Avaliação do teste de imunodifusão mediante emprego do polissacarídeo "O" no diagnóstico da brucelose bovina

Evaluation of agar gel immunodiffusion test using O-chain-polysaccharide for diagnosis of bovine brucellosis

Avaliação do teste de imunodifusão mediante emprego do polissacarídeo "O" no diagnóstico da brucelose bovina

(Evaluation of agar gel immunodiffusion test using O-chain-polysaccharide for diagnosis of bovine brucellosis)

G.M. Costa, V.L.V. Abreu, F.C.F. Lobato^*, J.A. Silva, N.E. Martins

Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 – Belo Horizonte, MG

RESUMO

Comparou-se o teste de imunodifusão dupla em ágar gel (IDGA) pelo emprego do polissacarídeo "O" como antígeno com os testes de soroaglutinação rápida, soroaglutinação lenta, 2-mercaptoetanol, reação de fixação de complemento e antígeno tamponado acidificado no diagnóstico da brucelose, em bovinos infectados, não infectados e recém-vacinados com a amostra B-19, visando à diferenciação de anticorpos vacinais daqueles associados à infecção natural pela Brucella abortus. Nenhum dos testes realizados permitiu diferenciar precisamente anticorpos vacinais daqueles induzidos pela infecção brucélica e, nas condições do presente trabalho, a utilização do IDGA com este objetivo poderia levar à retenção de animais infectados no rebanho.

Palavras-Chave: Bovino, brucelose, diagnóstico, teste de imunodifusão

ABSTRACT

Agar gel immunodiffusion test (AGID) using the O-polysaccharide was compared with serologic tests used in brucellosis diagnosis in non-infected, infected and early vaccinated cattle with strain B-19, in order to differentiate vaccinal antibodies from those resulting of natural infection by Brucella abortus. None of the techniques can differentiate with absolute reliability the vaccinal antibodies from antibodies associated with natural infection to Brucella abortus. Moreover, the use of AGID with this objective would cause maintenance of infected animals in the herd.

Keywords: Bovine, brucellosis, diagnostic, agar gel immunodiffusion test

INTRODUÇÃO

A brucelose bovina é uma zoonose amplamente difundida na América do Sul, tendo grande importância sócio-econômica devido aos prejuízos econômicos e ao grande número de casos de infecção no homem.

A vacinação de fêmeas entre três e oito meses de idade com amostra B-19, o isolamento e o sacrifício dos animais infectados têm sido as principais medidas de controle dessa enfermidade.

A persistência dos anticorpos vacinais se estende, normalmente, até os 18 meses de idade quando os animais são vacinados com idade entre três e oito meses. Nesta circunstância, a interpretação do estado nosológico do animal ou do rebanho é dificultada, uma vez que a amostra B-19 induz à formação de anticorpos que não podem ser distinguidos daqueles induzidos pela infecção natural quando se utilizam as técnicas convencionais de diagnóstico (Olascoaga, 1976; Agottani & Gonçalves, 1996).

Nos últimos anos, especial atenção tem sido dada à seleção de testes que permitam diferenciar anticorpos de origem vacinal daqueles induzidos pelo processo infeccioso. Técnicas que empregam o polissacarídeo "O" vêm sendo amplamente utilizadas, tendo o teste de imunodifusão potencial aplicabilidade neste sentido.

Constituiu objetivo deste trabalho comparar a sensibilidade e a especificidade do teste de imunodifusão dupla em ágar gel (IDGA) com o emprego do polissacarídeo "O" como antígeno, com as técnicas de reação de fixação de complemento (RFC), soroaglutinação rápida (SAR), soroaglutinação lenta (SAL), teste do 2-mercaptoetanol (2-ME) e teste do antígeno tamponado acidificado (AT) em bovinos infectados, não infectados e recém-vacinados.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se 324 bovinos distribuídos nos seguintes tratamentos: grupo 1, constituído de 118 animais adultos, não vacinados e negativos à RFC para brucelose, oriundos de rebanhos livres de brucelose; grupo 2, constituído de 98 bezerras não reagentes à RFC para brucelose, com idade entre três e oito meses - os animais desse grupo foram vacinados contra brucelose com a utilização da dose padrão (60-120´10⁹UFC) e a sangria foi feita decorridos 45-90 dias após a vacinação; grupo 3, composto por 108 fêmeas adultas, não vacinadas e positivas à RFC para brucelose.

Foram realizados os testes de reação de fixação de complemento (RFC), imunodifusão em ágar gel (IDGA), teste do antígeno tamponado acidificado (AT), soroaglutinação rápida (SAR), soroaglutinação lenta (SAL) e teste do 2-mercaptoetanol (2-ME). RFC, SAR, SAL e AT foram feitos e interpretados de acordo com Alton (1988). 2-ME foi realizado segundo Olascoaga (1976), tendo sido interpretado de acordo com Dajer et al. (1990).

