Constituintes químicos das flores de Pterogyne nitens (Caesalpinioideae)

Chemical constituents of the flowers of Pterogyne nitens (caesalpinioideae)

Pterogyne nitens; flavonoids; guanidine alkaloids

ARTIGO

Constituintes químicos das flores de Pterogyne nitens (Caesalpinioideae)^#

Chemical constituents of the flowers of Pterogyne nitens (caesalpinioideae)

Luis Octávio Regasini^I; Daniara Cristina Fernandes^I; Ian Castro-Gamboa^I; Dulce Helena Siqueira Silva^I; Maysa Furlan^I; Vanderlan da Silva Bolzani^{I, *}; Eliezer Jesus Barreiro^II; Elaine Monteiro Cardoso-Lopes^III; Maria Cláudia Marx Young^III; Luce Brandão Torres^III; José Carlos Rebuglio Vellosa^IV; Olga Maria Mascarenhas de Oliveira^IV

^IDepartamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Rua Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara - SP, Brasil

^IICentro de Ciências da Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, CP 68006, 21944-190 Rio de Janeiro - RJ, Brasil

^IIISeção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, Av. Miguel Stéfano, 3687, 04301-012 São Paulo - SP, Brasil

^IVDepartamento de Bioquímica e Tecnologia, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Rua Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara - SP, Brasil

ABSTRACT

The phytochemical investigation of the flowers of Pterogyne nitens (Caesalpinioideae) resulted in the isolation and identification of nine phenolic derivatives, quercetin 3-O-sophoroside, taxifolin, astilbin, ourateacatechin, caffeic, ferulic, sinapic, chlorogenic and gallic acid, besides two guanidine alkaloids, pterogynine, pterogynidine. This is the first time these compounds have been reported in P. nitens flowers. As this is a monospecific genus, these secondary metabolites may have taxonomical significance. Their structures were assigned on the basis of spectroscopic analyses, including two-dimensional NMR techniques.

Keywords:Pterogyne nitens; flavonoids; guanidine alkaloids.

INTRODUÇÃO

Pterogyne nitens Tulasne (Fabaceae – Caesalpinioideae), uma espécie pertencente a um gênero monoespecífico, é popularmente conhecida como "amendoim-do-campo", "amendoim-bravo", "bálsamo", "yvi-raró", "cocal", "tipa" etc. Na América Latina essa espécie arbórea ocorre na Argentina, Bolívia, Paraguai e Brasil. No território brasileiro ocorre com freqüência na região de Mata Atlântica e Cerrado compreendida entre o Ceará até o Paraná.¹

"Amendoim-bravo", como é popularmente conhecida no estado de São Paulo, é amplamente empregada na construção civil devido às características da sua madeira moderadamente densa e resistente.²P. nitens também conhecida pela beleza e odor de suas flores, bem como pela intensidade de suas folhagens e frutificação possui grande valor ornamental sendo, portanto, recomendada para arborização de vias urbanas e rodovias e na reposição de mata ciliar em locais com inundações periódicas. Esta espécie habita os remanescentes de vegetação paulista e encontra-se sob risco de extinção, fazendo parte da lista de espécies recomendadas para a conservação genética no estado de São Paulo.³

A literatura apresenta poucos dados das aplicações medicinais e da constituição química de P. nitens. Estudos etnofarmacológicos em comunidades guaranis do nordeste da Argentina revelam o uso das cascas do caule no tratamento de infestações parasitárias, principalmente no combate ao "tacho", nome popular de Ascaris lumbricoides.⁴ Em trabalhos fitoquímicos anteriores, foram isolados cinco alcalóides guanidínicos das folhas e caules de P. nitens, os quais mostraram atividade citotóxica sobre linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, sugerindo atividade antitumoral potencial desses alcalóides.⁵

Dada a emergência de preservação da espécie ameaçada de extinção, o estudo sobre a composição micromolecular das flores de P. nitens foi bastante significativo para o registro do perfil metabólico da espécie. Desse estudo foram isolados e identificados onze constituintes: quatro flavonóides, quatro derivados do ácido cinâmico, dois alcalóides guanidínicos e o ácido gálico.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A identificação de todas as substâncias foi realizada com base na comparação de dados espectroscópicos de RMN de ¹H, RMN de ¹³C, gCOSY, gHMQC, gHMBC, NOESY 1D e comparação desses dados com aqueles disponíveis na literatura.

