Efeitos de diferentes níveis de matéria orgânica no solo e de inóculo sobre a interação planta-Meloidogyne spp. e a produção massal de Pasteuria penetrans

Effects of cow manure levels in the soil and inoculum concentration on the plant-Meloidogyne spp. interaction and on the mass production of Pasteuria penetrans

ARTIGOS

Efeitos de diferentes níveis de matéria orgânica no solo e de inóculo sobre a interação planta-Meloidogyne spp. e a produção massal de Pasteuria penetrans¹

Effects of cow manure levels in the soil and inoculum concentration on the plant-Meloidogyne spp. interaction and on the mass production of Pasteuria penetrans

Fábio Ramos Alves^1,I,*; Leandro Grassi De Freitas^II; Paulo Roberto Pala Martinelli^II; Renata Maria Strozi Alves Meira^III; Silamar Ferraz^II; Antônio Jacinto Demuner^IV; Eduardo Euclydes De L. Borges^V; Waldir de Cintra Jesus Júnior^I

^IDepartamento de Produção Vegetal do CCA, Universidade Federal do Espírito Santo

^IIDepartamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, 36571-000, Viçosa, MG, Brasil

^IIIDepartamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa, 36571-000, Viçosa, MG, Brasil

^IVDepartamento de Química, Universidade Federal de Viçosa, 36571-000, Viçosa, MG, Brasil

^VDepartamento de Engenharia Florestal, Universidade Federal de Viçosa, 36571-000, Viçosa, MG, Brasil

RESUMO

Foram estudados os efeitos de quatro proporções de esterco de curral no solo, 0, 20, 33 e 50% (V:V), e três níveis de inóculo de Meloidogyne spp. (3.000, 6.000 e 9.000 J2 por planta) na concentração de fenóis em raízes de tomateiro, no desenvolvimento das fêmeas, nas células gigantes induzidas por esses patógenos e na infecção e reprodução de Pasteuria penetrans. O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, em delineamento inteiramente ao acaso com doze repetições, sendo avaliado 50 dias após a inoculação das plantas. O tamanho médio das fêmeas do nematóide foi maior quando as plantas foram inoculadas com 3.000 J2. Maior percentual de fêmeas infectadas por P. penetrans foi observado quando não se utilizou esterco no substrato ou quando as plantas foram inoculadas com 3.000 J2. As plantas inoculadas com 9.000 J2 e cultivadas no substrato com 20% de esterco foram as que produziram mais endósporos. A concentração de fenóis nas raízes aumentou à medida que se acrescentou esterco de curral ao substrato. As células gigantes de plantas cultivadas no substrato com 33 e 50% de esterco apresentaram menores número, tamanho e quantidade de núcleos. O aumento da proporção de esterco de curral ao substrato causou aumento nas concentrações de fenóis nas raízes, fato que foi deletério às células gigantes, prejudicial ao desenvolvimento do nematóide e à reprodução de P. penetrans.

Palavras-chave adicionais:Pasteuria penetrans, nematóides das galhas, controle biológico.

ABSTRACT

The effects of four different proportions of cow manure, 0, 20, 33 and 50% (V:V) and three Meloidogyne spp. inoculum levels (3,000; 6,000 and 9,000 J2 per plant) on the phenol concentration in the tomato roots, in the nematode female development, the giant cells induced by the nematode and on the reproduction of Pasteuria penetrans were investigated. The experiment was carried out in greenhouse, in a completely randomized design with twelve replicates, and evaluated 50 days after inoculation. The size of nematode females was higher when the plants were inoculated with 3,000 J2. Higher proportion of females infected by P. penetrans was observed when the plants were cultivated in the substrate without cow manure or when plants were inoculated with 3,000 J2. Plants inoculated with 9,000 J2 and cultivated on substrate with 20% of cow manure yielded more endospores. The phenolic content in the roots increased as higher proportions of cow manure were used in the substrate or when the plants were inoculated with the highest number of nematodes. The giant cells of plants cultivated on substrate with 33 and 50% of cow manure were less numerous, smaller and had less nuclei number, demonstrating the deleterious effect of organic amendments on the giant cells, on the nematodes and on the P. penetrans reproduction.

Additional keywords:Pasteuria penetrans, root-knot nematode, biological control.

