Avaliação da função de macrófagos alveolares em cavalos clinicamente sadios

Evaluation of alveolar macrophage function in healthy horses

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Avaliação da função de macrófagos alveolares em cavalos clinicamente sadios

[Evaluation of alveolar macrophage function in healthy horses]

E. Mori, C.M.C. Mori, W.R. Fernandes

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo

Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87 - Cidade Universitária

05508-000 - São Paulo, SP

Recebido para publicação em 29 de agosto de 2000.

E-mail: [e-mail]

Financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP

RESUMO

Devido à importância dos macrófagos alveolares (MA) nos mecanismos de defesa pulmonar, foram realizados estudos para avaliar a atividade desses fagócitos em cavalos hígidos. Foram realizados lavados broncoalveolares (LBA) em cinco cavalos clinicamente sadios. A citologia foi realizada pela citocentrifugação das amostras e posterior confecção de lâminas coradas pelo método de Rosenfeld. Todas as amostras do LBA foram centrifugadas e a concentração celular foi ajustada para 2´10⁶ células/ml, para a mensuração da atividade macrofágica (testes de espraiamento, fagocitose e liberação de peróxido de hidrogênio). A contagem diferencial das células presentes no LBA demonstrou a predominância de macrófagos (59,0± 6,9%). Os resultados obtidos nos testes de mensuração da atividade macrofágica foram: índice de espraiamento 25,1± 19,7%, índice de fagocitose 89,4± 6,2% e liberação de peróxido de hidrogênio 1,6± 0,3nmoles/2´10⁵ células (sem PMA – phorbol 12-myristate 13-acetate) e 1,8± 0,4nmoles/2´10⁵ células (com PMA). Os resultados demonstraram um padrão de atividade para MA de cavalos hígidos, os quais apresentaram índices de ativação mesmo sem elicitação prévia, indicando que as técnicas utilizadas foram adequadas para tal propósito.

Palavras-chave: Cavalo, macrófago alveolar, fagocitose, lavado broncoalveolar

ABSTRACT

Due to the importance of alveolar macrophages (AM) in pulmonary defense mechanisms, studies were performed in order to evaluate the activity of these cells. Bronchoalveolar lavages (BAL) were obtained from five healthy horses, and cytology was performed on glass slides after cytocentrifugation of the samples. Slides were stained by Rosenfeld. All BAL samples were centrifuged and cell concentration was adjusted to 2´10⁶ cells/ml, for the measurement of AM activity (spreading, phagocytosis and hydrogen peroxide release tests). Differential counting of the BAL cells demonstrated that macrophages were the predominant type of cell (59.0± 6.9%). Measurement of AM activity presented the following results: spreading rate, 25.1± 19.7%, phagocytosis rate, 89.4± 6.2% and hydrogen peroxide release, 1.6± 0.3nmoles/2´10⁵ cells (without PMA– phorbol 12-myristate 13-acetate) and 1.8± 0.4nmoles/2´10⁵ cells (with PMA). Results presented a pattern for the activity of AM in healthy horses enabling the demonstration of an activation rate even without known previous eliciting factors. These results indicate that the tests of macrophage activity measurement are adequate for evaluation of phagocytic activity of AMs.

Keywords: Horse, alveolar macrophage, phagocytosis, bronchoalveolar lavage

INTRODUÇÃO

Um dos principais mecanismos de defesa do trato respiratório posterior contra a invasão de microrganismos e outras partículas inaladas depende da capacidade fagocítica dos macrófagos alveolares (MA) (Laegreid et al., 1988; Wong et al., 1990).

Métodos de avaliação in vitro da atividade fagocítica dos MA são importantes ferramentas para a investigação da integridade funcional dessas células, bem como para o estudo de interações entre os microrganismos e o hospedeiro (Raidal et al., 1998a; Raidal et al., 1998b). Os mecanismos-chave da função fagocítica celular são a quimiotaxia (migração de células fagocíticas em direção ao sítio infectado), a fagocitose (reconhecimento, fixação e ingestão do microorganismo) e a morte ou degradação intracelular dos microrganismos ingeridos (Zinkl, 1989; Cotran et al., 1994; Raidal et al., 1998a,b). Diversos autores mensuraram a capacidade de fagocitose de macrófagos alveolares de eqüinos, destacando-se os estudos que envolvem a ingestão de bactérias vivas pelos fagócitos in vitro (Zink et al., 1985; Hietala & Ardans, 1987; Traub-Dargatz et al., 1988), a ingestão de Candida albicans (Anderson et al., 1985), a ingestão de hemácias de carneiro opsonizadas com anticorpos anti-eritrócitos (Crisman et al., 1992) e a citometria de fluxo utilizando bactérias com marcadores fluorescentes (Raidal et al., 1998a).

