Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães: II - Efeito do protocolo de resfriamento

Spermatozoa quality of cryopreserved canine semen: II- Effect of cooling procedures

a17v53n3

Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães. II – Efeito do protocolo de resfriamento

[Spermatozoa quality of cryopreserved canine semen. II- Effect of cooling procedures]

R. Bueno¹, E.P. Costa², J.D. Guimarães², F.M. Valentim³

¹Curso de Veterinária da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais

32630-000 – Betim, MG

2Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa

3Estudante de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa

Recebido para publicação, após modificações, em 2 de abril de 2001

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Estudou-se o efeito de dois protocolos de resfriamento do sêmen de cães sobre a qualidade espermática in vitro, após sua criopreservação. Utilizaram-se três machos e realizaram-se cinco coletas em cada um deles. Os procedimentos de resfriamento foram realizados em um congelador de células (biocool) e em caixa de isopor. Foram avaliadas a motilidade, o vigor espermático, a integridade da membrana plasmática (teste hiposmótico), a integridade do acrossoma e a longevidade espermática (teste de termo-resistência). A comparação entre os protocolos de resfriamento mostrou que não houve diferença (P>0,05) entre a caixa de isopor e o biocool logo após o resfriamento. Após a descongelação os resultados foram semelhantes entre os protocolos, observando-se diferença (P<0,05) apenas na motilidade espermática e no teste de termo-resistência (TTR), os quais foram superiores na caixa de isopor.

Palavras-chave: Cão, sêmen, resfriamento, criopreservação

ABSTRACT

A study on cooling and equilibration procedures was performed in canine semen for evaluating the effects on in vitro characteristics of cryopreserved spermatozoa. Semen from three stud dogs was collected weekly during five weeks for the experiment protocol. The cooling systems were accomplished in a programmable cells freezer or in a polystyrene foam container. The evaluations employed were sperm motility and forward progression, and plasmatic membrane and acrosome integrity using the hypo-osmotic swelling test (HOS-T) and phase contrast microscopy, respectively, and semen longevity, using the thermo-resistance test. The comparative analysis of the cooling systems has showed that there was no difference (P>0.05) between the programmable freezer and the polystyrene container, immediately after cooling and equilibration times. Although after freezing and thawing the results of forward progression, HOS-T and acrosome integrity were equal for both cooling systems, best results for the motility and thermo resistance tests (P<0.05) were observed in the polystyrene container. The cooling rate in this system was of approximately –0.45° C/min and for the programmable freezer was of –0.55° C/min. The temperature fall was not constant in the polystyrene container and dropped faster in the beginning of the cooling time. It seems that this cooling rate at the polystyrene container favored the maintenance of spermatozoa energy sources. The tests results for both procedures were in agreement to the standard values for the freezing semen in dogs.

Keywords: Dog, semen, cooling, cryopreservation

INTRODUÇÃO

Segundo Watson (1995), o maior estresse da criopreservação está relacionado com a mudança de temperatura, que é traduzida como choque térmico, termo que se refere à sensibilidade peculiar do espermatozóide ao resfriamento repentino e rápido e, também, com a formação e a dissolução de gelo durante a congelação e a descongelação, respectivamente. Ainda, Hammerstedt et al. (1990) afirmaram que a mudança de temperatura durante o resfriamento do sêmen sabidamente altera as propriedades físicas da membrana espermática, podendo acarretar perda de sua integridade e da função celular.

Para evitar o choque térmico e permitir sucesso na congelação do sêmen, o tempo gasto e a curva imposta para o resfriamento são fatores importantes, pois aparentemente se esse período for controlado, os espermatozóides apresentariam modificações graduais na membrana plasmática e de fluxos iônicos, que renderiam à célula maior resistência durante a etapa seguinte, a de congelação (England, 1993; Watson, 1995). Adicionalmente, durante o resfriamento e equilíbrio controlados, os fosfolipídeos da gema de ovo (componente do diluidor) interagem com os lipídeos da membrana plasmática do espermatozóide, conferindo à célula maior resistência ao choque térmico, o que auxilia a preservar a integridade celular durante a preservação do sêmen (Quinn et al., 1980; Bouchard et al., 1990).

