Ácido valpróico e cicatrização em bexiga: estudo experimental em ratosRESUMO
Objetivo: reconhecer os efeitos do ácido valpróico (VPA), uma droga epigenética, no processo de cicatrização da bexiga, em ratos.
Método: vinte ratos Wistar machos foram divididos em dois grupos: experimental (A), utilizando VPA (150mg/Kg/dia), e controle (B), tratados com cloreto de sódio 0,9% por gavagem. A cicatrização da bexiga foi analisada no terceiro e sétimo dia, estudando-se a reação inflamatória, síntese de colágeno, reepitelização e angiogênese.
Resultados: a reação inflamatória no terceiro dia foi mínima e aguda em ambos os grupos. No sétimo dia, foi subaguda em ambos os grupos com intensidade moderada no grupo A e mínima no grupo B (p=0,0476). A intensidade do colágeno III, marcada pela imuno-histoquímica, foi semelhante nos dois grupos, nos dois tempos estudados. A intensidade de colágeno I no terceiro dia foi semelhante nos dois grupos, e maior no sétimo dia no grupo experimental (p=0,0476). A avaliação do colágeno pelo picrosiriusred mostrou que a presença de colágeno III foi semelhante em ambos os grupos (p=0,3312) no terceiro dia, e maior no controle no sétimo dia (p=0,0015). O colágeno I foi semelhante no terceiro dia (p=0,3100), e maior no controle no sétimo dia (p=0,0015). A contagem de vasos marcados pelo anti-SMA mostrou menos vasos no terceiro (p=0,0034) e sétimo dia (p=0,0087) no grupo experimental, confirmado pelo anti-CD34, no terceiro (p=00006) e no sétimo dia (p=0,0072).
Conclusão: o VPA determinou alterações no processo de cicatrização da bexiga, em ratos, com menor densidade de colágeno e menor atividade angiogênica, mas sem comprometer a integridade do órgão.
Palavras-chave: Ácido Valproico; Cicatrização; Proliferação de Células; Bexiga Urinária; Epigênese Genética
ABSTRACT
Purpose: to recognize the effects of valproic acid (VPA), an epigenetic drug, on the bladder healing process, in rats.
Method: twenty male Wistar rats were divided in two groups: experimental (A), treated with VPA (150mg/Kg/day), and control (B) with 0.9% sodium chloridrate. Healing was analyzed on the third and seventh days, evaluating the inflammatory reaction, collagen synthesis and angiogenesis.
Results: inflammatory reaction on the third day was minimal and acute in both groups. On the seventh day, it was subacute in both groups, moderate intensity in group A and minimal in group B (p=0.0476). Collagen III intensity, marked by immunohistochemistry, was similar in both groups. Collagen I intensity on the third day was similar in both groups, but on the seventh day it was higher in experimental than control (p=0.0476). Collagen evaluation by picrosiriusred allowed to verify that the presence of collagen III was similar in both groups (p=0.3312) on the third day, and it was higher in control on the seventh day (p=0.0015). Collagen I showed similarity on the third day (p=0.3100), and it was higher in control on the seventh day (p=0.0015). Vessel marked with anti-SMA counting showed fewer vessels on the third (p=0.0034) and seventh day (p=0.0087) in experimental group. The lower intensity of angiogenesis was confirmed with anti-CD34, on the third day (p=0,0006) and on the seventh day (p=0,0072).
Conclusion: VPA determined alterations in the bladder healing process, in rats, with lower collagen density and less angiogenic activity, but without compromising the integrity of the organ.
Keywords: Valproic Acid; Wound Healing; Epigenesis, Genetic; Cell Proliferation; Urinary Bladder
INTRODUÇÃO
A capacidade autorregenerativa é intrínseca e universal aos seres vivos1. Como principal barreira estrutural aos agressores ambientais (físicos, químicos ou biológicos) temos a pele, tecido escamoso queratinizado pluristratificado dotado de vasta comunicação celular entre si e com o corpo. A perda da interação celular desencadeia a ativação imediata de eventos moleculares homeostáticos, buscando restaurar a integridade funcional2. Assim, inicia-se a cicatrização, processo complexo que envolve migração de células inflamatórias, síntese de tecido de granulação, deposição de colágeno e maturação, além de remodelação da ferida3.
