Contagem de células somáticas em leite de cabra

Enumeration of somatic cells in goat milk

Contagem de células somáticas em leite de cabra

[ Enumeration of somatic cells in goat milk ]

P.V.D. Andrade¹, M.R. Souza2^*, I. Borges², C.F.A.M. Penna²

¹Mestre em Medicina Veterinária pela UFMG

2 Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 – Belo Horizonte, MG

Recebido para publicação, após modificações, em 9 de abril de 2001.

RESUMO

Este estudo foi conduzido visando comparar diferentes métodos usados para contagem de células somáticas (CCS) em leite de vaca e determinar qual estimaria com acurácia a contagem de células somáticas do leite de cabra. Quinze amostras de leite de cabra foram avaliadas pela microscopia direta, por citometria de fluxo, usando o aparelho Somacount 300, e pelo Wisconsin Mastitis Test (WMT). Os resultados foram, respectivamente, 6,07 log CCS/ml; 6,08 log CCS/ml e 5,54 log CCS/ml. A CCS média obtida pelo Somacount 300 foi similar (P>0,05) à contagem pela microscopia direta, enquanto o WMT subestimou a CCS do leite de cabra.

Palavras-chave: Leite de cabra, células somáticas, métodos de análise

ABSTRACT

This study was carried out to compare different methods used for enumerating somatic cells in cow milk in order to determine which of them would give accurate estimates of somatic cell counts (SCC) in goat milk. Fifteen samples of goat milk were analyzed by direct microscopy, flow citometry using Somacount 300 equipment and Wisconsin Mastitis Test (WMT). The results were, respectively, 6.07 log SCC/ml, 6.08 log SCC/ml and 5.54 log SCC/ml. The SCC mean obtained by Somacount 300 was similar (P>0.05) to that showed by direct microscopy count, while WMT underestimated goat milk SCC.

Keywords: Goat milk, somatic cells, analytical methods

INTRODUÇÃO

O termo células somáticas abrange diferentes elementos celulares normalmente presentes no leite, compreendendo células de defesa do organismo e células epiteliais de descamação. Entre os fatores que podem provocar aumento na contagem de células somáticas (CCS), as mamites, sobretudo as bacterianas, são os mais importantes. Por isso, a enumeração das células presentes no leite é uma boa forma de acompanhar o estado sanitário do úbere, além de indicar possíveis reduções na produção de leite e alterações na sua composição físico-química, com conseqüente comprometimento do rendimento industrial. Os dados obtidos por De Cremoux et al. (1999) mostraram que durante lactação de 200 dias cabras com CCS superior a 1.600.000 cel/ml produziram 21,2% menos leite do que animais com contagem inferior a 200.000 cel/ml. Os citados autores também relataram queda na quantidade de gordura e proteína produzidas, de 2 a 9kg e de 2 a 6kg, respectivamente.

O leite caprino, em comparação ao bovino, apresenta CCS fisiológica elevada e, apesar de ainda não existirem padrões estabelecidos para essa enumeração, segundo Zeng (1996), não seria rara a ocorrência de cabras com contagens superiores a 1.000.000 cel/ml. Isso se acentua no final da lactação, quando mesmo na ausência de infecções intramamárias ocorre severo aumento da CCS.

Outra particularidade do leite caprino são as partículas citoplasmáticas oriundas do processo de secreção láctea que, nessa espécie, é classificada como apócrina. Essas estruturas têm diâmetro e morfologia semelhantes a leucócitos, contêm grande quantidade de proteína e RNA, mas nenhum DNA (Dulin et al., 1982). Visando evitar que essas partículas sejam erroneamente contadas como células, na análise de leite de cabra deve-se utilizar apenas métodos que meçam especificamente o DNA. Diante disso, o presente estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar o uso de um contador automático e de um método semiquantitativo, o WMT, na análise de leite de cabra.

MATERIAL E MÉTODOS

Neste experimento analisou-se o leite de 15 cabras puras da raça Alpina, pertencentes a um capril de alta produção leiteira. Eram animais de idades variadas e em diferentes fases de lactação. Estimou-se a contagem de células somáticas do leite de cada cabra utilizando-se três diferentes métodos: a microscopia direta, o Wisconsin Mastitis Test (WMT) e um contador automático baseado em citometria de fluxo. Nos dois primeiros realizou-se apenas análise de leite cru e no mesmo dia de colheita. No caso do contador automático foram feitas análises em amostras conservadas com bronopol a 4% e mantidas sob refrigeração por um período máximo de seis dias. Esse aparelho realizou as contagens no leite cru e após pasteurização lenta (65°C por 30 min) e congelamento (–18°C) por uma semana, processamentos normalmente realizados no leite dessa espécie.

