Distribuição dos fitatos em farelo de arroz estabilizado e tratado com fitase exógena

Phytate distribution in stabilized rice bran treated with exogenous phytase

Distribuição dos fitatos em farelo de arroz estabilizado e tratado com fitase exógena¹

Florencia CÚNEO², J. Amaya-FARFAN²,^*, Francisco CARRARO²

RESUMO

Fitase exógena purificada foi utilizada na tentativa de hidrolisar o ácido fítico e estudar a redistribuição das frações polifosfato do m-inositol por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Depois de 24h de hidrólise, a destruição dos fitatos totais mediante este processo alcançou 37%, o IP₆ continuou sendo a fração predominante (81%), enquanto que as frações IP₄ e IP₅ permaneceram em porcentagens insignificantes (0,3 e 0,5%, respectivamente). Conclui-se que a escassa variação no perfil de distribuição das frações polifosfato são indicativas de um mecanismo de ação hidrolítica em série para esta enzima, ao passo que se confirma a baixa eficiência de fitase exógena no farelo estabilizado.

Palavras-chave:

fitato; fitase; mecanismo; farelo de arroz; alimentos funcionais.

SUMMARY

Phytate distribution in stabilized rice bran treated with exogenous phytase.

Hydrolysis of phytic acid with purified exogenous phytase was attempted and the evolution of the

m-inositol polyphosphate pattern followed by HPLC. After 24h of hydrolysis, reduction of total phytates by this process amounted to 37%, the hexaphosphate (IP

₆) continued to be the predominant fraction (81%), whereas the IP

₄ and IP

₃ components remained negligible (0.3 and 0.5%, respectively). We conclude that the minor variations observed in the distribution profile are indicative of a serial-type enzyme mechanism, while the inefficient action of exogenous phytase on the stabilized rice bran is confirmed.

Keywords:

rice bran; phytic acid; functional food; phytase; mechanism.

1 – INTRODUÇÃO

Ácido fítico ou mio-inositol hexafosfato (C₆H₁₈O₂₄P₆) é um componente natural de toda semente, constituindo de 1 a 3% do peso nas leguminosas e cereais, o que responde por 60 a 90% do fósforo total [22]. Os fitatos têm várias funções fisiológicas importantes para a planta durante o seu ciclo de vida, incluindo o armazenamento de fósforo e cátions, que fornecem matéria-prima para a formação das paredes celulares, após a germinação da semente. Além disso, o ácido fítico protegeria a semente contra o dano oxidativo durante a sua armazenagem [7, 8, 18].

Segundo O’DELL et al. [22], 85% do ácido fítico do arroz localiza-se no pericarpo, 13% no germe e 2% no endosperma. Outros dados mencionam, para farelo de arroz gorduroso, valores de fitatos totais da ordem de 3,65g e 4,48g, por 100g [3, 24], e de 6,25 a 6,9g, por 100g, para o farelo desengordurado [6, 31], sendo que o ácido fítico (IP₆) naturalmente presente no farelo de arroz representa de 85 a 92% dos fitatos totais [17, 26].

Numerosas são as publicações que ressaltam as propriedades antinutricionais dos fitatos. O ácido fítico, em pH neutro e alcalino, forma complexos insolúveis com cátions di e polivalentes, comprometendo a biodisponibilidade de certos minerais, principalmente zinco, cálcio, ferro e cobre [5, 6, 9, 14, 19, 21, 25], ao passo que, mais recentemente, diversas qualidades benéficas vêm sendo apontadas para estes compostos [12].

Diversos trabalhos mostram que é possível ativar a fitase endógena do farelo, ocasionando a eliminação quase completa do ácido fítico [2, 20, 27, 28], o qual geraria fosfato inorgânico livre, mais o inositol, passando pelos correspondentes produtos intermediários. Esse processo, entretanto, requer a utilização da matéria-prima na sua forma virgem; ou seja, farelo não estabilizado por tratamento térmico, emprego de reatores, inclusão de passos de hidratação, incubação, seguidos de desidratação, posterior desengorduramento e estabilização. É evidente que o processo resultaria excessivamente caro, para um produto de tão baixo valor de mercado (aprox. US$ 100/ton). Alternativamente, porém, para preservar a atividade da enzima endógena, o desengorduramento poderia ser efetuado por extração inicial do óleo com solvente, evitando-se o uso de temperaturas elevadas sem, entretanto, haver garantia de diminuir significativamente os custos.