Estudos recentes sobre o ácido valpróico (AVP), medicamento utilizado no tratamento da epilepsia e do transtorno bipolar, mostraram que ele é responsável pela redução de alguns tipos de câncer e seu potencial invasivo, classificado como epigenético. O mecanismo de ação da epigenética está na mudança estrutural do DNA, resultando em mudanças na transcrição, tradução e replicação dos genes. Esse mecanismo inclui a alteração da metilação (hipermetilação ou hipometilação) de histonas e proteínas não histonas, remodelação da cromatina e alterações na expressão gênica por RNAs não codificantes (ncRNAs)4. No caso do AVP, ele atua como um inibidor seletivo de classe I das enzimas desacetilases de histonas (HDACs)5, responsáveis por remover o grupamento metil das histonas, saindo da fase S, completando a fase G2 e a divisão celular. Com a inibição das HDACs, especificamente HDAC1, HDAC2, HDAC4, com expressão aumentada no câncer de bexiga6, o DNA permanece hipermetilado, bloqueando o ciclo celular e prevenindo mitoses desordenadas7.
Estudos anteriores mostraram que o AVP interage com proteínas de migração e ligação celular, mas não na proliferação celular, por mecanismos como a proteína 53 (p53), diminuindo a atividade dessas células8. Além disso, o AVP induz trombocitopenia, principalmente em mulheres, o que pode ser devido a uma maior supressão na formação de plaquetas na medula óssea ou porque favorece sua destruição periférica por anticorpos antiplaquetários9. O AVP também induz a redução da secreção do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), interferindo na angiogênese, bem como a diminuição da expressão e atividade da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), reduzindo a formação de novos vasos10. O fibrinogênio também tem seus níveis alterados com o AVP, por reduzir os precursores de fibrina e aumentar a fibrinólise, facilitando a quebra do exsudato de fibrina e, assim, reduzindo a adesão celular10.
O tratamento do câncer utilizando a associação de quimioterapia e radioterapia com epigenética vem crescendo para diversos tipos de tumores, como bexiga11 e próstata12. O tumor de bexiga é a quinta neoplasia mais frequente em homens e a décima segunda em mulheres. Em 2012, foram registrados 165.000 óbitos em todo o mundo por essa causa13. No Brasil, a estimativa de 2018 foi de 9.480 novos casos (6.690 em homens e 2.790 em mulheres). Em 2017, foram notificados 4.355 óbitos por câncer de bexiga (3.021 homens e 1.933 mulheres) no Brasil14.
Pacientes com tumor frequentemente recebem radioterapia e quimioterapia pré-operatórias, podendo estar associadas a uma epigenética no futuro, aumentando a taxa de recuperação e diminuição da resistência da população tumoral a determinadas drogas15,16. Muitos pacientes desse grupo serão submetidos a intervenções cirúrgicas, portanto é importante estudar a influência desses medicamentos no processo de cicatrização de feridas.
O objetivo deste trabalho foi analisar a ação do ácido valpróico no processo de cicatrização da bexiga em ratos.
MÉTODOS
Os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes Brasileiras para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos e Didáticos, editadas pelo Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação, Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), em 2013, e a Lei Federal nº 11.794, de 8 de outubro de 2008. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso Animal do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná (CEUA/BIO - UFPR), em 22 de outubro de 2019, recebendo o nº 1.320, processo 23075.064161/2019-71. Para calcular o tamanho da amostra, foram utilizados dados de experimentos anteriores nesta linha de pesquisa para um erro alfa de até 0,05 (5%), poder amostral de 1 erro beta. Este cálculo fez parte do projeto avaliado pelo CEUA, com o objetivo de respeitar os 3 Rs.
