Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas de embutidos curados frente a Listeria monocytogenes

Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Brazilian dry fermented sausages against Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes

[Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Brazilian dry fermented sausages against Listeria monocytogenes]

C.S. Prado¹, W.L.M. Santos², C.R. Carvalho³, E.C. Moreira², J.O. Costa²

¹Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás

Caixa Postal 131. Campus II

74001-970 – Goiânia, GO

²Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais

³Médico Veterinário

Recebido para publicação, após modificações, em 8 de fevereiro de 2000

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Cepas de bactérias lácticas recuperadas de 336 colônias isoladas e selecionadas foram submetidas ao teste de atividade antimicrobiana direta, que identificou as produtoras de substâncias antimicrobianas capazes de inibir in vitro o desenvolvimento de duas cepas indicadoras de Listeria monocytogenes. As 108 cepas que inibiram diretamente pelo menos uma das cepas indicadoras receberam a denominação DTEI e foram selecionadas para o teste de atividade antimicrobiana indireta contra as mesmas cepas de L. monocytogenes, assim como frente a outras cepas de bactérias lácticas de origens diversas. Essa atividade inibidora indireta foi avaliada por meio de sobrenadantes isentos de células, esterilizados por meio de microfiltração, eliminando-se os principais compostos responsáveis por ela, como por exemplo os ácidos orgânicos e o peróxido de hidrogênio, mediante o ajuste do pH e a liofilização dos sobrenadantes. Oito cepas de bactérias lácticas apresentaram atividade antimicrobiana indireta frente a pelo menos um dos microrganismos indicadores utilizados, sugerindo terem produzido substâncias semelhantes a bacteriocinas. Três destas cepas foram caracterizadas e identificadas como pertencentes ao gênero Lactobacillus sp.

Palavras-chave: Bactéria láctica, atividade antimicrobiana, Listeria monocytogenes, Lactobacillus sp.

ABSTRACT

The direct antimicrobial activity of 336 samples of lactic acid bacteria, isolated from Brazilian dry fermented sausages, was evaluated in vitro against two strains of Listeria monocytogenes, using agar diffusion assay. A total of 108 strains of lactic acid bacteria showed direct inhibitory activity against at least one of the two strains of Listeria monocytogenes, probably due to production of organic acids, hydrogen peroxide, and oxygen metabolites, in addition to other substances. These 108 strains were further tested for indirect antimicrobial activity against the same strains of Listeria monocytogenes, as well as against other strains of lactic acid bacteria. Indirect antimicrobial activity was evaluated using free-cells supernatants, obtained through sterilization by microfiltration. These supernatants were treated to eliminate inhibitory substances, such as organic acids, and hydrogen peroxide by adjusting the pH and liofilization. A total of eight strains of lactic acid bacteria had indirect antimicrobial activity against a least one of the indicator microorganisms. This indirect antimicrobial activity is indicator of substance similar to bacteriocins. Three of these eight strains were characterized and identified as Lactobacillus sp.

Keywords: Lactic acid bacteria, antimicrobial activity, Listeria monocytogenes, Lactobacillus sp.

INTRODUÇÃO

A susceptibilidade da carne e demais produtos de origem animal às contaminações bacterianas, com a perda de suas características nutritivas, sensoriais e de qualidade sanitária, fez com que o homem, séculos atrás, procurasse conservá-la por distintos métodos tais como desidratação, salga, defumação e fermentação (Silla, 1989).

A fermentação e a secagem são os mais antigos métodos de preservação de alimentos conhecidos pelo homem. Provavelmente, a principal razão pela qual os produtos fermentados tornaram-se populares na antiguidade foi a sua estabilidade em climas quentes (Yamada & Beraquet, 1993). Atualmente, vários recursos têm sido utilizados para conservação de alimentos como temperatura, atividade de água (Aw), pH, gases, ácidos orgânicos, sais, antibióticos, irradiação, embalagens e diversas combinações desses fatores (Wagner & Moberg, 1989). Dessa maneira, os métodos de conservação possuem como objetivos principais o aumento da vida útil e a melhoria da qualidade microbiológica e sanitária dos alimentos. Além disso, promovem a obtenção de novos produtos com características sensoriais diferenciadas.