Para o resfriamento, o sêmen pode ser colocado em geladeira convencional, mas deve sempre ser acondicionado em um recipiente fechado e mantido à temperatura de 37° C para evitar queda de temperatura muito rápida (Linde-Forsberg, 1991). Outra forma de resfriamento do sêmen é por meio do uso de um recipiente com gelo, porém, deve-se evitar o contato direto do gelo com o recipiente de sêmen (Linde-Forsberg, 1991; Hay et al., 1997).

Poucos experimentos sobre criopreservação do sêmen canino relataram o procedimento utilizado para o resfriamento (Olar et al., 1989; Dobrinski et al., 1993). A maioria deles limitou-se em descrever somente o tempo de resfriamento e de equilíbrio e as temperaturas inicial e final aplicadas (Thomas et al., 1993; England & Ponzio, 1996; Rota et al., 1997; Rota et al., 1999).

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de dois procedimentos de resfriamento, práticos e não onerosos, sobre a qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães.

MATERIAL E MÉTODOS

O número e a raça dos cães utilizados, o procedimento de coleta e as características registradas do sêmen foram citados por Bueno et al. (2001). As avaliações da motilidade progressiva e da intensidade de movimento dos espermatozóides foram realizadas segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 1998).

Após a avaliação, o sêmen foi diluído no meio tris-citrato-gema de ovo (Rota et al., 1995), acrescido de 1mg/ml de estreptomicina e 4% de glicerol, na proporção de um volume de sêmen para um volume de diluidor. Após a pré-diluição, foram retiradas amostras de sêmen para os testes in vitro, seguida de centrifugação por seis minutos a 700g, para retirada do líquido seminal e padronização das amostras. Após a centrifugação e retirada do líquido sobrenadante, as amostras foram rediluídas; o volume do diluidor acrescentado foi suficiente para o ajuste da concentração total de espermatozóides de 100 milhões por ml.

O sêmen foi envasado imediatamente após a rediluição em palhetas de plástico de 0,5ml. Todo o processamento inicial do sêmen gastou cerca de 30 minutos, até que fosse submetido a dois protocolos de resfriamento, descritos a seguir.

Metade das palhetas foi colocada em um frasco pré-aquecido de vidro de 15cm de altura e 5cm de diâmetro, sistematicamente fechado para evitar contato direto das palhetas com a água e, então, colocado dentro de um recipiente de plástico de 20cm de altura e 12cm de diâmetro, com 1250ml de água a 37° C. Com esse procedimento, o frasco de vidro com as palhetas foi mantido incubado em água a 37° C para o resfriamento.

Ambos os recipientes foram acondicionados dentro de uma caixa de isopor de 32,5cm de altura, 2,0cm de espessura e 30,0cm de largura (Fig. 1), na qual foi deixado um espaço para acoplar o recipiente de plástico, para que permanecesse fixo dentro da caixa. A caixa foi previamente preparada com oito litros de gelo e água, volume pré-definido para se atingir, de modo aproximado, a curva de resfriamento desejada.

A queda de temperatura da água que estava em contato com o frasco de vidro onde estavam as palhetas foi controlada previamente com um termômetro digital. Essa aferição de temperatura permitiu a definição aproximada da curva de resfriamento do sêmen como sendo de –0,45° C/min (Fig. 2). Dessa forma, o resfriamento do sêmen ocorreu em cerca de 60 minutos, com temperaturas inicial de 37° C e final de 4° C. A seguir as amostras permaneceram por 60 minutos em equilíbrio em torno de 4° C, na mesma caixa de isopor.

A outra metade das palhetas foi resfriada em um congelador de células biocool, submetida a uma curva exata de resfriamento de –0,55° C/min, por 60 minutos, com temperaturas inicial de 37° C e final de 4° C (Fig. 3). As palhetas foram mantidas por 60 minutos a 4° C no biocool, em equilíbrio.

O sêmen foi pré-congelado por 15 minutos no vapor de nitrogênio líquido e mergulhado no nitrogênio líquido para a congelação final. A seguir as palhetas foram acondicionadas em um botijão até o momento de sua utilização. A descongelação foi realizada em banho-maria a 75° C, por oito segundos.