Vinte ratos Wistar machos - Rattus norvegicus Albinus, Rodentia Mammalia -, de 120-140 dias de idade e pesando 462,3g ± 33,7g, provenientes do Biotério da Universidade Federal do Paraná, foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos principais: experimental (A) e controle (B), que recebeu as soluções por gavagem oral. O jejum foi mantido por 3 horas antes das intervenções, sem restrição hídrica.
O grupo experimental foi tratado com solução de Ácido Valpróico na dose de 150mg/Kg, uma vez ao dia, iniciada três horas antes do procedimento e mantida até a data prevista para a eutanásia. O grupo controle foi tratado com solução salina isotônica 0,9% (NaCl), na mesma quantidade. Esses animais foram subdivididos em lotes de acordo com a data da eutanásia. Grupo A1 (n=5) e B1 (n=5) avaliados após três dias, A2 (n=5) e B2 (n=5) avaliados após sete dias.
Os animais foram mantidos no Laboratório de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia do Setor de Ciências da Saúde da UFPR, em ciclo claro-escuro de 12 horas, temperatura (20 ± 2°C) e umidade relativa não controlada. Os animais receberam padrão alimentar comercial para a espécie e água ad libitum. Foram mantidos em caixa de propileno, cinco em cada caixa, com higienização e trocas diárias.
A anestesia e a analgesia foram realizadas por um médico veterinário. O protocolo de anestesia foi iniciado com injeção intramuscular pré-anestésica de cloridrato de quetamina 50mg/kg combinado com cloridrato de xilazina 2mg/kg. A indução anestésica foi realizada por inalação com isoflurano a 1% e manutenção com a mesma droga a 1,5% sob máscara associada a oxigênio a 100%. A analgesia foi realizada por injeção intramuscular de cloridrato de tramadol 5mg/Kg no pós-operatório imediato e oito horas após a intervenção.
Após a anestesia, os animais foram identificados e submetidos à tricotomia ventral. Em seguida, foram posicionados em mesa cirúrgica e foi feita a antissepsia com solução de iodopovidona. O procedimento cirúrgico iniciou com laparotomia mediana de 5cm e, em seguida, a bexiga urinária foi identificada. Foi realizada uma lesão de 0,5cm no fundo da bexiga. Com lupa cirúrgica, o órgão foi suturado em quatro pontos com poliglactina 910 6-0 (Figura 1). A laparorrafia foi realizada em dois planos, primeiro o plano peritônio-músculo-aponeurótico, com quatro pontos de fio contínuo de poliglactina 910, e depois a pele, com quatro pontos contínuos de fio monofilamentar de náilon.
Após a recuperação da anestesia, os animais foram recolocados em suas caixas originais até a data prevista para a avaliação.
A eutanásia foi realizada por médico veterinário, conforme protocolo descrito nas Diretrizes Práticas de Eutanásia do CONCEA, Resolução nº 37 do Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovação e Comunicação (Brasília/DF), em 15 de fevereiro de 2018.
Uma avaliação macroscópica ocorreu após a relaparotomia. Foi observada a integridade da bexiga, a presença de líquidos na cavidade abdominal, assim como a presença de aderências na linha de sutura e aspectos urinários. Em seguida, a bexiga foi ressecada, estendida em papel filtro e fixada em formol a 10% para avaliação do Patologista.
O material embebido em parafina foi bloqueado e submetido a cortes de 5 µm de espessura, que foram montados em lâminas e corados pela técnica de hematoxilina-eosina (HE) para avaliação do processo de cicatrização da ferida. Em cada lâmina foi realizada a análise patológica por meio da leitura de cinco campos. Para a análise geral, o método de Vizzotto Junior e cols. foi usado17. Os critérios observados foram qualidade da reação inflamatória, intensidade da reação inflamatória, reepitelização e angiogênese, estudados no terceiro e sétimo dias. Os dados foram classificados em graves, moderados, leves ou ausentes e transformados em variáveis quantitativas por atribuição de índices aos achados histológicos, sendo: ausente, discreto, moderado e grave.