A forma usual de aproveitar o farelo, subproduto dos engenhos de arroz, é extraindo-se o óleo por expressão e aquecimento e gerando o farelo estabilizado, como novo subproduto. O processo de estabilização, então, compreende a inativação enzimática e desengorduramento simultâneos, com aplicação de vapor e prensagem, sendo que alguns autores têm sugerido a possibilidade de ocorrer desfosforilação parcial dos ésteres de inositol durante o mesmo [16, 23, 29], embora trabalhos anteriores indiquem que o processo de estabilização não altera o conteúdo de fitato total [6].

Visando a mais ampla utilização do farelo de arroz, seja como fonte de proteínas, vitaminas, minerais e fibra, ou como fonte de fitatos, a dosagem pormenorizada dos polifosfatos de m-inositol, o objetivo do presente trabalho compreendeu a verificação de possível alteração do perfil de polifosfatos do farelo de arroz estabilizado, após tratamento com fitase exógena.

Neste trabalho, utilizou-se a técnica de CLAE para determinar as frações IP₆, IP₅, IP₄, e IP₃ em farelo de arroz estabilizado (FE) e no produto após processo de remoção dos fitatos com fitase exógena comercial (FD). Via de comparação, os fitatos totais foram determinados no farelo de arroz estabilizado pelo método colorimétrico de LATTA & ESKIN [15].

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Matéria prima

Farelo de arroz estabilizado (FE, doação da IRGOVEL, Indústria Riograndense de Óleos Vegetais Ltda., Pelotas, RS, Brasil), foi moído em moinho de facas (42mesh), conservado em sacos plásticos a 12° C negativos, até a sua utilização. O processo de estabilização, que consiste basicamente na extração do óleo e concomitante inativação térmica das enzimas oxidativas do farelo, foi feita por processo da própria indústria, que consta de várias etapas: seleção e limpeza do farelo, padronização da umidade, prensagem no formato de pellets para extração do óleo, remoção do resíduo com hexano aquecido a 50° C e, por último, aplicação de calor direto e indireto, para eliminação do hexano.

2.1.1 - Processo de desfitatização

Para a obtenção de farelo de arroz desfitatizado (FD), lotes de FE foram misturados com água destilada (1:4) e adicionou-se fitase (Sigma, de arroz, P-1259), na concentração de 1,13g/100g de FE e parabenos (ChemyUnion; 0,1mL/100mL), como preservante. O pH foi ajustado com HCl para 5,15 e o sistema incubado em banho-maria, na temperatura de 55° C, com agitação mecânica contínua; condições de pH e temperatura ótimas para fitase [29]. Após 24h, o material obtido foi resfriado, congelado e liofilizado.

2.2 – Determinação de fitatos totais

Aproximadamente 2g de FE e FD, foram suspensos em 40mL de HCl 0,65N, em temperatura ambiente, com agitação mecânica contínua. Após um período de 1,5h, o extrato foi centrifugado a 17300´g por 30 minutos e, imediatamente depois, alíquotas do sobrenadante foram diluídas em água desionizada (1/25mL) e passadas em coluna de vidro contendo 0,5g de resina AG 1-X4 (Bio-rad, 100-200 mesh), segundo as recomendações de HARLAND & OBERLEAS [11]. Para remoção do fósforo inorgânico e outros compostos interferentes, NaCl 0,1M foi passado inicialmente. Os fitatos retidos na coluna foram eluídos da resina com NaCl 0.7M. Seguindo as recomendações de LATTA & ESKIN [15], parte do eluato (3mL) foi combinado com 1mL de reagente de Wade (cloreto férrico + ácido sulfosalissílico), agitado em vortex e centrifugado. A absorbância no sobrenadante foi lida em Espectrofotômetro a 500nm.