A utilização de bactérias fermentadoras, como as bactérias lácticas, na elaboração de alimentos tem crescido nos últimos tempos. Atualmente, são conhecidos alguns dos efeitos que a fermentação exerce sobre a conservação de produtos cárneos e, por isso, pretende-se conhecer, dirigir e melhorar esses processos, visando a obtenção de produtos de melhor qualidade. As bactérias lácticas inibem o desenvolvimento de diversos microrganismos indesejáveis e patogênicos nos alimentos e, assim, além de lhes conferir características sensoriais desejáveis, estendem a sua vida útil e melhoram a sua qualidade higiênica (Santos, 1993). Essa ação se atribui aos metabólitos desses microrganismos (ácidos orgânicos, H₂O₂ etc.) e às substâncias produzidas como antibióticos e bacteriocinas. Nesse sentido, vários estudos têm indicado que as bacteriocinas são uma das principais substâncias responsáveis pela ação antimicrobiana mediada pelas bactérias lácticas (Sobrino et al., 1991; Santos, 1993).

Assim, a busca e o isolamento de bactérias lácticas, cuja ação antagônica esteja fundamentalmente mediada por substâncias extracelulares difusíveis (antimicrobianos e bacteriocinas), têm grande interesse prático, já que dessa maneira não seria necessário que esses microrganismos se desenvolvessem em seus substratos (p.ex., carne refrigerada) para exercer seu efeito antimicrobiano.

O presente trabalho teve como objetivos isolar de embutidos curados cepas de bactérias lácticas produtoras de substâncias inibidoras extracelulares, determinar o efeito inibidor do crescimento bacteriano das substâncias liberadas no meio extracelular pelas bactérias lácticas selecionadas frente a microrganismos taxonomicamente relacionados e à Listeria monocytogenes, e identificar o gênero dos microrganismos inibidores mais potentes.

MATERIAL E MÉTODOS

Durante sete semanas, de março a abril de 1995, foi adquirida de maneira aleatória, no Mercado Central da cidade de Belo Horizonte, uma amostra de linguiça proveniente da cidade de Santa Luzia, MG, perfazendo um total de sete amostras. Cada amostra, devidamente identificada, foi transportada para o laboratório de bactérias lácticas do Departamento de Tecnologia e Inspeção de Produtos de Origem Animal, da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, onde foram mantidas à temperatura de 4° C durante uma semana, antes de serem processadas no laboratório. Esse tratamento foi utilizado para favorecer o crescimento, a baixas temperaturas, das bactérias lácticas produtoras de substâncias antagonistas, conforme preconizado por Vaughan et al. (1994).

Após esse período, foram colhidas assepticamente 20g da porção central de cada amostra, transferidas para um copo homogeneizador com 180ml de meio de enriquecimento composto por água peptonada a 1% com 0,85% de NaCl. Após a homogeneização por dois a três minutos, o material liquefeito foi incubado a 35° C durante 4h. A seguir, foram obtidas diluições subseqüentes até a concentração de 10^-6. De cada uma das diluições tomaram-se alíquotas de 100m l, que foram semeadas em sistema de dupla camada com o meio de cultura De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) com 1,5% de ágar, em placa de Petri (90´15mm) e incubadas em estufa a 35° C por 48 horas (Sobrino et al., 1991).

As colônias que cresceram após esse período foram recolhidas de acordo com o método aleatório descrito por Ordoñez (1979). As colônias escolhidas foram semeadas por meio de picadura em placas de MRS ágar a 1,5%, procedendo-se a incubação a 35ºC por 12 horas.

Os microrganismos indicadores utilizados são apresentados na Tab. 1.

Alíquotas do meio de cultivo contendo os microrganismos indicadores foram transferidas para tubos de ensaio com 10ml de caldo BHI ou MRS, dependendo da cepa, e incubados em estufa de cultura por 12 horas, à temperatura de 35ºC. Esse procedimento recebeu a denominação de cultivo iniciador dos microrganismos indicadores.

A partir dos tubos com os cultivos iniciadores das cepas indicadoras escolhidas, foram pipetados 100ml do seu volume, que foram transferidos para um tubo com 5ml de caldo BHI. Deste, pipetou-se 1ml que foi transferido para outro tubo, contendo também 5ml de caldo BHI. Em seguida, 750ml do volume deste último tubo foram pipetados e transferidos para um tubo com 15ml de BHI-ágar 0,87%, pré-preparado e mantido em estado líquido em banho-maria a 45ºC (Santos, 1993).