A análise dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C permitiu caracterizar as substâncias 1-4 como derivados do ácido cinâmico, com uma feição comum caracterizada por um par de dubletos entre d_H 7,58-7,49 (J= 16,0 Hz; 1H) e d_H 6,40-6,13 (J= 16,0 Hz; 1H), típicos do sistema trans-alceno de derivados aromáticos C₆-C₃. Os demais valores atribuídos aos sinais correspondentes ao anel aromático demonstram sutis diferenças na série 1-4. Os sinais em d_H 7,12 (d, J= 2,5 Hz), d_H 7,04 (dd, J= 2,5 e 8,5 Hz) e d_H 6,85 (d, J= 8,5 Hz) observados no espectro de RMN de ¹H de 1 foram atribuídos aos hidrogênios H-2, H-6 e H-5, respectivamente. Esses dados sugerem a presença de um anel aromático 1,3,4-trissubstituído, permitindo concluir que o derivado de ácido cinâmico em análise é o ácido cafeico.⁶

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C da substância 2 apresentaram o mesmo perfil de sinais daqueles observados para 1, exceto pela presença do singleto em d_H 3,90 (3H), atribuído a uma metoxila. A ligação do grupo metoxílico ao anel aromático foi estabelecida pela correlação observada entre os sinais em d_H 3,90 (OCH₃) e 147,9 (C-3), no mapa de contornos gHMBC. Assim, a substância 2 pôde ser caracterizada como sendo ácido ferúlico.⁷ Os espectros de RMN de ¹H da substância 3 apresentaram dois singletos d_H 6,98 (2H) e d_H 3,80 (6H), os quais foram atribuídos aos hidrogênios metínicos H-2 e H-6 e aos dois grupos metoxílicos, respectivamente. Os demais dados espectrais confirmaram a posição dos dois grupos metoxílicos nos carbonos C-3 e C-5 e permitiram identificar a estrutura molecular de 3 como sendo ácido sinápico.⁸ Os dados dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C de 4 foram quase similares àqueles observados para o ácido cafeico 1. Na estrutura de 4, além dos sinais de uma unidade de ácido cafeico analisados a partir dos espectros de RMN de ¹³C, foram diagnosticados um conjunto de sinais compatíveis com uma unidade de ácido quínico. O espectro de RMN de ¹H apresentou sinais para três hidrogênios metínicos em d_H 3,56 (dd, J= 3,5 e 10,0 Hz, H-4), 3,92 (d, J= 3,5 Hz, H-4) e 5,06 (td, J= 3,5 e 10,0 Hz, H-5) e para hidrogênios metilênicos na região compreendida entre d_H 1,08 e 1,99 (H-2 e H-6), os quais confirmaram a presença de uma unidade derivada do ácido quínico. A ligação do grupo cafeoíla à unidade de ácido quínico foi estabelecida pela correlação observada entre os sinais em d_H 5,06 (H-5) e d_C 165,7 (C-9'), no mapa de contornos gHMBC. Os valores observados para os acoplamentos de H-4 com H-3 e H-5 indicaram uma relação axial-equatorial entre H-4 e H-3 (J= 3,5 Hz) e axial-axial entre H-4 e H-5 (J = 10,0 Hz) confirmando as posições diequatoriais para os grupos cafeoíla e a hidroxila (4-OH). Os experimentos de NOESY 1D mostraram um aumento na intensidade do sinal em d_H 3,92 (H-3) pela irradiação do sinal atribuído ao hidrogênio H-4 (3,56) e ausência de NOE quando da irradiação do sinal em d_H 5,06 (H-5), consolidando a configuração relativa proposta. Tais informações foram confirmadas com dados da literatura, indicando que a estrutura de 4 corresponde ao ácido 5-O-cafeoilquínico.⁹ Os dados obtidos dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C permitiram caracterizar a substância 5 como sendo ácido gálico.¹⁰