As análises de colágeno III e colágeno I foram realizadas por imuno-histoquímica e coloração com picrosirius-red F3BA.
A técnica de tissue array ou microarray foi utilizada para as avaliações imuno-histoquímicas com o método da estreptavidina-biotina-peroxidase. Resumidamente, os cortes foram desparafinizados, hidratados e mergulhados em tampão fosfato. Após recuperação antigênica com tampão citrato e bloqueio de peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 0,3%, anticorpos monoclonais anticolágeno I, anticolágeno III, anti-CD34 e anti-α-actina de músculo liso (anti-SMA) foram aplicados em cada uma das lâminas e incubados durante a noite. Em seguida, os cortes foram lavados em tampão fosfato e um anticorpo secundário biotinilado foi adicionado e incubado por 60 minutos. Após novo enxágue, foi aplicado o complexo estreptavidina-peroxidase e a reação imuno-histoquímica foi revelada com a aplicação de diaminobenzidina. Em seguida, utilizou-se hematoxilina para contracoloração dos cortes, após desidratação e diafanização.
Para as análises, 10 campos de cada corte histológico foram lidos sobre a linha da cicatriz e foi obtida uma média.
As lâminas histológicas foram coradas com Picrosirius-red F3BA e fotografadas, onde cada imagem foi capturada sob luz normal e polarizada. Dez campos por ferida foram selecionados para as leituras das lâminas em um microscópio óptico com aumento de 40x focalizado na linha da ferida. Na análise do picrosirius-red, as fibras colágenas mais espessas e birrefringentes são vermelho-alaranjadas (colágeno I), e as fibras mais finas e dispersas, fracamente birrefringentes, apresentam coloração esverdeada (colágeno III). As micrografias foram capturadas por uma câmera Sony, CCD101. A análise das imagens foi realizada com o aplicativo Image-Plus® 4.5 for Windows® da mídia Cybernetics.
A área de cada campo lido foi de 142.901 quadrados micrômetros. Em cada uma foi calculada a porcentagem da área ocupada pelas fibras vermelha e amarela (colágeno I) e verde (colágeno III). Considerando que os demais tipos de colágenos constituem frações muito pequenas, para fins práticos apenas os colágenos I e III foram considerados como colágeno total da cicatriz. Dos dez campos lidos, obteve-se uma média, considerada para cada animal.
A leitura das seções tratadas por imunohistoquímica para reconhecimento dos colágenos I e III foi realizada por dois patologistas utilizando o método qualitativo, classificando-as em: ausente, mínima, moderada e intensa.
A análise da neovascularização foi realizada pela leitura de dez campos aleatórios dos cortes histológicos da bexiga tratada com anti-CD34 e anti-SMA, em uma área de 131.307,264 µm2, com ampliação de 10X, digitalizado com o Axio Scan.Z1 Digital Slide Scanner® (Zeiss, Alemanha). As lâminas virtuais foram avaliadas com o software Zeiss ZenLite® (Zeiss, Alemanha). Os vasos marcados com anti-CD34 e anti-SMA foram contados. A partir da leitura dos dez campos, obteve-se a média para cada animal. A contagem foi realizada com a marcação anti-CD34 e então com o anti-SMA, para maior segurança na contagem, ou seja, contra-prova.
A análise estatística foi descritiva por meio de gráficos e tabelas. O teste não paramétrico utilizado foi o teste de Fisher para tabelas 2x2, Mann-Whitney e teste t de Student, dependendo de os dados terem distribuição normal ou não. O nível de rejeição para a hipótese nula foi de p<0,05.
RESULTADOS
Durante todo o experimento, não houve mortes.
No terceiro e sétimo dias, em ambos os grupos a bexiga urinária estava intacta, não havia líquido na cavidade abdominal e a urina estava limpa e sem sangue. Aderências foram observadas nos dois tempos avaliados em ambos os grupos (Figura 2).