O seu conteúdo foi vertido cuidadosamente em uma das duas placas de MRS-ágar, das quais se recuperaram as colônias de bactérias lácticas isoladas das amostras. Após a completa solidificação da camada superior de BHI-ágar, as placas foram incubadas por mais 24 a 48 horas, a 35ºC.

As colônias de bactérias lácticas que promoveram inibição do crescimento em pelo menos um dos microrganismos indicadores utilizados, observada pela formação de halos, foram recuperadas e congeladas com 15% de glicerol. A identificação das cepas de bactérias lácticas foi feita a partir desse ponto com a denominação DTEI (Departamento de Tecnologia e Inspeção).

Com o objetivo de avaliar a atividade inibidora indireta foram obtidos os sobrenadantes livres de células, por meio de centrifugação a 10.000rpm ou 12.317´g, durante 10 minutos (Santos, 1993). O pH do sobrenadante foi ajustado gotejando-se uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N até que atingisse a faixa de 6,2 a 6,8. Os sobrenadantes foram filtrados por meio de membranas filtrantes GS em éster de celulose com 0,22mm de poro e 25mm de diâmetro (Millipore). Esse filtrado constituía o sobrenadante livre de células não concentrado, denominado s. Esse sobrenadante foi concentrado 20 vezes (Sc) por liofilização e ressuspensão em solução tampão-fosfato de 4mM e pH 7,0.

A partir do cultivo iniciador dos microrganismos indicadores, 100ml foram transferidos para um tubo contendo 5ml de caldo BHI ou MRS. Desse tubo pipetou-se 1ml que foi vertido para outro tubo contendo 5ml de caldo BHI e deste foram passados 1,5ml para um tubo contendo 30ml de BHI-ágar 0,8% ou MRS-ágar 0,8%. Para cada cepa indicadora foi preparada uma placa para o teste do sobrenadante concentrado Sc. As placas foram incubadas em estufa de cultura, a 37ºC, durante uma hora, para secagem e fixação do ágar. Terminado esse prazo, foram criados furos com 6mm de diâmetro. A cada furo criado no ágar foram adicionados 50ml dos sobrenadantes livres de células concentrados (Sc) das cepas de bactérias lácticas a serem testadas. As placas foram levadas à geladeira (4ºC) onde permaneciam por duas horas e, em seguida, foram incubadas durante 24 a 48 horas. Os halos de inibição ao crescimento dos microrganismos indicadores foram, após esse tempo, observados e mensurados em milímetros, por meio de um paquímetro (Santos, 1993).

Uma vez realizados todos os testes de difusão em ágar, oito cepas de bactérias lácticas que apresentaram inibição frente a pelo menos um dos microrganismos indicadores utilizados foram selecionadas e testadas frente a outras bactérias lácticas para avaliação do espectro de ação.

As cepas de bactérias lácticas escolhidas (DTEI 001, DTEI 002 e DTEI 003) foram identificadas até gênero, pelo método de identificação rápida para lactobacilos descrito por Schillinger & Lücke (1987), por meio de provas de produção de gás, catalase, coloração de Gram, morfologia e crescimento a 15° C.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A contagem global de bactérias lácticas encontradas nas sete amostras de linguiças analisadas variou de 10⁷ a 10⁸ UFC/g. As colônias apresentavam formato arredondado e com bordas bem delimitadas, cor branca, aspecto cremoso, com diâmetros de 2 a 3 milímetros e se localizavam na região interna da dupla camada de MRS-ágar.

Os resultados foram semelhantes aos observados por outros autores, que têm descrito a predominância de bactérias lácticas em embutidos fermentados secos, com a adição ou não de culturas starter (Palumbo et al., 1976). Samelis et al. (1994) quantificaram e caracterizaram a população microbiana em salames secos produzidos artesanalmente na Grécia, sem adição de culturas starter, e observaram que após o quarto dia de fermentação a contagem de bactérias lácticas atingiu níveis de 10⁸ UFC/g, mantendo-se constante durante todo o período de fermentação e maturação. Os mesmos resultados foram obtidos na análise de embutidos cárneos espanhóis, produzidos artesanalmente sem a adição de culturas starter (Sanz et al., 1988).