Os MA tornam-se ativados, ou seja, aumentam sua atividade antimicrobiana, quando estimulados por determinados agentes. Essas células ativadas apresentam uma série de diferenças morfológicas, funcionais e metabólicas quando comparadas às células não ativadas. Os macrófagos ativados tornam-se maiores, aumentam sua capacidade de aderência e espraiamento em superfícies, aumentam a formação de pseudópodes e aumentam o número de vesículas pinocitóticas (Johnston Jr., 1988). A capacidade de aderência e espraiamento de macrófagos pode ser avaliada in vitro e é citada como uma tentativa de fagocitose que não foi bem-sucedida (Russo et al., 1989). Funcionalmente, ocorre a "explosão respiratória", resultando em aumento no consumo de oxigênio e na geração de metabólitos intermediários de oxigênio, como o ânion superóxido, radicais de hidroxila, peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e oxigênio singleto (Laegreid et al., 1988; Zinkl, 1989; Wong et al., 1990; Cotran et al., 1994). Esses agentes reativos antimicrobianos são importantes no processo de fagocitose e sua produção pode ser mensurada por diferentes métodos colorimétricos (Pick & Keisari, 1980; Pick & Mizel, 1981; Russo et al., 1989). Em relação à espécie eqüina, foram utilizados diversos métodos para a avaliação da atividade bactericida dos MA dependentes de oxigênio, durante a fagocitose, como por exemplo a quimioluminescência (Dyer & Wes Leid, 1983; Wong et al., 1990), a liberação de ânion superóxido (Brumbaugh et al., 1990), o teste de redução do corante tetrazólio (Crisman et al., 1992) e a citometria de fluxo (Raidal et al., 1998b).

Como foi descrito, os MA possuem papel fundamental nos mecanismos de defesa pulmonar contra a ação de microrganismos. Devido a isso, existe a necessidade de realizar investigações mais detalhadas relacionadas à atividade desses fagócitos na espécie eqüina. Os primeiros estudos referentes à avaliação da atividade de MA de cavalos utilizando as técnicas de espraiamento, fagocitose de partículas de Zymosan e liberação de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) pela oxidação do fenol vermelho foram realizados por Mori et al. (1999) e Mori (2000). O objetivo do presente trabalho é investigar a atividade de MA em cavalos hígidos, a partir de amostras celulares provenientes do lavado broncoalveolar (LBA), utilizando as técnicas acima mencionadas.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados cinco cavalos adultos, quatro machos e uma fêmea, com idade variando de 5 a 16 anos, sem raça definida, alojados em baias individuais com dimensões de 3,5´3,5 metros, no Setor de Experimentação em Eqüinos do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. A alimentação foi composta por 4kg de ração comercial e 4kg de feno para cada animal, divididos em duas vezes ao dia, e a água oferecida ad libitum. A cama utilizada nas baias foi a maravalha de pinos, trocada diariamente. Essas condições de alojamento e manutenção dos animais estão de acordo com as recomendações descritas no Canadian Council on Animal Care (Canadian... 1993). Todos os animais foram submetidos a exames físicos e de laboratório complementares, dando-se especial atenção ao sistema respiratório.

A técnica de colheita do LBA foi realizada segundo a descrição de Mori (2000). Um cateter de silicone, com 10mm de diâmetro externo, 2,5mm de diâmetro interno e 300cm de comprimento, foi introduzido pela narina até a altura dos pequenos brônquios, com o animal posicionado em estação e com a cabeça e o pescoço estendidos, sedado com cloridrato de xilazina na dosagem de 0,44mg/kg associada com butorfanol na dosagem de 0,033mg/kg por via intravenosa. Uma solução salina fosfatada tamponada estéril (PBS), associada com 5UI/ml de heparina sódica na dosagem de 5UI/ml, foi introduzida em alíquotas de 60ml em cinco vezes (volume total de 300ml) por esse cateter, sendo imediatamente aspirado por sucção leve com seringa.

Para a realização da citologia do LBA, foram confeccionadas lâminas pela citocentrifugação de 200ml das amostras de suspensões celulares, à velocidade de 28g por seis minutos. Essas lâminas foram fixadas com álcool metílico p.a. e coradas pelo método de Rosenfeld (1947) para a contagem diferencial das células.