Aderências da linha de síntese da bexiga, observadas no terceiro e no sétimo dia. A 3.3: animal nº 3, do grupo A com 3 dias. B 3.4: animal nº 4, do grupo B com 3 dias. A 7.4: animal nº 4, do grupo A com 7 dias. B 7.4: animal nº 4, do grupo B com 7 dias.
O exame da mucosa mostrou que estava totalmente epitelizada no sétimo dia em todas as bexigas urinárias de todos os animais deste estudo.
A reação inflamatória, avaliada pelo método de Vizzotto Junior e cols. no terceiro dia foi mínima (teste exato de Fisher, p=1.000) e aguda (teste exato de Fisher, p=1.000) em ambos os grupos. No sétimo dia, foi subaguda em ambos os grupos (teste exato de Fisher, p=1.000) com intensidade moderada no grupo experimental e mínima no grupo controle (teste exato de Fisher, p= 0,0476) (Figura 3).
Fotomicrografias de cortes histológicos da bexiga de animais dos dois grupos, demonstrando reação inflamatória - HE, 200X. A 3.4: animal nº 4, do grupo A com 3 dias. B 3.4: animal nº 4, do grupo B com 3 dias. A 7.5: animal nº 5, do grupo A com 7 dias. B 7.4: animal nº 4, do grupo B com 7 dias. §Infiltrado inflamatório; #macrófagos; *plasmócitos; ?congestão vascular; ?células gigantes de corpo estranho contendo fragmentos de fio.
A intensidade do colágeno III marcada pela imunohistoquímica foi semelhante nos dois grupos nos dois tempos estudados, ausente ou mínima no terceiro dia (p=1.000) e mínima ou moderada no sétimo dia (p=0,2222). O Colágeno I estava ausente no terceiro dia em ambos os grupos, mas no sétimo dia, a quantidade moderada predominou no grupo experimental e foi mínima no grupo controle (p=0,0476).
A avaliação pelo picrosirius-red permitiu verificar que a presença de colágeno III foi semelhante em ambos os grupos (p=0,3312) no terceiro dia, e maior no grupo controle no sétimo dia (p=0,0015) (Tabela 1). O colágeno I apresentou similaridade no terceiro dia (p=0,3100) e foi maior no grupo controle no sétimo dia (p=0,0015) (Tabela 2 e Figura 4).
Fotomicrografias de cortes histológicos obtidos do terceiro e do sétimo dia, dos dois grupos. Picrosirius red 400X. A 3.3: corte histológico de bexiga do animal de nº 3, do terceiro dia, do grupo A. B 3.3: corte histológico de bexiga do animal de nº 3, do terceiro dia, do grupo B. A 7.2: corte histológico de bexiga do animal de nº 2, do sétimo dia, do grupo A. B 7.5: corte histológico de bexiga do animal de nº 5, do sétimo dia, do grupo B. As fibras coradas em verde = colágeno III e as em laranja e vermelho = colágeno I.
A intensidade da angiogênese avaliada pela contagem de vasos marcados por anti-SMA mostrou menos vasos no terceiro dia (0,0034) e no sétimo dia (p=0,0087), ambos no grupo tratado com AVP (Tabela 3 e Figura 5).
Fotomicrografias de cortes histológicos obtidos do terceiro e do sétimo dia, dos dois grupos. Imunoistoquímica, anti-SMA 200X. A 3.2: corte histológico de bexiga do animal de nº 2, do terceiro dia, do grupo A. B 3.1: corte histológico de bexiga do animal de nº 1, do terceiro dia, do grupo B. A 7.1: corte histológico de bexiga do animal de nº 1, do sétimo dia, do grupo A. B 7.3: corte histológico de bexiga do animal de nº 3, do sétimo dia, do grupo B.