A produção do antígeno empregado no IDGA, execução e interpretação do teste foram feitas de acordo com Pinochet et al. (1989). A sensibilidade e a especificidade relativas à RFC foram determinadas e os resultados comparados pelo teste de qui-quadrado (c ²), utilizando-se o programa EPI-INFO (1994).

Títulos suspeitos obtidos nos testes de SAR, SAL e 2-ME foram interpretados como positivos a fim de que a sensibilidade e a especificidade pudessem ser calculadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos testes sorológicos realizados bem como os dados relativos à sensibilidade e à especificidade encontram-se nas Fig. 1, 2, 3 e 4.

Todos os valores de c ² foram significativos, apresentando elevados valores para P.

A Fig. 1 relaciona os valores de especificidade dos testes sorológicos feitos para os grupos 1 e 2. A especificidade da RFC no grupo 2 se refere aos resultados do teste realizado 45-90 dias após a vacinação.

O IDGA apresentou especificidade absoluta para o grupo 1 (animais negativos não vacinados) e alta especificidade no grupo 2 (bezerras vacinadas com dose padrão), ocasião em que este geralmente apresentava elevados títulos séricos de anticorpos nas diversas técnicas avaliadas. O IDGA apresentou a melhor especificidade, seguido pelo 2-ME, SAL, SAR, RFC e AT em relação às demais técnicas avaliadas no grupo 2.

Os resultados do IDGA foram próximos dos obtidos por Jones et al. (1980), mas diferentes dos relatados por Cherwonogrodsky & Nielsen (1988), Lord et al. (1989), Pinochet et al. (1989) e Pinochet et al. (1990), os quais obtiveram especificidade de 100% para o teste em condições experimentais semelhantes.

As amostras que reagiram ao IDGA apresentavam altos títulos sorológicos, indicando que a resposta ao polissacarídeo "O", seja na infecção natural, seja em resposta à vacinação, depende de um estímulo antigênico intenso normalmente associado à infecção ativa pela amostra de campo ou amostra vacinal, conforme relataram Díaz et al. (1979).

Todos os testes realizados no grupo 1 apresentaram especificidade absoluta, exceção à SAR cuja especificidade foi de 94,1%. Os resultados obtidos para AT, SAL e 2-ME neste grupo foram semelhantes aos obtidos por Poester & Thiessen (1994). Nicoletti & Murashi (1966) obtiveram especificidade de 61,0% e 66,0% para SAR e SAL, respectivamente, valores muito inferiores aos observados no presente trabalho.

A Fig. 2 refere-se às sensibilidades obtidas nos testes feitos para o grupo 3, que corresponde aos animais naturalmente infectados. Todos os testes assemelhavam-se à RFC, exceção ao IDGA que apresentou a menor sensibilidade dentre as técnicas avaliadas para o grupo. A sensibilidade desse teste foi inferior às sensibilidades obtidas em ensaios semelhantes por Lord et al. (1989), Pinochet et al. (1989 e 1990), cujos valores foram 87,5%, 86,4% e 92,3%, respectivamente.

Destaca-se no grupo 3 (Fig. 2) a concordância absoluta entre os resultados da RFC e do AT, semelhante aos resultados obtidos por Hornitzky & Searson (1986), o que evidencia a alta sensibilidade desta técnica, conforme relataram Olascoaga (1976) e Corrêa de Sá (1989). A sensibilidade obtida para AT nesse grupo foi próxima da obtida por Nicoletti & Murashi (1966). A sensibilidade e especificidade observada por Corrêa de Sá (1989) para AT, SAL e 2-ME foram as que mais se aproximaram dos resultados do presente estudo. A sensibilidade observada por Poester & Thiessen (1994) no AT foi semelhante à encontrada no presente trabalho, mas a sensibilidade apresentada na SAL foi menor que a observada no 2-ME.

De modo geral, os títulos da SAL no grupo 3 foram iguais ou ligeiramente inferiores aos títulos da SAR. Nesse mesmo grupo, os títulos da SAL foram, em geral, semelhantes aos do 2-ME. No grupo vacinado, os títulos do 2-ME foram menores que os observados na SAL. Esse resultado indica que o estímulo antigênico nos animais vacinados induz à produção de níveis significativos de IgM, além de IgG, conforme relataram Sutherland (1980) e Nielsen (1995).

Observa-se nas Fig. 3 e 4 que o IDGA apresentou baixa sensibilidade quando as amostras apresentavam títulos sorológicos baixos nos testes de SAR, SAL, 2-ME e RFC; entretanto, à medida que esses aumentavam, ocorria correspondente aumento na sensibilidade do teste. Esses achados estão em concordância com Jones et al. (1980), Lord et al. (1989), Pinochet et al. (1989 e 1990).