A atividade inibidora direta frente à Listeria monocytogenes Scott A e L. monocytogenes ATCC 7644 revelou que das 336 cepas de bactérias lácticas isoladas, 108 mostraram halos de inibição definidos frente a pelo menos um dos microrganismos indicadores utilizados, representando 32% do total. Destas 108 cepas, 51 apresentaram inibição frente aos dois microrganismos indicadores, 33 somente frente à L. monocytogenes Scott A e 25 somente frente à L. monocytogenes ATCC 7644.

Os resultados demonstram que a sensibilidade às substâncias produzidas pelas bactérias lácticas e liberadas no meio extracelular varia de acordo com o microrganismo e com a cepa de bactéria láctica. Carvalho et. al. (1998) isolaram bactérias lácticas de embutidos curados que apresentavam atividade antimicrobiana frente a cepas de Staphylococcus aureus e a outros microrganismos. Assim, uma determinada cepa de bactéria láctica pode produzir substâncias capazes de inibir diferentes microrganismos e/ou um determinado microrganismo pode ser sensível a diferentes cepas de bactérias lácticas. Dessa forma, Listeria monocytogenes Scott A demonstrou ser mais sensível à ação antagonista das bactérias lácticas isoladas das lingüiças produzidas, uma vez que 9,8% delas foram capazes de inibir L. monocytogenes Scott A em comparação com 7,4% para L. monocytogenes ATCC 7644.

Os resultados obtidos pelos pesquisadores que têm estudado a atividade antimicrobiana de bactérias lácticas de diversas origens são bastante heterogêneos. Diversos autores têm mencionado atividade antimicrobiana frente a Listeria monocytogenes (Hoover et al., 1988; Pucci et al., 1988 apud Raccach et al., 1989). Os resultados do presente trabalho são semelhantes aos obtidos por Harris et al. (1989), que encontraram sete cepas de bactérias lácticas com atividade antimicrobiana direta, entre 14 cepas estudadas, conhecidamente produtoras de bacteriocinas, dos gêneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Lactococcus, testadas frente a diversas cepas de Listeria monocytogenes.

Os resultados obtidos pelos diversos autores podem ser devidos a vários fatores, como por exemplo produção de ácidos orgânicos, de peróxido de hidrogênio, de diacetil, de dióxido de carbono, de acetaldeído e de bacteriocinas, entre outros. Além disso, como na prova da atividade antimicrobiana direta a cepa de bactéria láctica a ser avaliada e o microrganismo indicador se desenvolvem ao mesmo tempo, a inibição pode ser provocada por competição pelos nutrientes do meio de cultura (Holzapfel et al., 1995).

A atividade antimicrobiana dos sobrenadantes concentrados livres de células foi realizada por meio do teste de difusão em ágar, utilizando como microrganismos indicadores Listeria monocytogenes Scott A e L. monocytogenes ATCC 7644. Das 108 cepas de bactérias lácticas testadas, oito apresentaram ação antimicrobiana frente a pelo menos um dos microrganismo indicadores. Dentre estas, três cepas apresentaram inibição frente aos dois indicadores e cinco somente frente à L. monocytogenes Scott A.

Resultados semelhantes foram encontrados no estudo de Santos (1993), no qual bactérias lácticas isoladas de embutidos cárneos, produzidos artesanalmente na Espanha, apresentaram atividade antimicrobiana frente a Listeria monocytogenes NCTC 7973, L. monocytogemes NCTC 5sv1/2, L. monocytogenes Scott A entre outros microrganismos testados, incluindo bactérias do gênero Staphylococcus.

A realização da prova da atividade inibidora indireta, por meio do teste de difusão em ágar, visa avaliar se a inibição foi devida à ação de substâncias semelhantes a bacteriocinas ou provocada pelas demais substâncias produzidas e liberadas no meio extracelular pelas bactérias lácticas. Dessa forma, a obtenção do sobrenadante concentrado livre de células objetiva eliminar a competição entre o microrganismo indicador e as bactérias lácticas. A correção do pH do sobrenadante para 6,2 a 6,8 impede que a ação antimicrobiana seja provocada pela elevada acidez, que é tóxica para muitos microrganismos putrefativos (ex., Clostridium e Pseudomonas), patogênicos (ex., Salmonella e Listeria) e bactérias toxigênicas (ex., Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum) (Piard & Desmazeaud, 1991; Schillinger et al., 1993; Holzapfel et al., 1995). Para garantir a completa ausência de células no sobrenadante, promove-se a filtração, impedindo que ocorra inibição por competição direta pelos nutrientes do meio de cultura. A liofilização promove a remoção de metabólitos do oxigênio e de peróxido de hidrogênio, pois eles também são fatores responsáveis por ação antimicrobiana.