A contagem de vasos marcados pelo anti-CD34 em dez campos confirmou menor número de vasos no grupo tratado, tanto no terceiro dia (p = 0,0006) quanto no sétimo (p=0,0072) (Tabela 4).
DISCUSSÃO
O valproato de sódio é convertido em ácido valpróico após a ingestão e ionizado no trato gastrointestinal em sua forma ativa. Seu metabolismo compreende três vias de oxidação em humanos, gluconidação, ß oxidação mitocondrial e enzimas da família p450 (CYP2C9, CYP2A6 e CYP2B6)7, que ocorrem em nível hepático, sua administração podendo gerar hepatotoxicidade. A farmacodinâmica do mecanismo de ação compreende aumento dos níveis de ácido γ-aminobutírico (GABA) no sistema nervoso (SN), bloqueio de canais iônicos voltagem-dependentes no SN e inibição classe I do grupo HDACs18.
O ácido valpróico foi escolhido como droga experimental devido ao potencial de inibição de várias HDACs, especialmente 1, 2 e 4. Estas são divididas em 4 classes, com ações específicas de sinalização intracelular e diferentes padrões bioquímicos. A classe I inclui HDACs 1, 2, 3 e 8; na classe IIa há HDACs 4, 5, 7 e 9; HDAC 6 e 10 estão na classe IIb; e HDAC 11 está na classe IV. Na bexiga urinária, as HDACs das classes I e IIa são as de maior atividade19.
As HDACs 1 e 2 são encontradas principalmente no núcleo da célula. São essenciais para a transcrição de proteínas como SIN3A, NuRD e CoREST, ligadas a promotores de DNA, que produzem silenciamento genético específico19. Além disso, essa classe é essencial para a proliferação e sobrevivência celular ao reprimir proteínas inibidoras do complexo CDK, como p21WAF1/CIP1 e p57KIP2. Assim, regula a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular16. Como a classe IIa, representada pelas HDACs 4, tem sua atividade restrita ao tecido local em que está inserida, requer interação conjunta com a classe I, pois a substituição da tirosina no sítio catalítico da classe IIa reduz sua ação enzimática19.
A cicatrização de feridas inclui as vias wnt20, quinase reguladora de sinal extracelular (ERK)21 e fosfatidilinusitol-3-quinase (PI3-quinase-Akt-mTOR)22, todas vias com erros frequentes em neoplasias humanas23. Wnt provou ser um regulador da organogênese e homeostase basal, enquanto ERK e PI3-Kinase/Akt estão envolvidos no processo de epitelização23. Com a administração terapêutica do AVP, ambas as vias de sinalização foram alteradas, revelando assim um possível alvo para tratamento futuro. Na fase de proliferação celular, o AVP interage com a via da ß-catenina, moléculas que, em altas concentrações, induzem o aumento das mitoses, a regulação da multiplicação das células mesenquimais, a motilidade e a hiperplasia celular das cicatrizes23. Além disso, a ß-catenina interage na transformação do fator de necrose tumoral-ß1 (TNF-ß1), aumentando seus níveis que participam da indução da diferenciação dos miofibroblastos23. O aumento dos níveis de ß-catenina ocorre pela interação direta do AVP na proteína Ras, mostrando um alvo viável na cicatrização24.
Além disso, os inibidores de HDACs podem diminuir a hipóxia25 e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), induzindo a angiogênese26-27. A formação de novos vasos compreende proliferação endotelial, migração e organização de redes estruturais que formam o tubo vascular, ambas as fases moduladas pela geração de óxido nítrico (NO)28. In vitro, o AVP demonstrou inibir a proteína endotelial óxido nítrico sintase (eNOS), diminuindo diretamente os níveis de NO29-30.
Com a redução da síntese de NO, pela diminuição da guanilato-mono fosfato ciclase plasmática (cGMP) pelo AVP e a redução da eNOS, o VEGF permanece baixo, comprometendo a angiogênese29. O valproato interage inibindo diretamente a angiogênese nas células endoteliais, reduzindo a taxa de mitose dessas células e seu crescimento33. Sabe-se também que a diminuição da angiogênese no urotélio pode ser causada pela ação do AVP aumentando a expressão da trombospondina-1 (TSP1)34.