2.3 – Determinação de tri-, tetra-, penta-, e hexafosfatos de inositol por CLAE

2.3.1 - Cromatógrafo

As determinações foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência, provido de bomba (Varian 9012), forno para coluna (Varian, Mistral), utilizando o programa Star Chromatography Workstation e detetor de índice de refração (Varian Star 9040 IR). A coluna foi de fase reversa, 100 RP-18 (12,5cm, Hibar, Merck), com esferas de 5mm de diâmetro. A fase móvel consistiu de solução 0,05M de ácido fórmico:metanol (49:51; Merck, grau CLAE), adicionada de 1,5mL/100mL de hidróxido de tetrabutilamônio (TBA-OH; Fluka, 40% em água). O pH da solução foi ajustado para 4,3 adicionando-se ácido sulfúrico 9M. A fase móvel foi filtrada através MF-Millipore (0,45mm), sob vácuo e sonicada por 20 min. Todas as soluções foram preparadas em água ultrapura (18,2MW ).

2.3.2 - Curva de calibração

Padrão de ácido fítico, (hexafosfato de m-inositol, Sigma, P-3168) foi utilizado para estabelecer as condições cromatográficas e a linearidade em relação às áreas dos picos e as concentrações. Injeções de soluções contendo 2, 4, 6, 8, 12 e 16mg/mL de ácido fítico em água, foram estudadas considerando o título de 893mg de ácido fítico, por grama de sólido do padrão (valor calculado pela determinação prévia de fósforo, método de digestão seca [1]). A curva de calibração se apresenta na Figura 1.

2.3.3 - Preparação das amostras

Aproximadamente 0,5g de FE e FD foram suspensos em 20mL de HCl 0,5M, em temperatura ambiente, com agitação mecânica vigorosa e contínua. Após 2h, o extrato foi centrifugado a 17300´g durante 30 minutos. Imediatamente depois, o sobrenadante foi levado a –5^oC por uma noite e filtrado sob pressão em seringas plásticas de 20mL, usando MF-Millipore (0,22mm). Os fosfatos de inositol foram separados e concentrados utilizando uma modificação do método de GRAF & DINTZIS [10]. Primeiramente, o filtrado foi concentrado até secura em rotaevaporador, utilizando banho de água a 40° C e bomba de vácuo. O extrato foi dissolvido em 20mL de HCl 0,025M e eluído em coluna de vidro contendo 0,5g de resina AG 1-X4 (Bio-rad, 100-200 mesh), seguido de 10 e 5mL de HCl 0,025M. Os fitatos foram removidos da coluna com dez porções de 1mL de HCl 2M. Este eluato foi coletado e novamente evaporado em temperatura controlada até a secura e diluído em 1mL de água ultrapura.

2.3.4 - Condições para CLAE

O equipamento foi pré-condicionado durante 1,5h com fase móvel, sendo mantido na temperatura constante de 28° C. Fizeram-se, injeções de 20mL, com um fluxo de 1,5mL por min. A fração hexafosfato, foi identificada e quantificada usando a curva de calibração. As frações IP₅, IP₄ e IP₃ foram identificadas pelos tempos de retenção da literatura [4, 16, 26] e quantificadas usando o IP₆ como padrão interno e aplicando fatores de correção para as diferenças das áreas [26]. Todas as determinações foram realizadas em triplicata.

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

O teor médio de fitatos totais no farelo estabilizado, determinado por método colorimétrico, alcançou 7,53 (± 0,66)g por 100g, valor próximo do encontrado por DOMENE [6]. Comparando os valores obtidos pelo método colorimétrico com aqueles obtidos por outro autor para farelo desengordurado sem tratamento térmico [30], confirmou-se que o processo de estabilização do farelo não traz conseqüência significativa para o teor de fitatos. Além disso, o resultado obtido pelo método colorimétrico de fitatos totais mostrou concordância com a somatória das frações determinadas pelo método de CLAE.

O IP₆ no FE alcançou 6,8g por 100g, o equivalente a 84,8% do teor total, enquanto que o percentual para a fração pentafosfato não superou 1,2. Os fosfatos de inositol encontrados em grãos usualmente contêm ao redor de 90% do inositol na forma hexafosfórica, correspondendo os restantes 10% à somatória dos penta-, tetra- e trifosfatos. Os perfis cromatográficos dos diversos fosfatos de m-inositol encontrados no FE e o produto desfitatizado (FD) são apresentados na Figura 2.

No farelo desfitatizado, a quantidade de ácido fítico diminuiu para 4,3g por 100g, o que correspondeu a 63,3% do valor encontrado no FE; ou seja, obteve-se apenas 37% de desfitinação em 24h de hidrólise. Este valor foi pequeno quando comparado aos 70% obtidos por TANJENDJAJA et al. [29] com fitase endógena ativada em farelo de arroz, ou os 50% conseguidos em farelo de trigo com fitase exógena, após inativação da enzima endógena por autoclavagem [27].