As especificidades obtidas por Lord et al. (1989) no AT (46,8%), na SAL (45,6%) e na RFC (44,68%) para bezerras vacinadas em condições semelhantes e avaliadas dois meses após a vacinação foram superiores às obtidas no presente trabalho, ao passo que a especificidade obtida no 2-ME (52,5%) foi inferior. As especificidades observadas por Pinochet et al. (1989) na SAL e na RFC se aproximam dos valores aqui obtidos, mas a especificidade averiguada no AT (14,7%) foi sensivelmente superior. A especificidade obtida para o grupo em questão foi próxima daquelas observadas por Jones et al. (1980) e Pinochet et al. (1990). Corrêa de Sá (1989) obteve especificidade nula para as técnicas de SAL, 2-ME, RFC e AT quando bezerras vacinadas com dose padrão foram avaliadas 20 dias após a vacinação, ocasião em que o teste de imunodifusão que empregava o antígeno polissacarídico apontava cerca de 20% de reagentes. Os resultados obtidos na RFC e na SAL no grupo 2 estão de acordo com os observados por Sutherland (1984).

O teste do 2-ME apresentou, depois do teste de imunodifusão, a melhor especificidade no grupo vacinado (Fig. 1). Isto se justifica pelo fato de a técnica detectar seletivamente as imunoglobulinas da classe IgG, uma vez que a IgM é inativada pelo 2-mercaptoetanol (Olascoaga, 1976; Agottani & Gonçalves, 1996). O teste apresentou alta sensibilidade no grupo infectado, oposto aos resultados de Dajer et al. (1990).

A especificidade relativa do AT no grupo vacinado foi a menor dentre as técnicas avaliadas. Entretanto, nos grupos não vacinados, a concordância com RFC foi absoluta, oposta aos relatos de Olascoaga (1976), Huber & Nicoletti (1986) e Corrêa de Sá (1989) que a referenciaram como técnica de baixa especificidade. Esses dados vêm demonstrar a viabilidade de utilizar o AT como alternativa aos demais testes de aglutinação em rebanhos onde não se prática a vacinação contra a brucelose, tendo em vista a boa eficiência do teste, maior facilidade de execução e menor custo.

Apesar da alta especificidade exibida nos grupos 1 e 2 (Fig. 1), IDGA não se mostrou satisfatório como teste complementar devido à baixa sensibilidade verificada para o grupo dos animais infectados (Fig. 2), especialmente quando se consideraram os animais que apresentaram baixos títulos sorológicos nas técnicas quantitativas realizadas (Fig. 3 e 4). Um dos maiores problemas com relação ao diagnóstico da brucelose bovina em rebanhos vacinados diz respeito às reações de classificação incerta (reações suspeitas), que tanto podem estar associadas com reação vacinal residual, como com reações inespecíficas ou com brucelose crônica, situações nas quais é comum a ocorrência de títulos sorológicos baixos e às vezes até ausentes, como relataram Viana et al. (1982). Um bom teste confirmatório deveria apresentar alta especificidade aliada a uma boa sensibilidade, a fim de que animais infectados detectados na triagem não permanecessem no rebanho, retardando ou mesmo inviabilizando o programa de controle da doença.

A alta proporção de amostras que apresentaram títulos suspeitos no grupo infectado e, principalmente, no grupo vacinado dificultou a determinação precisa da sensibilidade e especificidade, uma vez que, para o cálculo delas, somente se permite a ocorrência de animais positivos e negativos. A classificação dos animais com títulos suspeitos em positivos provocou queda da especificidade e aumento da sensibilidade em todos os grupos experimentais, sendo este efeito mais pronunciado no grupo 2, que apresentou maior proporção de suspeitos em relação aos grupos não vacinados. Em condições práticas, fatores como prevalência da doença, custo dos testes e implicações de resultados falsos-positivos e falsos-negativos é que irão determinar qual o melhor critério a ser adotado, ou seja, se é melhor maximizar a sensibilidade ou a especificidade (Nicoletti & Tanya, 1993).

As diferenças de sensibilidade e especificidade observadas para as diversas técnicas, nos diferentes grupos, podem estar associadas aos diferentes padrões de interpretação adotados, ao tratamento dado aos títulos suspeitos observados nos testes e aos diferentes critérios adotados para a composição dos grupos experimentais. No caso específico do IDGA, as diferenças observadas podem estar relacionadas a diferentes técnicas de obtenção do antígeno que podem resultar em antígenos com propriedades imunológicas semelhantes, mas com diferentes graus de pureza, conferindo-lhes sensibilidade e especificidade diferentes.

Nenhum dos testes realizados permitiu diferenciar com segurança absoluta os anticorpos vacinais dos anticorpos associados à infecção natural e, de acordo com os resultados obtidos, a utilização do IDGA, com este objetivo, poderia levar à retenção de animais infectados no rebanho.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Abr 2001
• Data do Fascículo
  Ago 1999

Histórico

• Recebido
  20 Maio 1999