomos de carbono e hidrogênio deduzidas do espectro HMBC de 3 encontram-se resumidas na Tabela 3. Todas as informações obtidas através das análises espectrais de RMN de 3 comparadas com os dados de RMN¹H da literatura²⁵ para ciclobutatusina permitiram caracterizar esta substância como sendo um novo diterpeno denominado 7b-acetil-12-desacetoxiciclobutatusina, além dos dados de RMN bidimensionais de correlação heteronuclear através de uma ligação (¹J_CH) e a longa distância (²J_CH e ³J_CH) fornecidos pelos espectros HETCOR (¹J_CH) e COLOC (²J_CH e ³J_CH), respectivamente. A interação dipolar (proximidade espacial) do H-1 [2,48 (dd; 10,1; 6,6)] em posição b com H-12 [3,93 (sl)] também em b e do H-7 [ 4,20 (dd, 7,9; 2,6)] em posição a com H-8 [3,03 (dd 7,9; 11,3)] em b este favorecido devido a grande torção da estrutura e não presença da hidroxila em C-9 que favorece estereoquímica diferente da estrutura 1 e 2, estes efeitos foram revelados pelo efeito NOE observado no espectro 2D ¹H-¹H-NOESY de 3.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN foram obtidos nos equipamentos Bruker - Avance 500 (¹H: 500 MHz; ¹³C: 125 MHz) e Jeol – 400 (¹H: 400 MHz; ¹³C: 100 MHz) do CENAUREMN – Programa de Pós-graduação em Química Orgânica - UFC e Laboratório de Ciências Químicas - CCT –UENF, respectivamente, tendo como referência interna o tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os espectros de massas foram registrados por impacto eletrônico (70 eV) em um aparelho GC/MS Hewlett – Packard 5971 usando coluna capilar (30 m x 0,25 mm) dimetilpolisiloxano BD-1, He como gás de arraste e as temperaturas de 250 ºC no injetor, 200º C no detector e variação de 1º/min entre 35 -180 ºC e 10 ºC/min entre 180 – 250 ºC na coluna. Nas separações cromatográficas em coluna usou-se gel de sílica 60 da Merck (q mm 0,063-0,200) e gel de sílica 60 da Vetec (q mm 0,063-0,200), quitina, sephadex LH 20 da Pharmacia Biotech e amberlite - (XAD2). Para as cromatografias em camada delgada utilizaram-se placas de vidro nas dimensões de 10x5 cm, sendo uma das faces revestidas por camada com 0,5 mm de espessura, constituída de gel de sílica 60G da Vertec (5-40 µm), além de cromatoplacas de gel de sílica 60 (f mm 0,002 –0,0250) T-6145 sobre poliéster com indicador de fluorescência na faixa de 254 hm da Sigma. As placas cromatográficas foram reveladas com luz UV (l_max 254 – 365 hm), vapores de iodo e/ou solução alcoólica de vanilina e ácido sulfúrico. Para obtenção dos pontos de fusão foram empregados dois equipamentos: um aparelho de micro determinação Mettler provido de placa aquecedora modelo FP-52 e unidade de controle FP-5 e outro da Microquímica modelo APF-301. A determinação foi realizada em ambos a uma velocidade de aquecimento de 2 ºC/min.

Material vegetal

O material vegetal foi coletado no Horto de Plantas Medicinais Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará (HPM-FJAM/UFC). A identificação botânica foi realizada pelo Prof. Dr. R. M. Harley especialista em Labiatae do Royal Botanic Gardens (UK) e a exsicata da espécie encontra-se depositada no herbário Prisco Bezerra da UFC, Brasil, sob o número 28.601.

