Utilização do Intron Splice Site primer EI-1 na discriminação de leveduras contaminantes do processo de fermentação alcoólica

Use of Intron Splice Site primer EI-1 in the discrimination of contaminant yeasts from the alcoholic fermentation process

ORIGINAL

Utilização do Intron Splice Site primer EI-1 na discriminação de leveduras contaminantes do processo de fermentação alcoólica

Use of Intron Splice Site primer EI-1 in the discrimination of contaminant yeasts from the alcoholic fermentation process

Rodrigo Bacelar da Costa-Silva^I,II; Mario Ribeiro de Melo-Júnior^I,III,*; Marcos Antônio de Moraes Junior^IV

^ILaboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Cidade Universitária, CEP 50670-910, Recife - PE, Brasil, E-mail: [e-mail]

^IICiências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

^IIIDepartamento de Patologia, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

^IVDepartamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

RESUMO

Neste trabalho, utilizamos o Intron Splice Site primer EI-1 para a análise do perfil de amplificação de diferentes espécies de leveduras consideradas contaminantes no processo de fermentação alcoólica, originadas de uma destilaria no Estado da Paraíba na safra 2004/2005. Foram realizadas as etapas analíticas para discriminação molecular das leveduras a partir da extração do DNA total, amplificação por PCR e análise do perfil genético. Os resultados obtidos indicam que o Intron Splice Site primer EI-1é muito eficaz na discriminação das diferentes espécies de Saccharomyces e não Saccharomyces, evidenciando padrões de bandas específicos para as leveduras analisadas. Este primer, por ser complementar a uma região muito conservada do genoma das leveduras, mostrou-se incapaz de uma discriminação intraespecífica. Isto demonstra a utilidade deste marcador no auxílio à taxonomia de leveduras.

Palavras-chave: leveduras contaminantes; Saccharomyces cerevisiae; Intron.

ABSTRACT

In the present study, the Intron Splice Site primer EI-1 was used for the analysis of the profile amplification of different species of yeasts considered contaminants (16) in the alcoholic fermentation process obtained from a distillery in the State of Paraíba in 2004/2005. Analytic stages for the molecular discrimination of the yeasts from the total DNA extraction, PCR amplification, and genetic profile analysis were performed. The results indicates that Intron Splice Site primer EI-1 is highly efficient at discriminating between different Saccharomyces and non-Saccharomyces species showing specific band standards for the yeasts analyzed. This primer, which is part of a conserved region of yeast genome, proved incapable of intra-specific discrimination. This finding demonstrates that this marker may be useful in yeast taxonomy.

Keywords: contaminant yeasts; Saccharomyces cerevisiae; Intron.

1 Introdução

Atualmente, o acompanhamento microbiológico de rotina do processo fermentativo é baseado apenas na observação da morfologia de colônias crescidas em placa de Petri, metodologia que não permite uma boa discriminação das leveduras presentes no processo, além de ser muito laborioso. (LOPEZ et al., 2003).

É imprescindível então, obter-se um rápido diagnóstico sobre a composição e dinâmica das populações de leveduras existentes durante todo o processo, a fim de exercer um controle microbiológico mais apropriado que reduza os transtornos operacionais, assegurando uma redução de custos no processo de fermentação (CHAUD; SCARBIERI, 2006).

Na tentativa de se obter uma ferramenta mais eficaz para o controle de contaminações nos vários processos fermentativos, diferentes técnicas utilizadas para análise do polimorfismo de DNA vêm sendo utilizadas na identificação e caracterização de leveduras contaminantes presentes no processo, dentre estas podemos destacar: RAPD e PCR (LEICKFELDT; MEYER; BORNER, 1993; Pataro et al., 2000; Guerra et al., 2001).

