Parâmetros reacionais para a síntese enzimática do butirato de butila em solventes orgânicos

Reactional parameters for enzymatic synthesis of butyl butyrate in organic solvent

PARÂMETROS REACIONAIS PARA A SÍNTESE ENZIMÁTICA DO BUTIRATO DE BUTILA EM SOLVENTES ORGÂNICOS¹

CASTRO², Heizir F.; OLIVEIRA², Pedro C. & SOARES², Cleide M. F.

RESUMO

A síntese orgânica catalisada por enzimas envolve um mecanismo complexo dependente do tipo de substrato, enzima, solvente orgânico e teor de água no meio reacional. Neste trabalho foi estudado a influência de alguns desses parâmetros no rendimento da esterificação do butanol com ácido butírico, utilizando uma preparação enzimática comercial de lipase. A polaridade e natureza do solvente, bem como a razão molar entre o butanol e ácido butírico, foram considerados os fatores que mais influenciaram o desenvolvimento dessa síntese enzimática.

Palavras-chave: esterificação enzimática, solvente orgânico, planejamento experimental.

SUMMARY

REACTIONAL PARAMETERS FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF BUTYL BUTYRATE IN ORGANIC SOLVENT. The organic synthesis catalyzed by enzymes is a complex function of substrate concentration, water concentration in the liquid phase, enzyme and organic solvent properties. In this work the influence of some parameters on the esterification of butanol with butyric acid was investigated, using a commercial lipase preparation. The polarity and nature of the solvent and also the substrate mole ratios played an important role in the performance of this enzymatic synthesis.

Keywords: enzymatic esterification, organic solvent, factorial design.

1 — INTRODUÇÃO

Recentemente um grande número de trabalhos têm sido desenvolvidos para elucidar as propriedades e o comportamento de enzimas, em meios não aquosos [3, 9, 11, 13]. Consequentemente, o número de rotas de sínteses orgânicas que incorporam um passo enzimático torna-se crescente [14, 19, 23, 24]. Bem ilustrativo são os processos que utilizam enzimas lipolíticas (lipases) como catalisadores para um largo espectro de reações [6, 12, 18]. Entre esses, destaca-se a obtenção de ésteres por via enzimática por oferecer, além das vantagens tradicionais, a possibilidade de classificar inúmeros ésteres de grande importância do setor alimentício como produto natural [8, 16, 20].

Neste trabalho será tratado apenas a esterificação de álcool com ácidos, embora ésteres também possam ser obtidos por interesterificação [6, 20, 21]. Como modelo de estudo foi adotado a obtenção do butirato de butila, um importante éster aromatizante de grande aplicação nas indústrias alimentícias, empregando uma preparação comercial de enzima imobilizada (Lipozyme). A seleção do solvente foi baseada na influência do caráter hidrofóbico ou hidrofílico dos solventes orgânicos, medido como log P [15] e no grau de esterificação alcançado. Para o estabelecimento das condições adequadas desta síntese foi empregado o planejamento de experimentos [1, 2], tomando por base estudos anteriores referentes a obtenção de butiratos por via enzimática [4-7]. Complementando este estudo, foi também verificado o efeito da estrutura do álcool no desempenho do processo através da comparação dos rendimentos alcançados nas reações de esterificação do n-butanol, 2-butanol e 3-butanol com ácido butírico.

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Materiais

Preparação comercial de lipase imobilizada em resina de troca iônica (EC. 3.1.1.3., Lipozyme TM²⁰, obtida por fermentação submersa de Mucor miehi) manufaturada pela Novo Nordisk/ Dinamarca [21]. Foram utilizados como agente dessecante peneira molecular (Aldrich 4 A⁰) e como reagentes n-butanol, 2-butanol, 3-butanol (Merck) e ácido butírico (Vetec). Foram testados os seguintes solventes: acetonitrila, tetracloreto de carbono, clorofórmio, tolueno, ciclohexano, hexano e heptano. Todos os solventes foram de grau analítico e desidratados previamente com peneira molecular [5].

2.2 – Procedimento geral das esterificações

As esterificações foram conduzidas em reatores fechados de 100mL contendo 20mL de substrato numa concentração fixa de butanol (0,3M) e concentrações apropriadas de ácido butírico (0,15 a 1,2 M) diluídas em solvente orgânico, dependendo da finalidade do experimento. As misturas foram incubadas com Lipozyme numa proporção variável entre 10 a 30 % em relação ao peso total de reagentes no meio reacional. Com exceção dos testes de seleção de solventes efetuados numa temperatura de 30°C, todos os outros experimentos foram realizados a 45°C, sob agitação constante de 150 rpm, durante 24 horas.