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C permitiram inferir que a substância 6 pertence à classe dos flavonóides. Entre outras feições destacam-se o conjunto de sinais do espectro de ¹³C em d_C 73,6, 85,0 e 198,3 atribuídos aos carbonos C-3, C-2 e C-4, respectivamente, indicando que 6 possui a estrutura de um diidroflavonol. Um par de dubletos em d_H 5,91 (J= 2,0 Hz, 1H) e d_H 5,88 (J= 2,0 Hz, 1H) foram atribuídos ao anel A 5,7,9,10-tetrassubstituído. Os sinais em d_H 6,96 (d, J= 2,0 Hz, 1H), d_H 6,80 (d, J= 8,0 Hz, 1H) e d_H 6,84 (dd, J= 2,0 e 8,0 Hz, 1H) corroboram o padrão 1,3,4-trissubstituído para o anel B. Ainda o espectro de RMN de ¹H de 6 apresentou um par de dubletos em d_H 4,90 (J= 12,0 Hz, 1H) e 4,49 (J= 12,0 Hz, 1H), os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-2 e H-3, respectivamente. A constante de acoplamento apresentada por estes dois dubletos (J= 12 Hz) sugere um acoplamento do tipo axial-axial, conduzindo à proposição de que o anel B e o grupo hidroxila 3-OH mantém uma relação anti. Estes dados analisados em consonância com os de RMN de ¹³C permitiram caracterizar 6 como sendo taxifolina.¹¹ Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C de 7 indicaram uma estreita similaridade entre 6 e 7. A única diferença notada entre os espectros das duas substâncias refere-se aos sinais característicos de uma unidade glicosídica em 7. O sinal em d_C 17,8, atribuído ao carbono metílico C-6" e o conjunto de sinais em d_C 100,1 (C-1"), 71,7 (C-4"), 70,4 (C-3"), 70,1 (C-2") e 69,0 (C-5") permitiram caracterizar a unidade monosídica como sendo uma ramnose. O espectro de RMN de ¹H demonstrou a presença de um dubleto em d_H 4,04 que foi atribuído ao hidrogênio anomérico H-1", cuja constante de acoplamento de 1,5 Hz inferiu a configuração a para a unidade de ramnose. A correlação deste dubleto e o sinal em d_C 75,7_, atribuído ao carbono C-3, observada no mapa de contornos gHMBC, sugeriu que a unidade de ramnose se encontra ligada ao carbono C-3. Os dados espectroscópicos analisados para 7 indicaram tratar-se da estrutura da astilbina.¹² A análise polarimétrica dos diidroflavonóis 6 e 7 indicou valores de rotação óptica específica de +17º(c= 1,02 MeOH, 27 ºC) e –22 ^o (c= 0,82, MeOH, 27 ºC), respectivamente. Esses dados sugerem as configurações absolutas R,R dos carbonos C-2 e C-3 presentes nas estruturas moleculares de 6 e 7, os quais se mostraram compatíveis com os valores descritos na literatura.¹³