Métodos de análise por PCR utilizando primers que anelam a regiões intrônicas do genoma vêm sendo utilizados para identificação e mapeamento genético do polimorfismo de contaminantes em cereais (Barros Lopes et al., 1996; HALLS et al., 2007). Recentemente, os estudos destes primers, homólogos a regiões flanqueadoras dos introns, demonstraram também eficiência na discriminação de linhagens de leveduras nativas e comerciais da fermentação do vinho (Lopez et al., 2003). Alguns autores, testando a eficiência de vários Intron Splice Site primers na identificação de diferentes linhagens que habitam os vários processos fermentativos, chegaram à conclusão de que o primer EI-1 apresenta-se como uma excelente ferramenta para detectar polimorfismo entre linhagens contaminantes destes processos (Barros Lopes et al., 1996; Guerra et al., 2001).

A partir destes dados, surgiu o interesse em investigar a eficiência de técnicas baseadas em PCR, com o intuito de viabilizar uma possível ferramenta para estudos de populações de leveduras utilizadas em processos fermentativos industriais. Sendo assim, utilizamos o Intron Splice Site primer EI-1 para a análise do perfil de amplificação de diferentes espécies de leveduras consideradas contaminantes no processo de fermentação alcoólica.

2 Material e métodos

2.1 Linhagens de leveduras e condições de cultivo

As linhagens de S. cerevisiae e não S. cerevisiae de coleção foram adquiridas, respectivamente, das coleções do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, do Departamento de Micologia, da coleção A.T.C.C., da Zanini S/A, e a linhagem de Laboratório FF18733 pertence à coleção do Setor de Biologia Molecular-LIKA/UFPE (Tabelas 1 e 2).

Os isolados utilizados neste trabalho foram obtidos da fermentação de álcool combustível, durante a safra 2004/2005, da destilaria Japungu Agro-Industrial S/A, Santa-Rita - PB. Estas foram previamente caracterizadas morfologicamente e também ao nível molecular através do primer (GTG)₅, a partir do qual 16 perfis genéticos foram identificados (Tabela 3). Todas as amostras puras foram cultivadas em meio YPD (extrato de leveduras, peptona e glicose) overnight a 30 ºC para extração do DNA total.

2.2 Extração do DNA Total

O DNA genômico dos isolados foi extraído segundo Sambrook, Fritsch e Maniatis (1986). Cada isolado foi incubado overnight em 20 mL de YPD a 30 ºC e, em seguida, centrifugado por 10 minutos a 14000 RPM. O sobrenadante foi descartado e o material coletado suspenso em Tampão de Extração (EDTA, TRIS-HCl, NaCl, SDS 10%), agitado em vórtex e aquecido a 65 ºC por 30 minutos. Após esta etapa, foi adicionado fenol/clorofórmio (v/v) e, em seguida, centrifugou-se. Transferiu-se a fase superior para novo tubo e para a precipitação do DNA foi utilizado etanol absoluto (a -20 ºC) por 2 horas. O DNA foi lavado com álcool 70%, dissolvido em 100 µl de TE (Tris 10 mM; EDTA 1 mM) e, posteriormente, quantificado em espectrofotômetro a 260/280 nm. O material foi estocado a -20 ºC até sua utilização.

2.3 Amplificação por PCR

A tipagem com o primer Intron foi em seguida aplicada a 16 linhagens de leveduras isoladas no contexto de um trabalho anterior de acompanhamento da população de leveduras em uma unidade industrial produtora de etanol.

A reação de PCR foi conduzida num volume total de 25 µl, utilizando-se o Intron Splice Site primer EI-1 (CTGGCTTGGTGTATGT), descrito por Barros Lopes et al. (1996), contendo 3 mM MgCl₂, 0.2 mM de cada dNTP, 1x Tampão Taq buffer, 50 ng de DNA genômico, 25 pmoles de primer, 0.25 U de Taq polymerase e 0.25 µg de BSA. As amostras foram inicialmente desnaturadas a 94 ºC por 3 minutos e, em seguida, submetidas a 33 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 minuto, anelamento a 48 ºC por 2 minutos e polimerização a 74 ºC por 9 segundos, além de uma extensão final de 72 ºC por 5 minutos.