A bactéria Pasteuria penetrans (Thorne) Sayre & Starr (20) é um parasito obrigatório com potencial para o controle biológico de fitonematóides em condições de campo (8) devido às várias características desejáveis que apresenta (2, 6). Na ausência de meios artificiais para a produção de P. penetrans, o método utilizado para sua multiplicação é o de Stirling & Wachtel (24), no qual tomateiros são inoculados com 5.000 J2 de Meloidogyne sp., com endósporos aderidos à cutícula. Para uma possível aplicação prática dessa bactéria em nível de campo, sua produção 'in vivo' deve ser otimizada visando o aumento da produção de endósporos de P. penetrans por planta (12, 19, 21). Uma hipótese a ser estudada é a da adição de esterco de curral ao substrato para proporcionar esse aumento, pois plantas cultivadas em solo orgânico se desenvolvem mais vigorosamente, com sistemas radiculares maiores e se tornam capazes de tolerar uma carga maior de nematóides (12). Como a produção de P. penetrans depende do número de fêmeas infectadas por planta (21, 24), a utilização de esterco possibilitaria a inoculação de maior número de juvenis com endósporos aderidos, pois haveria mais sítios de penetração e a planta melhor nutrida poderia nutrir melhor o nematóide, e consequentemente a bactéria, resultando em maior produção de endósporos por planta. Entretanto, se a matéria orgânica for prejudicial ao desenvolvimento do nematóide, a produção de P. penetrans pode ser afetada negativamente (23). Entre os compostos sintetizados pelas plantas, os fenóis são conhecidos por atuarem na resistência a patógenos (10, 23) e adição de esterco pode elevar o nível de fenóis nas raízes da planta hospedeira (1), deformando as células gigantes e engrossando suas paredes celulares, o que tornaria a planta mais resistente aos nematóides (3, 16 ,19).

Este trabalho objetivou avaliar como a adição de esterco de curral ao substrato afeta a produção de P. penetrans através de alterações dos níveis de fenóis nas raízes, da integridade das células gigantes e do tamanho das fêmeas do nematóide, assim como a interação entre níveis de esterco, níveis de inóculo de nematóides e número de endósporos da bactéria produzidos por planta.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram preparadas misturas de solo, areia e esterco de curral de forma a se obter 0, 20, 33 e 50% de esterco no substrato. O solo, areia e esterco foram homogeneizados manualmente e tratados com brometo de metila na dose de 200 cm³/m³ de substrato.

Uma população mista de espécies de Meloidogyne com aproximadamente 60% de M. incognita (Kofoid e White) Chitwood e 40% de M. javanica (Treub) Chitwood foi obtida de plantas de tomate cv. Santa Clara cultivadas em casa-de-vegetação. Ovos dos nematóides foram obtidos pela técnica de Hussey & Barker (1973) modificada por Boneti & Ferraz (4), colocados em câmaras de eclosão e mantidos a 26 ºC para obtenção dos juvenis de segundo estádio (J2). Os J2 eclodidos foram coletados diariamente e mantidos em água com borbulhamento de ar até serem utilizados nos experimentos. A quantificação dos J2 foi feita em câmaras de Peters sob estereoscópio.

Para a obtenção de inóculo de P. penetrans, plantas de tomateiro cv. Santa Clara foram cultivadas em solo infestado com P. penetrans e J2 de M. javanica foram depositados ao redor das plantas. Após 70 dias da inoculação, as plantas foram removidas dos vasos, as fêmeas foram retiradas das raízes sob estereoscópio, transferidas para tubos tipo Eppendorf e maceradas para a obtenção de uma suspensão de endósporos, cuja quantificação foi feita em câmara de Neubauer.

Após a obtenção do inóculo de Meloidogyne spp. e de P. penetrans, 30 mL de suspensão aquosa contendo 10.000 J2 e 1 x 10⁶ endósporos da bactéria foi agitada em agitador orbital a 180 rpm por 30 minutos. A suspensão contendo cerca de cinco endósporos aderidos por J2 foi mantida a 8º C para interromper o processo de adesão. Posteriormente, plantas de tomateiro cv. Santa Clara com 20 dias de idade foram inoculadas com 3.000, 6.000 ou 9.000 J2 com até 72 horas de idade. Segundo Silva et al. (22), o número de endósporos de P. penetrans aderidos em M. incognita e M. javanica foi aproximadamente igual, de modo que populações mistas de Meloidogyne spp. podem ser empregadas para multiplicação de P. penetrans.