As amostras de sêmen foram avaliadas após a coleta, após a pré-diluição, após o período de resfriamento e equilíbrio e após a descongelação. A integridade da membrana plasmática foi avaliada em todas as etapas descritas, por meio do teste hiposmótico (HOS-T) segundo Kumi-Diaka (1993). A condição de acrossoma foi avaliada segundo Mies Filho (1982). A classificação do espermatozóide baseou-se na integridade do acrossoma, isto é, segundo o tipo de alteração, que incluiu desde edema e desprendimento até ausência de acrossoma. O resultado foi registrado em porcentagem de acrossomas íntegros. A longevidade do espermatozóide foi avaliada nas amostras de acordo com o teste de termo-resistência modificado (TTR), segundo Dimitropoulos (1967).

As comparações das médias das variáveis analisadas foram feitas pelo teste de Tukey (P<0,05) e estimaram-se as correlações de Pearson entre os testes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foi encontrada diferença entre procedimentos quanto à motilidade progressiva logo após o resfriamento (P>0,05). No entanto, após a descongelação a motilidade espermática foi maior nas amostras de sêmen resfriadas na caixa de isopor (P<0,01), quando comparada com a motilidade das amostras de sêmen resfriadas no biocool (Tab. 1). Com relação ao vigor espermático não houve diferença (P>0,05) entre os protocolos de resfriamento (Tab. 2).

Olar et al. (1989) relataram que o espermatozóide canino suporta uma certa variação nos períodos de resfriamento e equilíbrio, sem que essa variação tenha qualquer efeito prejudicial sobre a motilidade espermática antes da criopreservação. Contudo, os mesmos autores notaram decréscimo na motilidade espermática imediatamente após a descongelação, quando testaram vários períodos de resfriamento e equilíbrio do sêmen.

Entre o resfriamento realizado na caixa de isopor e no biocool o que diferiu foi a curva de temperatura imposta às amostras de sêmen, já que os períodos de resfriamento e equilíbrio foram os mesmos para ambos os protocolos. No resfriamento realizado na caixa de isopor a queda de temperatura foi mais acentuada no início, isto é, a temperatura decresceu cerca de 13° C em 10 minutos até alcançar 20° C (Fig. 2), enquanto que no biocool a queda de temperatura foi gradual, isto é, para alcançar os 20° C decorreram 30 minutos (Fig. 3). A queda mais acentuada da temperatura até atingir 20° C pode ter sido benéfica no sentido de diminuir rapidamente o metabolismo dos espermatozóides e manter por mais tempo suas reservas energéticas, necessárias para a movimentação da cauda espermática (Watson, 1995).

Por outro lado, poder-se-ia supor que a queda rápida de temperatura viesse a prejudicar a qualidade seminal, pois estaria causando choque térmico. Contudo, Quinn et al. (1980) e Watson (1995) afirmaram que o choque é mais pronunciado na faixa térmica de 12 a 0° C e nessa faixa de temperatura o resfriamento na caixa de isopor foi mais lento, gastando em torno de 30 minutos, e um pouco mais acentuado no biocool, ocorrendo em torno de 20 minutos. No entanto, parece que essa diferença não influenciou os resultados dos testes in vitro.

Bouchard et al. (1990) relataram resultados semelhantes de motilidade progressiva. Os autores obtiveram 65% de motilidade após o resfriamento, em amostras de sêmen submetidas a uma taxa de resfriamento de – 0,3° C/min até atingir 4° C.

Não foi observada diferença (P>0,05) entre os protocolos de resfriamento no teste hiposmótico nas várias etapas de processamento do sêmen (Tab. 3). O HOS-T avalia a funcionalidade da membrana plasmática, por testar uma de suas propriedades, a permeabilidade seletiva (Jeyendran et al., 1992). O resultado obtido do HOS-T para ambos os protocolos de resfriamento indica que eles foram eficientes em preservar a permeabilidade da membrana plasmática. Os valores encontrados são semelhantes aos relatados na literatura para a espécie canina, tanto para o sêmen resfriado (Kumi-Diaka, 1993; Rota et al., 1995) quanto para o sêmen congelado (Kumi-Diaka, 1993; England & Ponzio, 1996).