O espectro de RMN de ¹H da substância 8 apresentou três sinais característicos de hidrogênios aromáticos: d_H 6,53 (s, 2H), 5,93 (d, J= 2,0 Hz, 1H) e 5,95 (d, J= 2,0 Hz, 1H) indicando tratar-se também de um flavonóide. Os sinais correspondentes a dois hidrogênios metilênicos em d_H 2,72 (dd, J= 3,0 e 17,0 Hz) e d_H 2,86 (dd, J= 5,0 e 17,0 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios H-4a e H-4b, respectivamente e permitiram atribuir a estrutura de uma catequina para 8. Os sinais relativos aos carbonos entre d_C 100,1 e 157,9 e 29,1 analisados em conjunção com as correlações observadas no mapa de contornos gCOSY para os hidrogênios H-4a, H-4b e H-3 ajudaram a confirmar a proposição de uma catequina para 8. Os experimentos de NOESY 1D foram empregados visando confirmar a estereoquímica relativa de C-2 e C-3. A irradiação em d_H 2,73 (H-4a) causou aumento na intensidade do sinal em d_H 4,19 (m, H-3). A irradiação do sinal em d_H 2,86 (H-4b) também levou ao aumento de intensidade em d_H 4,19 (H-3), indicando a proximidade destes hidrogênios. No entanto, pela intensidade dos NOE observados os sinais em d_H 2,86 (H-4b) e d_H 4,19 (H-3) estão posicionados na mesma face do plano do anel ao qual estão ligados. A irradiação do sinal em d_H 2,73 (H-4a) também causou um incremento em d_H 4,78 (sl, H-2), indicando uma correlação 1,3-diaxial entre H-4a e H-2. Ao irradiar-se o sinal em d_H 4,19 (H-3), houve um ganho de intensidade em d_H 4,78 (H-2) e d_H 2,73 (H-4a) coerente com uma relação sin entre H-2, H-3 e H-4a. Estes dados analisados em consonância com as constantes de acoplamento destes sinais permitiram atribuir a configuração relativa proposta. O mapa de contornos gHMBC demonstrou uma intensa correlação entre o sinal em d_H 3,80 (s, 3H), atribuído a um hidrogênio metoxílico e o sinal em d_C 136,0, o qual está relacionado ao carbono C-4', sugerindo que o grupo metoxila se encontra ligado ao carbono C-4'. A medida da rotação óptica específica de 8 [a]_D²⁷ = -58º(c= 1,22, acetona) indicou as configurações R e R dos carbonos C-2 e C-3, similares aos valores encontrados para a epigalocatequina.¹⁴ Os dados apresentados são compatíveis com estrutura da ourateacatequina,¹⁵ confirmando sua identidade com 8.

A análise dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C permitiu caracterizar a substância 9 também como um flavonóide. O espectro de RMN de ¹³C apresentou os sinais em d_C 177,3, 155,4 e 132,9 atribuídos aos carbonos C-4, C-2 e C-3, respectivamente, evidenciando a subclasse dos flavonóis. Os sinais em d_C 144,7 e 148,7 atribuídos aos carbonos C-3' e C-4', respectivamente, evidenciaram um flavonol cujo anel B encontra-se 1',3',4'-trissubstituído. Adicionalmente, os sinais de RMN de ¹³C compreendidos entre d_C 60,6 e d_C 82,6 analisados com os sinais de RMN de ¹H em d_H 5,66 (d, J= 7,5 Hz, 1H) e d_H 4,58 (d, J=7,5 Hz, 1H) correspondentes a dois hidrogênios anoméricos indicaram duas subunidades de glicose e, com base no valor da constante de acoplamento (J= 7,5 Hz) para estes dois dubletos, verificou-se tratar de duas subunidades de b-glicose. Os experimentos de gHMBC demonstraram duas correlações entre os dubletos em d_H 5,66 e d_H 4,58 atribuídos aos hidrogênios anoméricos H-1" e H-1'", respectivamente, e o sinal em d_H 82,6 sugerindo que a ligação interglicosídica seja do tipo 2"'®1'". O mapa de contornos gHMBC de 9 também apresentou uma correlação entre o sinal em d_C 132,9 atribuído ao carbono C-3 e o dubleto em d_C 5,66, levando à conclusão que a posição de O-glicosilação se encontra em C-3. Pelos dados obtidos pode-se caracterizar 9 como sendo quercetina 3-O-soforosídeo.¹⁶