TSP1 é inibidora natural da angiogênese presente em células tumorais, como no câncer de bexiga. A diminuição da expressão de TSP está diretamente ligada à capacidade de induzir novos vasos, o que é necessário para a expansão clonal de células cancerígenas e metástases. Além disso, há interação da TSP1 com a expressão de VEGF, molécula responsável pelo crescimento endotelial35. A ação antiangiogênica da TSP1 é mediada no receptor CD36 nas células endoteliais, iniciando assim uma cascata de apoptose36. A continuação desta linha de pesquisa está focada no reconhecimento dos efeitos da angiogênese.
A presença de colágeno III, que é mais fibrilar, quando analisada pela imunomarcação, foi mínima no dia 3 em ambos os grupos e permaneceu semelhante no dia 7 (p=0,2222). Quando analisado pelo picrosirius-red sob luz polarizada, houve confirmação para o terceiro dia (p=0,3312), mas no sétimo dia, observou-se maior densidade no grupo controle (p=0,0015).
A síntese de colágeno I, quando analisada por imunomarcação, neste estudo indicou evolução favorável aos sete dias de experimento no grupo tratado com ácido valpróico (p=0,0476). No entanto, esse valor ficou muito próximo do limite para rejeição da hipótese nula e, como o tamanho da amostra foi pequeno, não se pode afirmar com certeza. Na aplicação tópica in vivo, Lee e cols. observaram aumento dos níveis de α-actina do músculo liso (α-SMA), colágeno I e III na ferida, diminuindo a distância entre as bordas da cicatriz mais rapidamente--. O aumento de colágeno também foi observado por Huang e cols. estudando a interação de AVP e placas ateroscleróticas37. Para melhor percepção dos resultados, optou-se pelo uso da coloração com picrosirius-red e exame sob luz polarizada. No terceiro dia, havia colágeno I em pequena quantidade em ambos os grupos (p=0,3100). No entanto, passou a existir em maior densidade no grupo controle no sétimo dia (p=0,0015).
Em cultura de células, a redução na deposição de colágeno pode ser explicada pela supressão das moléculas de adesão celular α e β integrinas, que são necessárias para a adesão e deposição celular. É assim que o AVP atua na redução da metástase no câncer de bexiga, regulando negativamente as proteínas da superfície celular, bem como diminuindo as proteínas de adesão, diminuindo até mesmo a motilidade celular. Também pode ser usado como adjuvante em terapias oncológicas14.
Além disso, em cultura, Humphrey e cols. observaram redução do colágeno após tratamento com AVP, mostrando diminuição do pró-colágeno I após 24 horas de imersão38. Isso também foi observado por Fuller e cols. com cultura de fibroblastos dérmicos, com redução de 28% em relação ao controle após 24 horas39. A mesma redução de colágeno foi observada nos estudos de Rishikof e cols., pela diminuição da síntese de mRNA em fibroblastos pulmonares com o tratamento de 24 horas40.
Estudando a cultura da bexiga com AVP, Hodges e cols. demonstraram diminuição da expressão do gene do colágeno em células musculares, com redução da expressão do mRNA dos colágenos tipos I e III41. Além disso, os estudos de Rombouts e cols. e Mann e cols. demonstraram o potencial antifibrogênico do valproato pela hiperacetilação das histonas 3 e 442-43.