Como método de referência, fez-se a microscopia direta com azul de metileno (corante de Newman-Lampert modificado por Levowitz-Weber; APHA, 1992) e os resultados obtidos com essa metodologia foram usados para comparar com os dados dos outros dois métodos. Realizou-se o WMT também de acordo com APHA (1992), utilizando-se reagente comercial para CMT, de uma marca de uso corrente no laboratório e dentro do prazo de validade. Esse reagente foi diluído com água destilada na proporção de 1:1 e converteu-se o resultado com tabela específica (Philpot & Nickerson, 1992) estabelecida para leite bovino. O contador automático utilizado foi um Somacount 300 (Bentley Instruments Incorporated, Minnesota, EUA), controlado por computador. Esse aparelho funciona sob o princípio de citometria de fluxo, que consiste na contagem microscópica dos núcleos corados de células isoladas e deslocadas em frente da objetiva do microscópico por um líquido de escorrimento laminar (Cecalait, 1993).

No dia que antecedeu o início do experimento, calibrou-se o equipamento, segundo as instruções do fabricante, com uma série de quatro amostras-padrão de leite de vaca contendo 165.000 cel/ml (baixa contagem), 368.000 cel/ml (baixa / média), 700.000 cel/ml (média / alta) e 1.041.000 cel/ml (alta). Como o aparelho utilizado no experimento era bastante estável e as análises foram feitas em curto espaço de tempo, não foram necessárias calibrações freqüentes. Estas foram realizadas com leite de vaca na tentativa de simular o que ocorre naqueles laboratórios que analisam leite de cabra por esse método, onde um pequeno número de amostras e o alto custo dos padrões caprinos não justificam a modificação da calibração normalmente usada.

O experimento foi delineado em blocos ao acaso e empregou-se o esquema fatorial 3´3 para se estudar os efeitos de processamento e métodos de determinação. As médias foram interpretadas por análise de variância, usando o teste de SNK com nível de 5% de significância (Snedecor & Cochran, 1989). Os cálculos foram feitos no computador com o programa "SAEG" versão 7.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A CCS média obtida pela microscopia direta foi 1.163.000 cel/ml (6,07 log cel/ml) (Tab.1). Para melhor visualização da situação desse rebanho em relação às células somáticas, as cabras foram subdivididas em quatro categorias: baixa contagem (<500.000 cel/ml), média (500.001 – 750.000 cel/ml), alta (750.001 – 1.000.000 cel/ml) e muito alta (>1.000.001 cel/ml). Nesse capril observou-se predominância (40%) de animais com contagem superior a 1.000.000 (Fig.1), o que pode ter ocorrido em conseqüência da época em que o experimento foi conduzido, pois boa parte do rebanho estava terminando a lactação e outra parte estava iniciando.

Devido à sazonalidade da espécie, para garantir o fornecimento de leite durante todo o ano, os produtores costumam organizar duas estações de monta, uma natural e outra induzida. Isso faz com que o início da lactação de algumas cabras se sobreponha ao final de outras. Entretanto, mesmo no meio da lactação não é rara a ocorrência de animais com CCS superiores a 1.000.000, sem nenhum sinal clínico de mamite. Zeng & Escobar (1996) coletaram amostras mensais em rebanho da raça Alpina e obtiveram freqüência mais alta (51%) de animais com contagens superiores a 1 milhão.

Vários trabalhos foram conduzidos visando estabelecer a CCS de cabras não infectadas, mas a comparação dos resultados é uma tarefa árdua, visto tratar-se de variável muito influenciada por fatores biológicos e instrumentais. Poutrel & Lerondelle (1983) avaliaram as contagens no início e no meio da lactação e a média encontrada no Fossomatic foi de 5,79 log cel/ml em cabras sem infecção, 6,11 log cel/ml em animais infectados por estafilococos coagulase negativa e quando infectados por patógenos capazes de promover maior reação inflamatória (principalmente Staphylococcus aureus e Streptococcus sp.) a média foi de 6,68 log cel/ml. Dulin et al. (1982) obtiveram média de 5,14 log cel/ml em microscopia direta com corante de Levowitz-Weber. Em amostras de rebanhos da raça Alpina analisadas pelo Somacount 300 encontraram-se contagens médias muito semelhantes às aqui observadas de 6,09 log cel/ml (Zeng & Escobar, 1995) e de 5,95 log cel/ml (Zeng & Escobar, 1996). Quando se utilizou um aparelho Fossomatic calibrado com leite de cabra, a média geral de uma lactação de cabras da raça Alpina foi de 5,79 log cel/ml (Zeng, 1996).

As contagens (Tab.1) obtidas pela microscopia direta com o azul de metileno e pelo Somacount 300 calibrado com leite de vaca não foram estatisticamente diferentes (P>0,05) e a correlação entre os dois métodos foi positiva e alta (r=0,76). A representação gráfica (Fig.2) dos dados individuais mostra tendências semelhantes nas enumerações realizadas pelos dois métodos. Segundo Dulin et al. (1982), o corante Levowitz-Weber não diferenciaria células de partículas citoplasmáticas que contêm apenas RNA. Esses autores obtiveram contagens maiores quando se fez a microscopia com esse corante do que na microscopia direta com o verde de metila g-piromina, uma coloração DNA-específica, ou com o Fossomatic. Entretanto, neste experimento, quando as células foram contadas, associou-se a morfologia das células intactas com a observação da coloração. As células somáticas apresentavam forma aproximadamente circular, tamanho variável, mas normalmente grandes, com núcleo individualizado. Em contrapartida, o que foi considerado como partículas citoplasmáticas eram estruturas menores com formas diversas. Acredita-se que isso, juntamente com as enumerações repetidas, diminuiu o erro inerente à técnica. Zeng (1996) inferiu que o Fossomatic 300 quando calibrado com leite de vaca superestimou em 27,3% a CCS do leite de cabra.