O delineamento estatístico foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 4 (três níveis de inóculo de Meloidogyne spp. e quatro proporções de esterco de curral), com doze repetições, sendo que, em quatro destas, as plantas foram inoculadas com os nematóides sem a presença da P. penetrans para determinação dos níveis de fenóis nas raízes das plantas e para a caracterização estrutural das raízes. O experimento foi realizado de fevereiro a abril de 2003.

Cinqüenta dias após a inoculação, os sistemas radiculares de oito repetições foram lavados e pesados para a obtenção do peso da matéria fresca por planta (PMF) e avaliados quanto ao número de galhas por planta (NG). Trinta fêmeas por sistema radicular foram medidas com auxílio de um tubo de imagem acoplado a um microscópio de luz. Cada fêmea foi desenhada, a imagem digitalizada e a área determinada com o uso do software Quant 1.0.1 (25). Determinou-se também a porcentagem de fêmeas infectadas por P. penetrans esmagando-as e observando-as em microscópio de luz. Em seguida, foi determinado o número de endósporos por fêmea (NEF) avaliando-se dez fêmeas do nematóide, de cada sistema radicular. Foi feita a secagem das raízes em estufa de ventilação forçada a 70º C por 72 horas para determinação da matéria seca da raiz por planta (PMS), e moagem de cada sistema radicular individual em micro moinho (General Eletric A-C mot), para obtenção de um pó fino de raiz (24). Finalmente, o número de endósporos por planta (NEP) foi determinado em câmara de Neubauer.

A caracterização estrutural das raízes e determinação do teor de fenóis em raízes de tomateiro foram feitas conforme métodos descritos a seguir:

Caracterização estrutural das raízes de tomateiro

Foram retiradas dez galhas radiculares por sistema radicular, das quais segmentos de 0,5 cm foram fixadas em formaldeído - ácido acético - álcool (FAA₅₀)e estocadas em etanol 70% (13). Para obtenção de cortes histológicos, procedeu-se à inclusão em parafina utilizando-se a série etílico-butílica para a desidratação (13). Os cortes transversais seriados, de 14 mm de espessura, foram corados com azul de astra e fucsina básica (9) por 5 e 20 minutos respectivamente, e as lâminas montadas com resina sintética (bálsamo do Canadá). As observações e as ilustrações foram obtidas em um fotomicroscópio (Olympus BX50) equipado com sistema Optronic enginering DEI. À partir das imagens obtidas, quantificou-se o número de núcleos nas primeiras trinta células gigantes de cada tratamento. Também foram determinadas as áreas das células gigantes em noventa células das plantas de cada tratamento, que foram previamente desenhadas, as imagens digitalizadas e a área determinada a partir do software Quant 1.0.1 (25).

Determinação do teor de fenóis em raízes de tomateiro

A análise fotoquímica foi feita através de espectrofotômetro de duplo feixe Hitachi U-2000, sendo realizadas três leituras por amostra, no Departamento de Química da UFV. Para a obtenção e preparação das raízes para a extração do tanino (fenóis totais), utilizou-se a técnica de Mueller-Hervey (9).

Na preparação da amostra para leitura de absorvância, foi pipetado 0,5 mL do extrato em balão volumétrico de 10 mL, ao qual foram adicionados 7,5 mL de água destilada, 0,5 mL do reagente FolinDenis e 1 mL de solução saturada de carbonato de sódio, sendo completado o volume para 10 mL com água destilada. Após adição dos regentes, esperou-se 30 minutos para leitura de absorbância em 760 nm.

Para atender as pressuposições da ANOVA, as características PMF, PMS, NG e NEP foram transformados para . Os dados foram submetidos a ANOVA e as médias dos dados qualitativos comparadas pelo teste de Tukey, 5% de probabilidade, utilizando-se o programa SAS^® versão 6.12.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com base na tabela 1, verifica-se que a única característica avaliada onde houve interação significativa foi o número de endósporos por planta (NEP). Com exceção do tamanho de fêmeas (TF), todas as características foram significativas para o fator substrato e, em relação ao fator nível de inóculo do nematóide, as características número de galhas (NG), porcentagem de fêmeas infectadas por P. penetrans (%FI) e tamanho de fêmeas (TF) foram significativos.