Pensando na migração celular, a administração de AVP gera diminuição da adesão celular, principalmente das células tumorais, bem como modificação das integrinas da superfície celular, proteínas necessárias para a invasão metastática do tumor20. No câncer de bexiga, houve redução significativa da proliferação celular entre G0 e G1, diminuição da ativação da via Akt-mTOR e inibição do crescimento celular16. Além disso, houve a confirmação de maior reação inflamatória com o uso da droga, pela ação do AVP alterando a expressão da proteína p21, aumento da proteína p27, redução de reguladores do ciclo celular, como ciclina B e CDK1, além da interleucina 6 (IL-6) e TNF44-45. Vale ressaltar que, neste estudo, a análise da reação inflamatória foi semelhante nos dois grupos no terceiro dia. No entanto, no dia 7, foi moderada no grupo experimental e mínima no grupo controle (p=0,0476). Esse nível de significância está muito próximo do limite adotado, e o pequeno tamanho da amostra não permite afirmar com certeza que há maior intensidade no grupo experimental. Em ambos os grupos, foi aguda no terceiro dia e subaguda no sétimo.
O silenciamento gênico também foi demonstrado após o tratamento com AVP, pela metilação das ilhas de nucleotídeos citosina-fosfato-guanina (CpG) presentes no sítio promotor de genes codificadores de proteínas, inativando essas células. Além disso, essas alterações podem ser herdadas após a replicação do DNA, alterando a estrutura da cromatina das novas cópias, mantendo o padrão de silenciamento, como demonstrado em certos tipos de câncer e fibrose43, além da possibilidade de restaurar a função correta dos genes no tratamento de casos de fibrose hepática42. Neste estudo, a análise da reepitelização da mucosa não mostrou diferenças significativas nos dois tempos estudados.
Havia menos vasos no grupo tratado com AVP. De acordo com Michaelis e cols., este efeito pode ser atribuído à atividade direta do AVP nas células endoteliais. Esses autores observaram inibição da proliferação, migração e formação de tubos de células endoteliais33. Engl e cols. observaram AVP inibindo a angiogénese in vivo usando o ensaio de membrana corioalantóica de frango e em tampão matrigel de camundongo46.
Para Cinati e cols., a inibição da angiogênese pode ser indireta, pois o tratamento de células de neuroblastoma com ácido valpróico 1mM causou aumento da expressão das moléculas antiangiogênicas trombospondina-1 e activina A47. Além disso, Zgouras e cols. mostraram que o tratamento com AVP da linhagem celular de adenocarcinoma de cólon Caco-2 causou redução significativa na secreção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), bem como regulação negativa do mRNA de VEGF e expressão de proteínas48.
A síntese da matriz intersticial e de proteínas fibrosas como o colágeno é dependente da oferta de oxigênio, o que explicaria a menor densidade de colágeno nas bexigas dos animais do grupo tratado com AVP.
Em uma análise resumida, a reação inflamatória foi muito semelhante nos dois grupos. A marcação do colágeno pelo imunomarcador apresentou pequena quantidade, sendo a maior no grupo experimento de colágeno tipo I no sétimo dia, em análise qualitativa. No entanto, a análise do picrosirius-red, de viés quantitativo, permitiu o reconhecimento de maior densidade de colágeno tipo III e colágeno tipo I no sétimo dia no grupo controle. Deve-se considerar que um aumento no tamanho da amostra pode dar maior confiança aos resultados. Ainda é importante analisar a interferência do AVP na angiogênese, o que foi feito paralelamente a este estudo por outro pesquisador do mesmo grupo.
No entanto, embora o AVP possa diminuir a intensidade do processo de cicatrização, deve-se admitir que não o faz de forma a levar a riscos. Não foi observada deiscência da síntese da bexiga, órgão íntegro e protegido por aderências, além da urina límpida e de aspecto normal. Isso nos permite pensar que, quando o AVP é utilizado para auxiliar no tratamento de neoplasias e é necessária a intervenção cirúrgica, ela pode ser feita com segurança.
CONCLUSÃO
O AVP determinou alterações no processo de cicatrização da bexiga em ratos, com menor densidade de colágeno e menor atividade angiogênica, mas sem comprometer a integridade do órgão.
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
28 Nov 2022 -
Data do Fascículo
2022
Histórico
-
Recebido
20 Jun 2022 -
Aceito
10 Ago 2022