Os valores obtidos no teste hiposmótico demonstraram, também, que ambos os protocolos de resfriamento foram eficientes em proteger a célula espermática do choque térmico severo, que se estabelece entre 12 e 0° C (Quinn et al., 1980; Watson, 1995). Parece, portanto, que ambas as curvas de resfriamento impostas (Fig. 2 e 3) foram eficientes em minimizar o choque térmico nas células espermáticas, permitindo que alta porcentagem delas respondesse ao teste.

A avaliação da condição de acrossoma dos espermatozóides revelou que não houve diferença entre os protocolos de resfriamento do sêmen nas várias etapas do processamento (Tab. 4). A quase igualdade dos resultados quanto à integridade do acrossoma indica, novamente, que ambos os protocolos de resfriamento foram satisfatórios. Os valores obtidos são bastante semelhantes aos relatados na literatura (England & Ponzio, 1996; Strom et al., 1997; Rota, 1998). Ainda, segundo Watson (1995), a membrana acrossômica é um dos sítios espermáticos mais susceptíveis à lesões causadas pelo choque térmico e pela criopreservação. Assim, pelo resultado do teste parece que os protocolos foram eficientes em proteger o acrossoma.

Quanto à longevidade dos espermatozóides, o sêmen resfriado na caixa de isopor apresentou resultado superior no TTR após a descongelação das amostras (Tab. 5 e 6). Esses resultados confirmaram o que foi observado com a motilidade espermática, isto é, os espermatozóides das amostras de sêmen resfriado na caixa de isopor, por terem seu metabolismo diminuído mais rapidamente, também tiveram maior longevidade, observada durante o TTR.

Os valores do TTR encontrados são condizentes aos relatados na literatura para o sêmen congelado de cães (Thomas et al., 1992; Hay et al., 1997). Esses autores também utilizaram o meio tris-citrato-gema de ovo como diluidor do sêmen, e após duas horas de incubação relataram motilidade espermática de 30 a 40%.

Segundo a literatura, a taxa de descongelação influencia a longevidade espermática, ou seja, taxas rápidas aumentam a longevidade na espécie canina (England, 1993; Rota, 1998). Esses autores citaram que a descongelação a 75° C por cerca de oito segundos é superior à descongelação por 37° C por 50 segundos, aumentando a sobrevivência e a longevidade espermáticas. De modo geral, os resultados de todos os testes in vitro realizados no presente trabalho foram superiores aos obtidos por Bueno et al. (2001). Comparando-se as amostras de sêmen que foram diluídas com o meio tris-citrato-gema de ovo e resfriadas na caixa de isopor em ambos os trabalhos, a única característica que diferiu foi a taxa de descongelação.

Os resultados dos testes de descongelação lenta relatados por Bueno et al. (2001) foram, praticamente todos, inferiores aos dos testes nas amostras descongeladas com a taxa rápida deste trabalho. Valores mais marcantes ocorreram no TTR. A motilidade espermática para a taxa lenta de descongelação após duas horas de incubação do sêmen foi em torno de 12%, enquanto que com a taxa rápida foi de 38% (Tab. 5). Portanto, parece que a taxa de descongelação influenciou os resultados. Olar et al. (1989) e Rota (1998) relataram resultados semelhantes quanto à motilidade e à longevidade em amostras de sêmen descongeladas com taxas rápidas.

CONCLUSÕES

Os resultados demonstraram que tanto o congelador biológico programável (biocool) quanto a caixa de isopor devidamente preparada são eficientes para o resfriamento do sêmen destinado à criopreservação. Além disso, o baixo custo da caixa de isopor sugere o seu uso como alternativa na congelação de sêmen canino.