2.4 Análise dos perfis genéticos

O produto de amplificação foi visualizado em gel de agarose 1,3% após eletroforese a 70 V por 2 horas. Os géis foram corados com brometo de etídio, visualizados em transluminador de UV e fotografados com câmera Polaróide^®. Os perfis genéticos resultantes da caracterização com o primer EI-1, tiveram seus pesos moleculares estimados por comparação com o marcador de peso molecular 100-pb (invitrogen) em todos os géis. O dendrograma foi obtido através do programa NTSYS (JENCER, 1989), no qual os dados foram introduzidos em uma matriz binária do tipo 1 e 0, que indica a presença (1) ou ausência (0) de bandas de um determinado peso molecular.

Os perfis foram agrupados levando-se em consideração o coeficiente de Jaccard, um coeficiente de associação cujos valores de similaridade variam entre 0 e 1, e não considera o intervalo (0,0) como elemento de similaridade (CRISI; ARMENGOL, 1993).

3 Resultados

Inicialmente foram analisadas 11 espécies de leveduras pertencentes a diversos gêneros (Tabela 2), que são frequentes em episódios de contaminação em unidades industriais de produção de álcool combustível. Os perfis genéticos obtidos da amplificação com o primer EI-1 evidenciou um alto polimorfismo com padrões de bandas claramente diferenciados, específicos para cada espécie (Figuras 1 e 2).

Estas 16 linhagens apresentam perfis genéticos distintos quando classificadas por uma metodologia baseada no uso do primer (GTG)₅ (resultados não mostrados). As Figuras 3, 4, 5 e 6 demonstram que o primer Intron foi capaz de distinguir 8 das 16 linhagens testadas.

A maioria dos isolados apresentaram perfis genéticos muito semelhantes ao padrão espécie-específico apresentado pelas linhagens Saccharomyces cerevisiae testadas, diferenciando-se entre si pela presença ou ausência de 4 bandas polimórficas de 1.600, 2.200, 1.030 e 800 pb, podendo um perfil apresentar mais de uma destas bandas. É importante notar que a banda de 1.750 pb, que aparentemente poderia constituir um bom marcador, teve que ser desconsiderada por não apresentar reprodutibilidade entre diferentes amplificações de um mesmo isolado. O perfil P21, representado pelo isolado MF181, apresentou um perfil completamente distinto das demais.

4 Discussão

A identificação e a caracterização de linhagem de leveduras são de grande importância para o processo de fermentação industrial, pois a qualidade de bebidas, como o vinho, é uma consequência direta da diversidade e da dinâmica das populações de micro-organismos presentes no processo (Guerra et al., 2001).

Quando aplicada a um universo de 11 espécies de leveduras pertencentes a gêneros distintos, visto na Tabela 3, a técnica de PCR com o primer EI-1 gerou perfis genéticos únicos para cada espécie analisada. O alto grau de polimorfismo desta região revelado pelo primer EI-1 nessas amostras permite, portanto, uma discriminação fácil e rápida dessas espécies de contaminantes. Estes resultados confirmam os de Barros Lopes et al. (1998) que, analisando leveduras nativas de diferentes gêneros isolados da fermentação alcoólica do vinho, observaram elevada eficiência do primer EI-1 na discriminação entre diferentes espécies. Outras metodologias de PCR, como por exemplo, o uso de um primer para regiões intermicrossatélite (GTG)₅, também apresentam resultados muito satisfatórios em amostras semelhantes (Silva filho et al., 2002).