Para a realização dos testes de função macrofágica, todas as amostras do LBA foram centrifugadas à velocidade de 450g durante 20 minutos à temperatura de 4° C. O sobrenadante foi desprezado e as células ressuspensas em 1ml de RPMI 1640 associado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, verificou-se a viabilidade celular pelo azul de tripan e a concentração foi ajustada para 2´10⁶ células/ml.

O teste do espraiamento foi determinado segundo o método descrito por Rabinovitch & De Stefano (1973). Alíquotas de 200ml da suspensão celular contendo 4´10⁵ células foram colocadas em duplicata sobre lamínulas de vidro, acondicionadas em placas de poliestireno com 24 poços e mantidas à temperatura ambiente durante 30 minutos. A seguir, as lamínulas foram lavadas e posteriormente recobertas com 1,0ml de RPMI 1640 enriquecido com 10% de SFB. As placas foram incubadas a 37° C durante uma hora, ao final da qual, as lamínulas foram lavadas novamente com RPMI 1640 enriquecido com 10% de SFB e, posteriormente, fixadas com glutaraldeído a 0,5% durante 10 minutos. Para a observação das células espraiadas, a leitura das lamínulas foi realizada em microscopia de contraste de fase com aumento de 600´. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem de células espraiadas

Para a realização do teste de fagocitose, as células do LBA foram processadas da mesma maneira descrita para o teste de espraiamento. Porém, antes da incubação, as lamínulas de vidro foram adicionadas de 1mg/poço de parede de células mortas de Sacharomyces cerevisiae (Zymosan). Para observação das células que fagocitaram as partículas de Zymosan, a leitura das lamínulas foi realizada em microscopia de contraste de fase com aumento 600´. Os resultados foram expressos em porcentagem de células que fagocitaram as partículas de Zymosan.

A liberação de H₂O₂ foi determinada segundo o método colorimétrico descrito por Pick & Keisari (1980), adaptado para microensaio por Pick & Mizel (1981), e modificado por Russo et al. (1989). Amostras de suspensões celulares do LBA contendo 2´10⁶ células/ml foram centrifugadas à velocidade de 450g, durante 10 minutos à temperatura de 4° C. O sobrenadante foi desprezado e as células ressuspensas em 1,0ml de solução de fenol vermelho (SFV) contendo 140mM de NaCl, 10mM de solução-tampão de fosfato de potássio, 5mM de glicose, 0,28mM de fenol vermelho e 8,5UI/ml de peroxidase de raiz forte. Alíquotas de 100µl dessa suspensão celular foram transferidas para oito poços de uma placa de microcultura de tecidos de poliestireno de 96 poços e fundo chato. Em quatro desses poços foram acrescidos 10ml de PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate). Na primeira coluna da placa foram preenchidos os oito poços apenas com 100ml da SFV, a qual foi chamada de branco. Nas segunda e terceira colunas foram colocadas em quadruplicatas concentrações molares previamente conhecidas de H₂O₂, a saber: 0,5, 1, 2 e 4nmoles de H₂O₂/100ml de SFV, de modo a permitir a obtenção de uma curva padrão. A placa foi incubada a 37° C por uma hora, em câmara úmida. A reação foi bloqueada pela adição de 10µl de NaOH a 1N em cada poço. A absorbância foi determinada em microleitor automático de ELISA, com filtro de 630nm. Os resultados obtidos após a leitura foram expressos em nmoles de H₂O₂ liberados por 2´10⁵ células, mediante equação de regressão linear com base na curva padrão.

Os resultados obtidos no teste de liberação de H₂O₂ foram analisados por meio da comparação entre as médias e desvios-padrão das amostras sem PMA e com PMA. O teste aplicado para a comparação dos grupos foi o t de Student. Estabeleceu-se o valor de 0,05 como nível de rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os exames físicos e de laboratório revelaram que todos os animais utilizados no experimento apresentavam-se hígidos, portanto sem sintomatologia compatível com afecções respiratórias.

Na citologia do LBA, os macrófagos foram o tipo celular predominante (Tab.1), confirmando a capacidade da técnica em obter amostras provenientes das vias aéreas mais distais (Zinkl, 1992). O número de macrófagos em LBA é semelhante aos relatados na literatura para animais hígidos (entre 30,0 e 60,0%) (Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989; Sweeney & Beech, 1991).

Apesar de se utilizar animais que não apresentaram sintomas de doença respiratória, observou-se no LBA um índice de neutrófilos mais elevado em relação aos observados na literatura (entre 1,2 e 14,4%) (Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989; Sweeney & Beech, 1991). Isso ocorreu provavelmente devido à resposta não específica determinada pela exposição à poeira das baias (Tremblay et al., 1993). Esses autores observaram aumento significativo no número de neutrófilos (de 8,7± 2,8% para 27,6± 7,8%) em LBA de cavalos sadios criados em pasto e posteriormente submetidos à estabulação.