2.3 – Métodos Analíticos

A concentração de n-butanol foi medida por cromatografia fase gasosa (Cromatógrafo GC 37), equipado com uma coluna empacotada (6ft S# DEGS WHP 80/100 mesh), operando numa temperatura de 60°C e empregando hexanol como padrão interno. O teor de ácido butírico foi determinado através da titulação de alíquotas diluídas em etanol, empregando solução alcoólica de KOH 0,02N e fenolftaleína como indicador. O grau de esterificação foi expresso em percentual molar do butanol ou ácido butírico consumido, empregando a equação 1:

onde:

C₀ = concentração inicial do álcool ou ácido

C = concentração final do álcool ou ácido em um determinado tempo.

A concentração de água nas fases líquida e sólida foi medida por um titulador automático Karl Fisher (Modelo Mettler DL 18). Os coeficientes de partição da Lipozyme/reagente e Lipozyme/produto foram estimados de acordo com a metodologia descrita por DIAS et al. [10], empregando a seguinte equação:

onde:

_p = coeficiente de partição do composto,

C₀ = concentração do composto na fase orgânica,

C = concentração do composto após contato com Lipozyme,

V₀ = volume total (fase orgânica + Lipozyme),

V = volume da fase orgânica.

Para estimativa do volume da Lipozyme (V – V₀), foi efetuado uma curva de calibração do volume vs. massa de Lipozyme.

2.4 – Planejamento Experimental

A influência de diversos fatores no rendimento da esterificação enzimática do butanol, foi verificada através de um planejamento fatorial constituído de 2³ experimentos sem replicata. A escolha dos fatores e dos níveis foi baseada em estudos preliminares [4-7], sendo considerado para este sistema, a influência de três variáveis de controle: razão molar (A), agente dessecante (B) e concentração de lipase (C) em uma variável resposta específica do processo (conversão do n-butanol). Os seguintes níveis foram adotados: razão molar entre n-butanol (BUT) e ácido butírico (AcBuT) em (1:1/2 e 1: 4), concentração de agente dessecante (0 e 20%) e concentração de enzima (10 e 30%). A matriz do experimento é mostrada na Tabela 1, com os valores reais empregados nas sínteses. Todos os experimentos foram efetuados de maneira randômica. Três experimentos foram realizados no ponto central, para estimativa do erro experimental. Os resultados foram analisados através da técnica da Análise de Variância (ANOVA) empregando o Programa Statgraphics versão 2.7.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Efeito do solvente no grau de esterificação

O logaritmo do coeficiente de partição de um composto entre n-octanol e água (log P), tem sido largamente empregado para predizer o rendimento de uma reação, em presença de um determinado solvente. Conforme modelo proposto por LAANE et al. [15], a reação enzimática se processa em maior extensão na presença de solventes mais hidrofóbicos (log P > 3,0) e em menor extensão em presença de solventes hidrofílicos (log P < 2,0). Entretanto, atualmente existe uma tendência de utilizar critérios adicionais, tais como: densidade, viscosidade, toxicidade, ponto de ebulição entre outros, para garantir um adequado grau de biocompatibilidade do solvente, com o biocatalisador [17].

Neste trabalho, foi efetuada uma triagem preliminar em seis solventes baseada na influência do caráter hidrofílico ou hidrofóbico (medido como log P) e no grau de esterificação alcançado. A relação entre atividade e log P, nas condições experimentais empregadas, não foi plenamente obedecida (Figura 1). Solventes com valores próximos de log P (clorofórmio e tolueno) e (ciclohexano e tetracloreto de carbono), forneceram graus de esterificação largamente divergentes.

Resultados semelhantes foram reportados por RESLOW et al. [22], que associaram esse fato aos valores diferentes de solubilidade desses compostos em água, que não são função direta do valor de log P. A estrutura química do solvente (alcano, alifático, aromático, etc.) também tem sido apontada como responsável pelas diferenças do comportamento da enzima em meios orgânicos.

Tomando por base essas considerações e os resultados obtidos, foram selecionados inicialmente, dois solventes de natureza química similar (heptano e hexano) para condução dos demais experimentos. Entretanto, devido ao baixo ponto de ebulição do hexano (68,5°C), altas taxas de evaporação do meio reacional foram observadas, quando a reação foi conduzida numa temperatura superior a 40°C (dados não mostrados).

Considerando que a temperatura ótima de atuação da Lipozyme é da ordem de 70°C , segundo dados fornecidos pelo fabricante [21], optou-se pela continuidade dos testes com heptano que permite a utilização de uma temperatura de reação mais próxima da temperatura de trabalho da Lipozyme, sem alterar a composição do meio reacional, por perdas de evaporação.

3.2 – Coeficientes de partição

Os valores referentes aos coeficientes de partição (Lipozyme/ reagente e Lipozyme/ produto) mostrados na Tabela 2, sugerem que o éster formado é transferido para a fase orgânica, direcionando desta forma, a reação no sentido desejado.

3.3 – Determinação dos parâmetros reacionais

O fator mais significativo na conversão do n-butanol foi a razão molar; sendo o resultado positivo representado pelo nível alto (+) razão molar 1:4 (Tabela 3). Dentro da região experimental avaliada, a concentração de agente dessecante e enzima foram os fatores menos significativos na conversão de n-butanol, no entanto, devem ser operados no nível alto (+).