Sintetizado por Barros Lopes et al. (1996), o Intron Splice Site primer EI-1 mostrou-se muito eficaz na discriminação de linhagens comerciais de S. cerevisiae isoladas na fermentação do vinho. Segundo o autor, a maior vantagem desta técnica é que ela é simples, rápida e acessível para laboratórios industriais com limitada experiência e recursos. A rapidez da técnica e a possibilidade da análise de vários exemplares em um único dia permitem seu uso no monitoramento do crescimento de leveduras durante o processo fermentativo propiciando um melhor controle de qualidade. Pataro et al. (2000), também utilizando PCR com o primer intron EI-1, voltaram a destacar a utilidade deste primer na discriminação de linhagens de S. cerevisiae, agora isoladas na fermentação da aguardente.

No presente estudo, a linhagem IA 1194 se destacou, dentre as demais, por apresentar um perfil completamente distinto da S. cerevisiae. Esta levedura foi classificada inicialmente por métodos clássicos. Embora estes métodos, baseados em características morfológicas e bioquímicas, continuem sendo o critério mais utilizado para a classificação de isolados desconhecidos (BARNETT; PAINER; YARROW, 1990), outras características fisiológicas importantes podem ser determinadas por somente uma pequena fração do genoma (Barros Lopes et al., 1998; GRANCHI et al., 1999).

Em outro trabalho que está sendo desenvolvido, a partir da análise preliminar das 16 linhagens nativas do processo de fermentação do álcool carburante, submetidas à amplificação com o primer (GTG)₅, foi possível observar o alto polimorfismo dos isolados deste processo (resultados não mostrados).

Este alto polimorfismo não foi repetido pelo primer EI-1, pois este não foi capaz de diferenciar os 16 isolados testados, mas em contrapartida ele evidenciou a predominância de linhagens S. cerevisiae no processo, já que 90% dos isolados apresentaram padrões de bandas muito próximos ao padrão espécie-específico da S. cerevisiae, estabelecido neste trabalho. O alto polimorfismo observado entre linhagens de S. cerevisiae constitui uma poderosa ferramenta para análise da população nativa que é formada durante a fermentação espontânea da uva (Polsinelli et al., 1996), o que pode ser observado também na produção de álcool etanol. É possível que o alto polimorfismo encontrado seja resultado de características únicas do processo de fermentação do álcool combustível. Trata-se de uma fermentação de ciclo curto de 8 horas, conduzida em altas temperaturas (32 a 38 ºC), com alto teor alcoólico (8 a 10%) e ciclos fermentativos diários durante 7 a 8 meses. Estas particularidades estariam atuando como pressões seletivas nas linhagens que vão surgindo, justificando a diversidade complexa observada (Lucena, 2002).

O isolado MF181, representante do perfil genético P21, que apresentou um perfil genético completamente distinto das espécies Saccharomyces testadas, apenas confirma os resultados obtidos por outros autores, que, utilizando técnicas de cariotipagem molecular e PCR com o primer para regiões intermicrossatélite (GTG)₅, comprovaram que este mesmo isolado é muito distante de espécies de Saccharomyces (Lucena, 2002; Silva Filho et al., 2002).

5 Conclusões

A técnica de PCR, utilizando o Intron Splice Site primer EI-1, não foi desenvolvida com o intuito de substituir técnicas já existentes de taxonomia e sistemática de leveduras, mas sim como uma ferramenta preliminar e confirmatória para estas. Esta técnica pode facilitar, para os taxonomistas, a identificação de leveduras pertencentes a diferentes gêneros.

Por se tratar de um marcador molecular relativamente barato, que não requer mão de obra especializada e que apresenta resultados rápidos, o primer EI-1 deve ser utilizado como um marcador específico para identificação de isolados S. cerevisiae retirados diretamente do processo fermentativo. Posteriormente, seriam utilizados outros primers, tal como o (GTG)₅, para identificar dentre os isolados S. cerevisiae, as possíveis linhagens genéticas que coabitam o processo fermentativo.

Recebido para publicação em 2/8/2008

Aceito para publicação em 8/7/2009 (003745)

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A quem a correspondência deve ser enviada

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Out 2010
• Data do Fascículo
  Set 2010

Histórico

• Recebido
  02 Ago 2008
• Aceito
  08 Jul 2009