• BOUCHARD, G.F., MORRIS, J.K., SIKES, J.D. et al. Effect of storage temperature, cooling rates and two different semen extenders on canine spermatozoal motility. Theriogenology, v.34, p.147-157, 1990.
• BUENO, R., COSTA, E.P., GUIMARĂES, J.D. et al. Qualidade espermática do sęmen criopreservado de căes. I Efeito do meio diluidor. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, p.364-371, 2001.
• CBRA. Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal 2.ed. Belo Horizonte: 1998. 49p.
• DIMITROPOULOS, R. La signification du test de la thermorésitance dans l'appreciation de la valeur fécondante du sperme congelé. Ann. Méd. Vét, v.4, p.215-224, 1967.
• DOBRINSKI, I., LULAI, C., BARTH, A. D. et al. Effects of four different extenders and three different freezing rates on post-thaw viability of dog semen. J. Reprod. Fert. Suppl., v.47, p.291-296, 1993.
• ENGLAND, G.C.W. Cryopreservation of dog semen: a review. J. Reprod. Fert. Suppl., v.47, p.243-255, 1993.
• ENGLAND, G.C.W., PONZIO, p.Comparisons of the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed dog semen. Theriogenology, v.46, p.165-171, 1996.
• HAMMERSTEDT, R.H., GRAHAM, J.K., NOLAN, J.P. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J. Androl., v.11, p.73-88, 1990.
• HAY, M.A., KING, W.A., GARTLEY, C.J. et al. Canine spermatozoa- cryopreservation and evaluation of gamete interaction. Theriogenology, v.48, p.1329-1342, 1997.
• JEYENDRAN, R.S., VAN DER VEN, H.H., ZANEVELD, L.J.D. The hypoosmotic swelling test: an update. Arch. Androl., v.29, p.105-116, 1992.
• KUMI-DIAKA, J. Subjecting canine semen to the hypo-osmotic test. Theriogenology, v.39, p.1279-1289, 1993.
• LINDE-FORSBERG, C. Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extend semen. Vet. Clin. North Am.: Small Anim. Pract., v.21, p.467-485, 1991.
• MIES FILHO, A. (5.ed). Reproduçăo dos animais e inseminaçăo artificial Porto Alegre: 1982. 783p.
• OLAR, T.T., BOWEN, R.A., PICKETT, B.W. Influence of extender, cryopreservative and seminal processing procedures on post-thaw motility of canine spermatozoa frozen in straws. Theriogenology, v.31, p.451-461, 1989.
• QUINN, P.J., CHOW, P.Y.W., WHITE, I.G. Evidence that phospholipid protects ram spermatozoa from cold shock at a plasma membrane site. J. Reprod. Fert., v.60, p.403-407, 1980.
• ROTA, A., STROM, B., LINDE-FORSBERG, C. Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 4° C. Theriogenology, v.44, p.885-900, 1995.
• ROTA, A., STROM, B., LINDE-FORSBERG, C. et al. Effects of EQUEX STM paste on viability of frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38° C. Theriogenology, v.47, p.1093-1101, 1997.
• ROTA, A. Studies on preservation, capacitation and fertility of dog spermatozoa. Uppsala: Swedish University of Agricultural Sciences, 1998. 43p. (Tese, Doutorado).
• ROTA, A., IGUER-OUADA, M., VERSTEGEN, J. et al. Fertility after vaginal or uterine deposition of dog semen frozen in a tris extender with or without EQUEX STM paste. Theriogenology, v.51, p.1045-1058, 1999.
• STROM, B., ROTA, A., LINDE-FORSBERG, C. In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology, v.48, p.247-256, 1997.
• THOMAS, P.G.A., LARSEN R.E., BURNS, J.M.A et al. Comparison of three packaging techniques using two extenders for the cryopreservation of canine semen. Theriogenology, v.40, p.1199-1205, 1993.
• THOMAS, P.G.A., SURMAN, V., MYERS-WALLEN, V.N. et al. Addition of sodium dodecyl suphate to tris-citrate extender improves motility and longevity of frozen-thawed canine spermatozoa. In: Int. Cong. Anim. Reprod. AI, 12, 1992. Proceedings v.4, 1992. p.1823-1825.
• WATSON, P.F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and assessment of their post-thawing function. Reprod. Fertil. Dev., v.7, p.871-891, 1995.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Jun 2001

Histórico

• Recebido
  02 Abr 2001