Mesmo que o WMT tenha subestimado a CCS do leite de cabra, observou-se correlação positiva (P<0,05) entre WMT e Somacount 300 (r=0,73) e entre WMT e microscopia direta (r=0,53). Isso era esperado, pois esse é um método DNA específico e tem o mesmo princípio do CMT, cuja correlação com métodos automáticos também é positiva e alta (Poutrel & Lerondelle, 1983). Dulin et al. (1982) utilizaram o WMT para análise de leite de cabra e encontraram contagens altas quando comparadas às de outros métodos, o que foi atribuído à curva de regressão usada para predizer a concentração em células somáticas. A viscosidade do leite, medida por esse método, está principalmente relacionada ao conteúdo celular, mas depende também de sua composição físico-química. Por causa das diferenças entre o leite de cabra e o de vaca, a fim de se obter resultados mais acurados na avaliação da CCS, é necessário que se construa uma tabela específica para a espécie caprina.

A pasteurização do leite de cabra e o congelamento não interferiram nas contagens celulares efetuadas pelo Somacount 300 (Tab.2), uma vez que as contagens médias obtidas em todos os processamentos foram semelhantes (P>0,05). As células somáticas podem ser danificadas durante o congelamento, principalmente se não for realizado de maneira adequada. Porém, como os aparelhos automáticos não contam diretamente as células, mas sim a quantidade de material nuclear, o rompimento delas não compromete a leitura pelo Somacount, a não ser que os núcleos percam a capacidade de absorver o corante.

A possibilidade de preservar as amostras por períodos mais longos flexibiliza a colheita de leite de cabra e o envio até o laboratório, o que podem ser efetuado com maior prazo. Além disso, o tratamento térmico e o congelamento permitem armazenamento por períodos mais longos de amostras destinadas à calibração do aparelho.

CONCLUSÕES

Nas condições em que estes dados foram obtidos, conclui-se ser possível empregar o Somacount 300, calibrado com leite bovino, para se realizar contagem de células somáticas no leite de cabra. Entretanto, o WMT, para ser utilizado como método de contagem de células somáticas no leite dessa espécie, necessita de padronização.

AGRADECIMENTOS

Aos professores Mônica M.O.P. Cerqueira e Leorges M. Fonseca, pelas sugestões que muito enriqueceram esse trabalho. À Cooperativa Central dos Produtores Rurais de Minas Gerais, na pessoa de Tânia M.O. Leite, pelas análises no Somacount.

Referências bibliográficas

• APHA (American Public Health Association). Standard methods for the examination of dairy products. 16.ed. Washington: APHA, 1992. 546p.
• CECALAIT (Centre D'études et de Contrôle des Analyses en Industrie Laitičre) La lettre de CECALAIT, n.7, 1993.
• DE CREMOUX, R., MÉNARD, J.L., BAUDRY, C. et al. Incidence des inflammations de la mamelle sur la production et la composition du lait chez la chčvre. In: International Symposium on the Milking of Small Ruminants, 6, 1999, Athens. Proceedings Wageningen: Wageningen Press, 1999. Milking and milk products of dairy sheep and goats: p.157-163.
• DULIN, A.M., PAAPE, M.J., WERGIN, W.P. Differentiation and enumeration of somatic cells in goat milk. J. Food Protec., v.45, p.435-439, 1982.
• PHILPOT, W.N., NICKERSON, S.C. Mastitis: el contra ataque. Naperville: Babson Bros., 1992. 149p.
• POUTREL, B., LERONDELLE, C. Cell content of goat milk: California Mastitis Test, Coulter counter, and Fossomatic for predicting half infection. J. Dairy Sci., v.66, p.2575-2579, 1983.
• SNEDECOR, G.W., COCHRAN, W.G. Statistical methods 8.ed. Ames: Iowa State University Press, 1989. 503p.
• ZENG, S.S., ESCOBAR, E.N. Effect of parity and milk production on somatic cell count, standard plate count and composition of goat milk. Small Rum. Res., v.17, p.269-274, 1995.
• ZENG, S.S. Comparisons of goat milk standards with cow milk standards for analyses of somatic cell count, fat and protein in goat milk. Small Rum. Res., v.21, p.221-225, 1996.
• ZENG, S.S., ESCOBAR, E.N. Effect of breed and milking method on somatic cell count, standard plate count and composition of goat milk. Small Rum. Res., v.19, p.169-175, 1996.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Jun 2001

Histórico

• Recebido
  09 Abr 2001