Análise dos dados de RMN de ¹³C das substância 10 e 11 indicou tratar-se de alcalóides de estruturas bastante similares. Entre outras características destacam-se a presença de sinais em torno de d_C 155,7 e 156,9 (C-2) típico de carbono guanidínico e um conjunto de cinco sinais relacionados às subunidades isoprenílicas em torno de d_C 17,8/17,7; d_C 25,2/25,1; d_C 39,0/38,7; d_C 119,2/119,0 e d_C 135,8/136,0. A análise desses dados indicou que 10 e 11 contêm um núcleo guanidínico substituído por unidades hemiterpenoídicas. Dado evidenciado por dois singletos em d_H 1,62 (H-4') e d_H 1,68 (H-5') atribuídos aos hidrogênios dos grupos metílicos; um dubleto em d_H 3,72 (d, J= 6,5, H-1') e um tripleto em d_H 5,16 (t, J= 6,5, H-2') relacionados aos hidrogênios metilênicos e metínico, respectivamente, para 10. Da mesma forma, dados similares caracterizaram a estrutura de 11, indicando que as estruturas em questão se tratam de alcalóides guanidino-prenilados. A única diferença entre os alcalóides 10 e 11 deve-se ao padrão de substituição do núcleo guanidínico. No alcalóide 10 o sinal d_H 3,72 (J= 6,5 Hz), atribuído aos hidrogênios H-1', apresenta-se como um dubleto devido ao acoplamento com H-2'. Adicionalmente, a ausência do hidrogênio azometínico na estrutura alcaloídica indicou o padrão N,N-dissubstituído para 10, que foi caracterizado como sendo a pteroginina.¹⁷ No alcalóide 11, a presença de um tripleto em d_H 7,72 (t, J= 6,5, 1H) devido ao acoplamento do hidrogênio azometínico do núcleo guanidínico com H-1' da unidade hemiterpênica indicou que a substituição terpênica ocorre nos nitrogênios vicinais da estrutura guanidínica. Análise de todos os dados indica que 11 possui padrão N,N' de substituição isoprenílica. Fundamentado nestas análises, a substância 11 foi caracterizada como a pteroginidina,⁵ um isômero constitucional do alcalóide 10.

As substâncias 1-11 foram avaliadas quanto à sua capacidade de inibição sobre mieloperoxidase (MPO), uma heme-enzima abundante em polimorfonucleares (PMNs), e considerada uma macromolécula-chave na resposta imunológica inespecífica a vários agentes invasores, principalmente bactérias. A MPO é responsável pela conversão de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e ânions cloreto em água e ácido hipocloroso (HOCl) que, por sua vez, atua como um potente agente antimicrobiano. Além disso, o excesso da atividade de MPO e subseqüente produção exagerada de HOCl culmina em um intenso estresse oxidativo para os PMNs. A literatura correlaciona essa injúria oxidativa promovida por MPO e HOCl com inúmeros processos inflamatórios, tais como artritite reumatóide, fibrose cística, doença inflamatória intestinal (IBD), injúria pulmonar neonatal, etc. Dessa forma, a busca por inibidores de MPO a partir de fontes naturais torna-se de grande valia na descoberta de novos agentes anti-inflamatórios.¹⁸

Dentre as substâncias ensaiadas com MPO, apenas as substâncias 5 e 9 mostraram-se ativas, exibindo CI₅₀ de 17,5 e 3,72 nM, quando comparadas à quercetina, utilizada como controle positivo, que apresentou uma CI₅₀ de 1,22 nM. O valor de CI₅₀ da quercetina apresenta-se inferior àquele observado para o seu glicosídeo 9, sugerindo a importância de uma hidroxila livre na posição 3 para atividade de inibição de MPO. As demais substâncias mostraram-se inativas (CI₅₀ > 100 nM), incluindo a substância 6, um análogo hidrogenado da quercetina. Essa observação sugere que uma insaturação situada entre os carbonos C-2 e C-3 no núcleo flavonoídico para uma ação inibitória sobe MPO.

Os extratos e frações obtidas das flores de P. nitens tiveram sua capacidade antioxidante avaliada no ensaio em cromatoplacas reveladas com b-caroteno, mostrando-se ativos, uma vez que mantiveram a coloração laranja nos pontos de aplicação. As substâncias fenólicas isoladas neste estudo são provavelmente as responsáveis pela atividade antioxidante dessas frações detectadas pelo teste preliminar com b-caroteno e que foi anteriormente relatado por Cai e colaboradores, que demonstraram a capacidade seqüestradora de radicais livres das substâncias 1-9 nos ensaios com DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila) e ABTS [2,2'-azino-di-(3-etillbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)].¹⁹ A atividade seqüestradora de radicais exibida pelos derivados fenólicos vem sendo amplamente discutida na literatura e está correlacionada a fatores mesoméricos que conferem a esse grupo funcional uma alta reatividade como doadores de elétrons.²⁰ Os alcalóides guanidínicos 10 e 11 tiveram seu poder antioxidante avaliado sobre os radicais DPPH e ABTS. Os resultados indicaram que os alcalóides são inativos no teste com DPPH (CI₅₀ > 200 µM) e mostraram atividade baixa sobre o radical ABTS, apresentando CI₅₀ de 87,7 e 190,0 µM, tendo a quercetina como controle positivo (CI₅₀ de 7,64 e 3,12 µM para os radicais DPPH e ABTS, respectivamente).