Para o cálculo dos efeitos da interação, foi utilizada a matriz estendida para as interações dos três fatores envolvidos, o que forneceu interações até de 3ª ordem, ou seja, AB, AC, BC e ABC (Tabela 4). Os sinais das colunas de interação foram obtidos através da multiplicação dos sinais de cada fator da interação no experimento em questão.

Os valores de interação são menos influentes que os efeitos principais, contudo é importante observar a interação AB, onde ficou evidenciado que o controle e manutenção de baixos teores de água durante o progresso da esterificação favorece a obtenção de altos rendimentos, particularmente nas esterificações conduzidas em nível alto para a variável independente A (razão molar entre BUT: AcBUT de 1:4). Esses dados foram confirmados através da análise de variância (Tabela 5).

Como o planejamento experimental foi efetuado em apenas dois níveis, os dados obtidos resultaram numa visão um tanto imprecisa da verdadeira relação funcional, ligando a resposta aos fatores que influenciam a síntese do butirato de butila. Para as condições testadas, foi verificado que esta síntese é favorecida para concentrações iniciais de ácido butírico 4 vezes superior em relação as concentrações iniciais de n-butanol. No entanto, um excesso dessa magnitude pode acarretar a obtenção de um produto (butirato de butila) altamente acidificado, tornando necessário, portanto, a inclusão de tratamentos posteriores de purificação, como por exemplo, neutralização. Considerando que a conversão do n-butanol depende da razão molar dos reagentes, foram realizados novos experimentos para verificar a possibilidade de se utilizar razões molares inferiores a pré-estabelecida (1:4).

Conversões superiores a 90% podem ser obtidas a partir de concentrações iniciais de ácido butírico de 0,5 M, ou seja, numa razão molar entre n-butanol e ácido butírico de 1:1,6 (Figura 2). O desempenho satisfatório da síntese do butirato de butila nas condições otimizadas é mostrada através do perfil da curva de consumo dos reagentes durante a esterificação de n-butanol (0,3M) com ácido butírico (0,5M) em presença de agente dessecante (20% p/v) e empregando 30 % (p/p) de Lipozyme, numa temperatura de 45°C (Figura 3).

3.4 – Efeito da estrutura do álcool

Tendo sido estabelecido as condições otimizadas desta síntese, foi ainda verificado a especificidade da preparação de lipase imobilizada frente a diferentes estruturas do álcool, através do monitoramento das reações de esterificação do n-butanol, 2-butanol e 3-butanol com ácido butírico. O grau de esterficação alcançado para o n-butanol foi muito maior que os verificados para as reações conduzidas com o 2-butanol e 3-butanol (Tabela 6). Taxas de esterificação superiores a 80% foram obtidas para o n-butanol, enquanto que, conversões de apenas 16% e 2,9% foram alcançadas para o 2-butanol e 3-butanol, respectivamente.

Nesta série de experimentos é importante observar que os rendimentos das esterificações foram calculados em função do consumo de ácido butírico. O controle e manutenção de baixos teores de água durante o progresso das esterificações foram dificultadas somente nas reações realizadas com 2-butanol e 3-butanol. Isto influenciou não só o rendimento destas reações, como também favoreceu sua reversibilidade, sendo constatado a hidrólise de uma pequena proporção dos ésteres formados.

4 — CONCLUSÕES

Neste trabalho foi empregado um sistema constituído de butanol, ácido butírico, solvente e Lipozyme (preparação comercial de lipase imobilizada em resina de troca iônica) para determinar os efeitos de diversos parâmetros na formação de butirato de butila. O solvente heptano foi selecionado por apresentar total compatibilidade com o sistema reacional estudado. Os valores encontrados referentes aos coeficientes de partição (Lipozyme/ reagentes e Lipozyme/ produto), sugerem que o éster formado é transferido para a fase orgânica, direcionando desta forma, a reação no sentido desejado.

O uso do planejamento fatorial mostrou ser uma ferramenta importante para otimizar a síntese do butirato de butila. De acordo com o estudo efetuado, altas conversões do n-butanol podem ser obtidas, empregando uma concentração elevada de lipase (30% em relação ao peso total dos reagentes), em presença de agente dessecante (20% p/v) e numa razão molar entre [butanol]/ [ácido butírico] de 1:1,6. A ramificação na cadeia do butanol nas posições C2 e C3 decresceu a taxa de esterificação em aproximadamente 80% e 95% para o 2-butanol e 3-butanol, respectivamente.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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² FAENQUIL- Faculdade de Engenharia Química de Lorena/ Departamento de Engenharia Química/Caixa Postal 116, 12600-000, Lorena, São Paulo.

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Recebido para publicação em 01/07/97. Aceito para publicação em 27/10/97.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Recebido
  01 Jul 1997
• Aceito
  27 Out 1997