No teste de viabilidade celular pelo azul de tripan, todas as amostras apresentaram índices superiores a 95%, indicando que a técnica de LBA utilizada foi capaz de recuperar células viáveis.

O teste do espraiamento demonstrou que os macrófagos de cavalos são capazes de espraiar-se, mesmo sem elicitação prévia (Tab.2). Tal resultado pode ser indicativo de maior atividade fagocítica dos macrófagos de cavalos, em comparação aos experimentos realizados com macrófagos de camundongos por Rabinovitch & De Stefano (1973). Os autores observaram índice de espraiamento de 3% em macrófagos de camundongos não elicitados. No presente experimento, as células aderidas e espraiadas in vitro possuíam diferenças morfológicas entre elas, semelhante às descritas por Dyer et al. (1983) para MA de eqüinos. Os MA aderidos e não espraiados apresentaram formato esférico e regular e ausência de projeções e vacúolos citoplasmáticos. Os macrófagos aderidos e espraiados apresentaram formato variável de fino e alongado até circular e simétrico, com presença de extensões semelhantes a pseudópodes e grande quantidade de vacúolos dispersos no citoplasma (Fig.1).

Neste trabalho analisou-se o índice de fagocitose de MA, independente de opsoninas, pela ingestão de partículas de Zymosan. Os resultados revelaram que mais de 80% das células aderidas in vitro foram mobilizadas para ingerir essas partículas, mesmo sem elicitação prévia. Outros autores também obtiveram resultados semelhantes, como Crisman et al. (1992), que observaram índices de fagocitose de 67,5± 11,5% em MA de eqüinos hígidos, utilizando hemácias de carneiro, e Traub-Dargatz et al. (1988), que observaram em eqüinos hígidos mais de 60% dos MA contendo bactérias no citoplasma. Estes dados confirmam que os MA de cavalos possuem grande capacidade de fagocitar partículas e, portanto, desempenham papel fundamental nos mecanismos de defesa pulmonar.

Nos ensaios para a mensuração da liberação de H₂O₂, observou-se que os MA de cavalos mostraram atividade mesmo na ausência de agentes elicitadores (Tab.2), diferindo do comportamento encontrado em macrófagos de camundongos, os quais necessitam de estímulo prévio pelo BCG-bacillus Calmette Guerin (Nathan & Root, 1977; Russo et al., 1989). Observou-se também que a liberação do peróxido de hidrogênio em MA de eqüinos não apresentou diferença (P>0,05) após a adição de PMA, diferindo dos resultados obtidos por Raidal et al. (1998b), nos quais o estímulo pelo PMA demonstrou que esses fagócitos aumentaram sua resposta de "explosão respiratória". Dyer & Wes Leid (1983) e Wong et al. (1990), ao utilizarem a técnica de quimioluminescência, observaram que os MA de cavalos hígidos são capazes de liberar metabólitos reativos de oxigênio durante o processo de fagocitose. A técnica utilizada no presente trabalho, para avaliar a "explosão respiratória" pela oxidação do fenol vermelho, apresenta a vantagem de possibilitar a identificação do metabólito liberado, fato esse não demonstrado pelos autores acima citados. A mensuração da liberação de H₂O₂ em cultura de células demonstrou ser um teste simples, rápido e de fácil execução, necessitando apenas de um leitor automático de absorbância em microplacas. Por se tratar de um microensaio, necessita de pequenas quantidades de reagentes e de número relativamente pequeno de células (2´10⁵ células/poço), permitindo assim a análise funcional de macrófagos provenientes de fluidos dos brônquios e alvéolos com baixas concentrações celulares. Também permite que um grande número de amostras possa ser testado em paralelo (Pick & Mizel, 1981).

CONCLUSÃO

Os resultados indicaram que as técnicas de espraiamento, de fagocitose de partículas de Zymosan e de liberação de H₂O₂ pela oxidação do fenol vermelho são adequadas para a avaliação da atividade de MA em cavalos. As observações referentes a função dos MA são importantes na elucidação dos mecanismos de defesa pulmonar, podendo ser utilizados em estudos futuros referentes à etiologia e à patogenia de afecções respiratórias em cavalos. Tais técnicas também são de fácil execução e de baixo custo, pois não requerem equipamentos ou laboratórios específicos para serem realizadas.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Abr 2001

Histórico

• Recebido
  29 Ago 2000