O estudo químico das flores de P. nitens culminou no isolamento de onze substâncias de três classes químicas distintas: flavonóides (flavonóis, diidroflavonóis e catequinas), derivados do ácido cinâmico e alcalóides. Dentre esses, somente as substâncias 10 e 11 já haviam sido relatadas como pertencentes ao metaboloma de P. nitens. Este trabalho permitiu concluir ainda que os metabólitos secundários acumulados nas flores desta espécie são predominantemente de natureza fenólica. A descrição dos constituintes acumulados em P. nitens é também de grande valia tendo em conta que sua madeira vem sendo empregada indiscriminadamente pela construção civil e, por tratar-se de um gênero monoespecífico, esta leguminosa está seriamente ameaçada de extinção.²

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C e experimentos bidimensionais foram realizados em espectrômetro Varian INOVA-500^® operando a 500 MHz para o núcleo de ¹H e 125 MHz para o núcleo de ¹³C, TMS foi utilizado como referência interna. Os dados de rotação óptica foram obtidos em polarímento Polamat A Carl Zeiss Jena^®. As análises por CLAE no modo analítico foram realizadas em equipamento ProStar/Varian^® acoplado ao detector ProStar 330^® de arranjos de diodos, utilizando coluna analítica Phenomenex^® Fenil-Hexila (250 x 4,60 mm; 5 µm). No modo preparativo, as análises por CLAE foram realizadas em equipamento ProStar/Varian^® acoplado ao detector ProStar-UV^®, utilizando-se coluna Phenomenex Fenil-Hexila (250 x 21,2 mm; 10 µm). Nas separações em coluna aberta foram utilizadas gel de sílica derivatizado C-18 (40-63 µm, Merck^®), gel de sílica para cromatografia flash (35-70 µm) e para cromatografia de exclusão molecular (Sephadex,^® LH-20). As análises por cromatografia em camada delgada foram realizadas com cromatoplacas de gel de sílica G60 (0,25 mm). Após o desenvolvimento das cromatoplacas estas foram visualizadas sob luz ultravioleta (l = 254 e 365 nm) e reveladas com solução de anisaldeído em ácido sulfúrico seguido de aquecimento.

Material vegetal

As flores de P. nitens foram coletadas no Instituto de Botânica, São Paulo – SP, no mês de abril de 2003, pela Dra. M. C. M. Young. O material botânico foi identificado como sendo Pterogyne nitens (Fabaceae – Caesalpinoideae) pela Dra. I. Cordeiro, do mesmo Instituto. Uma exsicata (SP204319) encontra-se depositada no herbário "Maria Eneida P. Kaufmann" do Instituto de Botânica, São Paulo - SP.

Extração e isolamento

As flores (1,8 kg) foram secas à temperatura ambiente por 15 dias e, posteriormente, submetidas à moagem empregando moinho de facas. O pó obtido (1,5 kg) foi levado à maceração empregando hexanos e posteriormente maceração em etanol. Após evaporação, o extrato hexânico (3,8 g) foi analisado por RMN de ¹H e CCDC mostrando tratar-se de uma mistura complexa de terpenos. O extrato etanólico (15,0 g) foi dissolvido em uma mistura de metanol:água (7:3) e posteriormente submetido à partição líquido-líquido empregando acetato de etila e n-butanol.