Extração e isolamento dos constituintes químicos

O extrato aquoso a quente das folhas frescas (765 g) de P. barbatus foi extraído exaustivamente com clorofórmio fornecendo 750 mg de resíduo com aspecto físico pastoso, que analisado em cromatografia em camada delgada (CCD) apresentou três manchas bem distintas quando revelados com vapores de iodo. O extrato clorofórmico foi submetido à cromatografia em coluna (CC) sob Sephadex LH-20 (70 g), utilizando-se como eluentes metanol e água puros ou misturados. Foram obtidas 81 frações de 5 mL cada que posteriormente foram reagrupadas após análise em CCD em sílica gel. A fração F5-13 (751 mg), obtida a partir de frações eluídas com MeOH:água 10%, foi submetida à CC em gel de sílica empregando-se, clorofórmio, acetato de etila e metanol puros ou como misturas binárias em gradiente crescente de polaridade como eluentes. Desta coluna foi possível obter duas frações com maior grau de pureza que quando analisadas por CCD permitiu verificar a existência de dois sólidos amorfos amarelados (1 e 3) puros.

As folhas de P. barbatus Andr. (13 kg) foram secas, trituradas e submetidas à extração exaustiva com hexano em aparelho Soxhlet. O extrato hexânico após destilação do solvente sob pressão reduzida forneceu 38 g de um resíduo, que foi submetido à análise cromatográfica em gel de sílica (CC), utilizando-se hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol como eluentes. Empregou-se novamente análise cromatográfica em gel de sílica com a fração obtida após evaporação do acetato de etila produzindo a fração F31-37 (hexano/acetato de etíla, 20%) que, após ter sido tratada por cromatografia em coluna gravitacional utilizando quitina como fase estacionária e tendo como fase móvel éter de petróleo e metanol forneceu a fração F25-33 (éter de petróleo/metanol, 20%) que posteriormente foi purificada por CC usando amberlite (XAD2) como fase fixa e como fase móvel água e etanol, produziu 2 (29,3 mg), um sólido amorfo de coloração amarela e ponto de fusão 216-218 ºC.

Ciclobutatusina (1): Sólido amorfo amarelo, p. f. 195-198 ºC. Dados de RMN¹H e RMN¹³C: Tabela 1. IV (KBr) u_máx/cm^-1: 3480 (OH), 1740 (C=O), 1710 (C=O), 1670 (C=O), 1233 (C-O) cm^-1. EMIE (70 eV) m/z (int. rel.): 464 (14); 446 (32); 422 (46) 404 (33); 386 (13) 345 (19); 326 (40); 311(28).

Barbatusina (2): Sólido amorfo amarelo, p. f. 216,7-218,1 ºC. Dados de RMN ¹H e RMN¹³C: Tabela 2. IV (KBr) u_máx/cm^-1: 3491 (OH); 1743 (C=O); 1718 (C=O), 1704 (C=O), 1678 (C-O) cm^-1. EMIE (70 eV) m/z (int. rel.): 446 (19,4); 404 (6,5); 386 (23,1); 344 (37,9); 327 (44,3); 326 (100), 311 (38), 283 (28,5), 298 (24,2).

7b-acetil-12-desacetoxiciclobutatusina (3): Sólido amorfo alaranjado, p. f. 184-187 ºC. Dados de RMN ¹H e RMN¹³C: Tabela 3. IV (KBr) u_máx/cm^-1: 3396 (OH); 1738 (C=O); 1237 (C-O), cm^-1. EMIE (70 eV) m/z (int. rel.): 448 (8,0); 388 (29,4); 328 (33,5); 326 (38,9); 311 (24,7); (Esquema 1).

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, BASA, FUNCAP e FAPERJ pelas bolsas e apoios financeiros concedidos, ao PADETEC (Parque de Desenvolvimento Tecnológico do Ceará) pela obtenção dos GC/MS e ao CENAUREMN (Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear) pelos espectros 1D e 2D de RMN.

Recebido em 2/10/06; aceito em 11/5/07; publicado na web em 25/10/07

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Jan 2008
• Data do Fascículo
  2007

Histórico

• Aceito
  11 Maio 2007
• Recebido
  02 Out 2006