Na Tabela 1 são apresentadas as frações dos ésteres de inositol para os farelos FE e FD. Os di- e monofosfatos não aparecem nos cromatogramas.

Observou-se que as frações de IP₄ e IP₃ nos farelos foram desprezíveis e que o perfil de distribuição mudou muito pouco após a ação da enzima. Estes resultados foram consistentes ainda com outros relatados em farelos de trigo tratados com fitase microbiana [13]. Foi notado, no entanto, que a relação IP₆/IP₅ mostrou diminuição de 5,8, antes do tratamento, para 4,4 após a desfitatização (Tabela 1). Essa variação é muito pequena para ser explicada pela maior probabilidade da enzima colidir ao acaso com as formas do substrato presentes em maior concentração. Por outro lado, as diferenças de perfil entre FE e FD foram relativamente maiores para a IP₃ do que nas outras frações, sugerindo um pequeno acúmulo desta fração minoritária. Os resultados evidenciam, portanto, que o tratamento do FE com fitase comercial não conduz a um grande incremento das frações menores, às expensas das maiores, como seria esperado se o mecanismo de ação da enzima seguisse o modelo de colisões ao acaso.

Dessa forma, dada a superioridade numérica das moléculas nas frações IP₆ e IP₅ e o perfil de concentrações decrescente, de IP₆ para IP₃, pode ser proposto que a ação da enzima não se dá por colisões sucessivas ao acaso com diversas moléculas do substrato, entre uma ação desfosforilante e a seguinte, e sim por desfosforilações sucessivas sobre uma mesma molécula de substrato, até atingir a sua degradação total.

A baixa eficiência observada para a fitase exógena é explicável pela falta de contato ou aproximação entre enzima e substrato que resulta da mistura manual, em relação à disposição com que os reagentes enzima e substrato se encontram naturalmente na matriz do grão, quando a fitase é endógena.

4 – CONCLUSÕES

Em conclusão, o teor de ácido fítico encontrado no farelo industrial estabilizado correspondeu ao já observado naturalmente no grão de arroz integral, confirmando que, mesmo após o processo de estabilização e desengorduramento, ocorrem poucas alterações, do ponto de vista quantitativo ou qualitativo. O uso de fitase comercial exógena de arroz mostrou ser pouco eficaz para a remoção de ácido fítico em farelo estabilizado, obtendo-se taxas de desfitatização baixas. A explicação mais plausível para esta observação estaria na localização estratégica que a enzima endógena possui naturalmente com relação ao substrato; os dois estando proximamente localizados na matriz da camada aleurônica. Tendo em vista a escassa alteração do perfil de distribuição dos polifosfatos, propõe-se que o mecanismo da hidrólise dos mesmos esteja fundamentado na desfosforilação exaustiva de cada molécula de polifosfato de m-inositol, ao invés de colisões ao acaso depois de cada ação desfosforilante. Permanece ainda a ser determinado um meio de imitar tal disposição natural da enzima e substrato para tornar o processo de hidrólise mais eficiente, caso a fitase natural tenha sido desnaturada pelo calor. O farelo estabilizado não possui fitase endógena ativa e, portanto, qualquer tratamento que objetive a diminuição expressiva do nível de fitato no FE deverá obrigatoriamente ser efetuado em etapa anterior ao aquecimento da estabilização, de forma tal que a fitase endógena possa ser utilizada.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 – AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio da FAPESP pela bolsa (Proc. 97/05788-0) e auxílio a Infra-Estrutura de Pesquisa (Proc. 95/6589-6) e a FAEP pelo auxílio a pesquisa (0854/97).

² Depto. de Planejamento Alimentar e Nutrição, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, C.P. 6121 CEP 13083-970 – Campinas-SP, [e-mail]

* A quem a correspondência deve ser enviada.

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¹ Recebido para publicação em 11/11/99. Aceito para publicação em 24/04/00.

Recebido para publicação em 11/11/99. Aceito para publicação em 24/04/00.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jan 2001
• Data do Fascículo
  Abr 2000

Histórico

• Aceito
  24 Abr 2000
• Recebido
  11 Nov 1999