A fração AcOEt (3,8 g) foi submetida à cromatografia em coluna de permeação em gel (Sephadex^®, LH-20, 180 x 5 cm), eluída em MeOH, obtendo-se 25 subfrações de 75 mL. A subfração AcOEt-17 (143,0 mg) foi submetida à cromatografia flash em coluna de gel de sílica (28 x 3 cm), eluída em modo gradiente (CHCl₃:MeOH, 100 a 50%), obtendo-se os ácidos cafeico (1; 12, 0 mg), ferúlico (2; 14,0 mg) e sinápico (3, 7,0 mg). A subfração AcOEt-20 (79 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de fase reversa (8 x 3 cm) empregando misturas de MeOH:H₂O (30 a 80%), resultando no isolamento de dois flavonóides, taxifolina (6, 14 mg) e ourateacatequina (8, 15 mg).

A fração n-butanólica (3,0 g) foi submetida à cromatografia por exclusão molecular (LH-20, Sephadex, 180 x 5 cm) eluída em MeOH, resultando em 22 subfrações de 70 mL. A subfração BuOH-7 (280 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de gel de sílica (28 x 4 cm), eluída em misturas de CHCl₃:MeOH (10 a 30%), obtendo-se dois alcalóides guanidínicos, pteroginina (10, 98 mg) e pteroginidina (11, 90 mg). A subfração BuOH-12 (120 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de fase reversa (10 x 3 cm), eluída em MeOH:H₂O (1:1), obtendo-se astilbina (7, 27 mg). A subfração BuOH-18 (97 mg) foi submetida à CLAE-UV preparativo [MeOH:H₂O (56:44), l = 254 nm, fluxo = 11,0 mL/min), culminando no isolamento do flavonol glicosilado (9, 18 mg).

A fração hidroalcoólica (1,7 g) foi inicialmente submetida à cromatografia de permeação em gel (Sephadex^®, LH-20, 120 x 8 cm), eluída em MeOH, obtendo-se 13 subfrações de 35 mL. A subfração HA-5 foi identificada como ácido gálico (5, 11 mg) e a subfração HA-12, como sendo o ácido 5-O-cafeoilquínico (4, 22 mg).

Atividades antioxidante e inibitória sobre mieloperoxidase (MPO)

Para os ensaios em CCD reveladas com b-caroteno, as amostras foram eluídas e reveladas com uma solução diclorometânica de b-caroteno a 0,02%. Após revelação, a cromatoplaca foi mantida à exposição de luz solar até total perda de coloração. Os pontos que mantiveram a coloração laranja indicaram a presença de substâncias antioxidantes.²¹ Os ensaios de capacidade seqüestradora de radicais livres realizados para as substâncias 10 e 11 seguiram protocolos relatados na literatura com pequenas modificações.²²

A atividade inibitória sobre MPO das substâncias 1-11 foi avaliada segundo o método de oxidação do guaiacol. O meio reacional constituído de uma mistura de MPO (8,0 nM), peróxido de hidrogênio (0,3 mM) e guaiacol (70 mM) foi utilizado para a avaliação da ação de MPO na presença das substâncias em estudo e do controle positivo quercetina. As substâncias foram dissolvidas em DMSO nas concentrações 0,50; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100 nM. Após o tempo de reação (4 h), o meio reacional foi lido em espectrofotômetro (470 nm). A atividade inibitória foi expressa em CI₅₀, valor calculado a partir da plotagem de um gráfico correlacionando velocidade inicial versus absorbância, obtendo-se, assim, as curvas concentração-resposta.²³

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Programa BIOTA-FAPESP (Instituto Virtual da Biodiversidade, www.biota.org.br), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). L. O. Regasini e D. C. Fernandes agradecem à FAPESP pelas bolsas, respectivamente, de Doutorado e Iniciação Científica concedidas.

REFERÊNCIAS

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2. Carvalho, P. E. R.; Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira, EMBRAPA-CNPF: Colombo, 1994.

3. Lorenzi, H.; Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil, Plantarum: Nova Odessa, 1992.

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Recebido em 15/1/08, aceito em 17/3/08, publicado na web em 23/4/08

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Em homenagem à Profa. Helena Maria C. Ferraz

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jun 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  23 Abr 2008
• Revisado
  17 Mar 2008
• Recebido
  15 Jan 2008