Menores PMF, PMS e NG (P< 0,05) foram observados no substrato com 50% de matéria orgânica (Tabela 2). As galhas são resultantes do aumento do número de células nas raízes e, conseqüentemente, sua massa. À medida que o nível de inóculo subiu de 3.000 para 9.000 J2, observou-se aumento do NG (Figura 1). Esses resultados estão de acordo com aqueles observados por Gomes (12). Quando o substrato continha 50% de matéria orgânica, menor número de galhas foi formado, o que pode ser conseqüência da atuação de compostos tóxicos aos nematóides produzidos pela matéria orgânica. Essas observações estão em concordância com aquelas feitas por Lazarovits et al., (14); Nico et al., (15); Riegel et al., (18) e Viaene & Abawi (26).

O tamanho das fêmeas e o percentual de fêmeas infectadas por P. penetrans foram maiores quando se utilizou o menor nível de inóculo do nematóide, ou seja, 3.000 J2 (Figuras 2 e 3). Isso, possivelmente, por haver menor competição por sítios de alimentação e mais alimento disponível aos nematóides, que se desenvolvem melhor, permitindo que P. penetrans também tenha maior possibilidade de se desenvolver e completar seu ciclo (5). Maior percentual de fêmeas infectadas por P. penetrans (P < 0,05) foi observado quando se utilizou substrato sem matéria orgânica do que nos substratos com 33 e 50% de matéria orgânica (Tabela 2), o que pode ser explicado pelo fato de as raízes das plantas cultivadas em substrato com maiores proporções de matéria orgânica terem apresentado maiores teores de fenóis (P< 0,05) (Tabela 2), o que possivelmente dificultou a penetração dos J2 com P. penetrans nas raízes. Alam et al. (1) observaram aumento nos níveis de fenóis de 12,96 a 151,85% em raízes de tomateiro quando essas plantas foram cultivadas em substratos que receberam resíduos orgânicos, e essas maiores concentrações de fenóis estavam relacionadas com menor penetração do sistema radicular por M. incognita. Segundo Giebel (11), entre as substâncias produzidas pelas plantas que estão envolvidas na resistência a fitopatógenos, os compostos fenólicos são os que merecem maior destaque. Alguns autores afirmam que há uma correlação positiva entre resistência de plantas a fitopatógenos e conteúdo de fenóis nos tecidos radiculares (10, 17). De fato, compostos fenólicos estimulam a síntese do ácido indol-acético (AIA)-oxidase, o que favorece a degradação da auxina, comprometendo a formação das células gigantes (10). Os relatos de Giebel (10) são confirmados nesse estudo pelas observações feitas nas células gigantes das plantas cultivadas em substratos que receberam 33 e 50% de matéria orgânica. Os sítios de alimentação (Figura 5 e Tabela 2), foram menores, menos numerosos e com deformações, com paredes mais espessas e com menor número de núcleos se comparados àqueles de plantas cultivadas nos substratos com 0 e 20% de matéria orgânica. Alguns autores relataram que plantas resistentes a Meloidogyne spp. podem apresentar células gigantes com vacúolos menores, menor desenvolvimento, menor número de núcleos, escurecimento do citoplasma e depósito de calose em células adjacentes àquelas invadidas pelos nematóides (3, 7, 16, 19), o que está em concordância com observações feitas nesse estudo.

Plantas inoculadas com 9.000 J2 e cultivadas no substrato com 20% de esterco apresentaram maior número de endósporos (Figura 4). A maior produção de endósporos quando se utilizou maior nível de inóculo de espécies de Meloidogyne está de acordo com os dados encontrados por Gomes (12), que observou que plantas inoculadas com 2.000 J2 permitiram multiplicação de P. penetrans de até 2,5 vezes superior àquelas que receberam 1.000 J2.

Com base nos resultados obtidos neste trabalho conclui-se que não é recomendada a incorporação das maiores proporções de esterco de curral ao substrato para a multiplicação da P. penetrans, porém o acréscimo das menores doses é desejável, pois resultou em maior produção de endósporos de P. penetrans por vaso.

Data da chegada: 07/08/2006.

Aceito para publicação em: 23/04/2007.

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1

Parte da Tese de Doutorado em Fitopatologia do primeiro autor desenvolvida na Universidade Federal de Viçosa

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Fev 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2007

Histórico

• Recebido
  07 Ago 2006
• Aceito
  23 Abr 2007