Desse modo, com a utilização do sobrenadante concentrado livre de células eliminam-se diversos fatores que poderiam ser responsáveis pela ação antimicrobiana, sugerindo que a inibição das cepas de Listeria monocytogenes observadas no presente trabalho seja similar à ação de bacteriocinas. Esses resultados são semelhantes aos observados por Hugas et al. (1995), que analisaram a atividade antimicrobiana de uma cepa de Lactobacillus sake CTC 494, isolado de um embutido cárneo naturalmente fermentado. Esse lactobacilo é produtor de uma bacteriocina denominada sakacina K, que possui ação antagonista frente a Listeria monocytogenes CTC 1011 e L. innocua CTC 1014, isoladas de carne crua. A inibição foi observada tanto no teste direto, quanto no teste de difusão em ágar utilizando os sobrenadantes livres de células. Além disso, foi observada redução significativa na contagem de listeria em embutidos cárneos inoculados com Lactobacillus sake CTC 494 e contaminados artificialmente com Listeria innocua.

Os sobrenadantes concentrados livres de células que apresentaram halos de inibição frente a pelo menos um dos microrganismos indicadores utilizados foram selecionados e tiveram seu espectro de ação antimicrobiana avaliado frente a outras bactérias lácticas. Os resultados foram diferentes entre as diversas cepas testadas, demonstrando que o espectro de ação das bactérias lácticas é bastante variado (Tab. 2).

A realização do espectro antimicrobiano tem a finalidade de avaliar e conhecer o potencial antagonista das cepas de bactérias lácticas selecionadas. Os resultados foram similares aos observados por diversos autores, que relataram um amplo e variado espectro de atividade antimicrobiana não só frente a bactérias lácticas taxonomicamente relacionadas, como também frente a microrganismos patogênicos, contaminantes de alimentos, de grande importância para a indústria alimentícia (Sobrino et al., 1991; Garriga et al., 1993; Santos, 1993; Vignolo et al., 1993; Choi & Beuchat, 1994; Tarelli et al., 1994; Jack et al., 1995).

As três cepas de bactérias lácticas selecionadas (DTEI 001, DTEI 002 e DTEI 003) foram identificadas até gênero, segundo o método de identificação rápida descrito por Schillinger & Lücke (1987). As bactérias lácticas podem ser caracterizadas como Gram-positivas, não formadoras de esporos, microaerofílicas ou anaeróbias facultativas, cujo principal produto da fermentação de carboidratos é o lactato.

Os resultados das provas de identificação demonstraram que as três cepas selecionadas apresentam características idênticas, sendo classificadas, segundo esquema proposto por Schillinger & Lücke (1987), como pertencentes ao gênero Lactobacillus. São também classificadas como mesofílicas, homofermentadoras e pertencentes ao subgênero Streptobacterium, segundo critérios de classificação estabelecidos por Orla-Jensen, pois possuem habilidade de crescer a temperaturas de 15° C (Orla-Jensen, 1919 apud London, 1976).

Desse modo, a utilização de bactérias lácticas e das substâncias por elas produzidas como bioconservadoras vem sendo crescente e deve ser profundamente explorada pelos pesquisadores, no sentido de desenvolver tecnologia para o isolamento e seleção de cepas produtoras de bacteriocinas, uma vez que cepas distintas produzem quantidades diferentes de bacteriocinas, sob as mesmas condições (Yezzi et al., 1993), e apresentam variado espectro de atividade antimicrobiana.

Porém, apesar dos resultados mais recentes serem muito animadores, existe a necessidade de se avaliar e conhecer, de forma mais completa, algumas das características mais relevantes da síntese de bacteriocinas, como a demonstração experimental de sua síntese em substratos alimentares, a existência de possíveis sistemas de regulação nos diversos substratos alimentares e a cinética de destruição por enzimas proteolíticas, entre outras (Hugas, 1998).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Set 2000
• Data do Fascículo
  Ago 2000

Histórico

• Recebido
  08 Fev 2000