Concentração mínima inibitória de dez antimicrobianos para amostras de Staphylococcus aureus isoladas de infecção intramamária bovina

Minimum inhibitory concentrations for ten antimicrobial agents against Staphylococcus aureus from bovine intramammary infection

Resumos

Determinou-se a concentração mínima inibitória (CMI) de ampicilina, cefalotina, eritromicina, gentamicina, neomicina, norfloxacina, oxacilina, penicilina G, tetraciclina e tilosina para 112 amostras de Staphylococcus aureus isoladas de infecções intramamárias bovina, em 33 rebanhos leiteiros da Zona da Mata do Estado de Minas Gerais. Foram isoladas 24 amostras de infecção clínica, 66 de subclínica e 22 de infecção crônica. As amostras de infecção crônica foram isoladas repetidas vezes dos mesmos quartos mamários de nove vacas de um rebanho, no período de 13 meses. A CMI foi realizada em ágar Mueller Hinton, com concentrações entre 0,015 e 128µgml-1 de cada antimicrobiano. As amostras da American Type Culture Collection (ATCC) recomendadas para controle de qualidade, S. aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, foram incluídas em cada teste. Cem por cento das amostras foram susceptíveis à cefalotina, eritromicina, gentamicina, norfloxacina e oxacilina, 91% à tetraciclina (CMI50: 0,5µgml-1) e à tilosina (CMI50: 2,0µgml-1), 65% à ampicilina (CMI50: 0,125µgml-1) e à penicilina G (CMI50: 0,06µgml-1). Todas foram susceptíveis à neomicina (CMI50: 0,5µgml-1) exceto uma amostra que apresentou um padrão intermediário. O nível de resistência para ampicilina e penicilina foi maior nas amostras isoladas de casos clínicos e nas de infecção subclínica com escores positivos no CMT (P<0,02). Nas isoladas de infecção clínica, o nível de resistência à tilosina foi maior (P<0,02). As amostras que apresentaram CMI > ou = 0,125µgml-1 para penicilina foram positivas para produção de beta-lactamase.

Mastite bovina; Staphylococcus aureus; susceptibilidade antimicrobiana; concentração mínima inibitória; beta-lactamase

The minimum inhibitory concentrations (MIC) for ampicillin, cephalothin, erythromycin, gentamicin, neomycin, norfloxacin, oxacillin, penicillin G, tetracycline and tylosin against 112 Staphylococcus aureus strains isolated from bovine intramammary infections were determined. The strains were originated from 33 dairy herds located in the Zona da Mata, Minas Gerais State. Twenty-four strains were isolated from clinical cases of mastitis, 66 from subclinical infections and 22 from chronic infections. The chronic infection strains were isolated from the same mammary quarters of nine cows of one herd over a period of 13 months. The MIC was performed on Mueller Hinton agar and concentrations, ranging from 0.015 to 128µgml-1, were evaluated for each antimicrobial agent. The American Type Culture Collection (ATCC) recommended quality control strains, S. aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, were included on each batch of test. All strains were susceptible to cephalothin, erythromycin, gentamicin, norfloxacin and oxacillin, 91% were susceptible to tetracycline (MIC50: 0.5µgml-1) and tylosin (MIC50: 2.0µgml-1), 65% to ampicillin (MIC50: 0.125µgml-1) and penicillin G (MIC50: 0.06µgml-1). All strains but one in the intermediate pattern, were susceptible to neomycin (MIC50: 0.5µgml-1). The resistance levels to ampicillin and penicillin were higher in strains isolated from clinical and subclinical (positive scores on CMT) cases (P<0.02). The resistance level to tylosin was also higher among the strains isolated from clinical infections (P<0.02). The strains with MIC > or = 0.125µgml-1 to penicillin were positive for ß-lactamase production.

Bovine mastitis; Staphylococcus aureus; antimicrobial susceptibility; minimum inhibitory concentration; beta-lactamase

Concentração mínima inibitória de dez antimicrobianos para amostras de Staphylococcus aureus isoladas de infecção intramamária bovina

[Minimum inhibitory concentrations for ten antimicrobial agents against Staphylococcus aureus from bovine intramammary infection]

M.A.V.P. Brito¹, J.R.F. Brito¹, M.A.S. Silva¹, R.A. Carmo²

¹Embrapa Gado de Leite

Rua Eugênio do Nascimento, 610

36038-330 – Juiz de Fora, MG

²Bióloga, Bolsista de Aperfeiçoamento do CNPq

Recebido para publicação em 9 de novembro de 2000.

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Determinou-se a concentração mínima inibitória (CMI) de ampicilina, cefalotina, eritromicina, gentamicina, neomicina, norfloxacina, oxacilina, penicilina G, tetraciclina e tilosina para 112 amostras de Staphylococcus aureus isoladas de infecções intramamárias bovina, em 33 rebanhos leiteiros da Zona da Mata do Estado de Minas Gerais. Foram isoladas 24 amostras de infecção clínica, 66 de subclínica e 22 de infecção crônica. As amostras de infecção crônica foram isoladas repetidas vezes dos mesmos quartos mamários de nove vacas de um rebanho, no período de 13 meses. A CMI foi realizada em ágar Mueller Hinton, com concentrações entre 0,015 e 128µgml^-1 de cada antimicrobiano. As amostras da American Type Culture Collection (ATCC) recomendadas para controle de qualidade, S. aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, foram incluídas em cada teste. Cem por cento das amostras foram susceptíveis à cefalotina, eritromicina, gentamicina, norfloxacina e oxacilina, 91% à tetraciclina (CMI₅₀: 0,5µgml^-1) e à tilosina (CMI₅₀: 2,0µgml^-1), 65% à ampicilina (CMI₅₀: 0,125µgml^-1) e à penicilina G (CMI₅₀: 0,06µgml^-1). Todas foram susceptíveis à neomicina (CMI₅₀: 0,5µgml^-1) exceto uma amostra que apresentou um padrão intermediário. O nível de resistência para ampicilina e penicilina foi maior nas amostras isoladas de casos clínicos e nas de infecção subclínica com escores positivos no CMT (P<0,02). Nas isoladas de infecção clínica, o nível de resistência à tilosina foi maior (P<0,02). As amostras que apresentaram CMI³0,125µgml^-1 para penicilina foram positivas para produção de b-lactamase.

Palavras-chave: Mastite bovina, Staphylococcus aureus, susceptibilidade antimicrobiana, concentração mínima inibitória, b-lactamase

ABSTRACT

The minimum inhibitory concentrations (MIC) for ampicillin, cephalothin, erythromycin, gentamicin, neomycin, norfloxacin, oxacillin, penicillin G, tetracycline and tylosin against 112 Staphylococcus aureus strains isolated from bovine intramammary infections were determined. The strains were originated from 33 dairy herds located in the Zona da Mata, Minas Gerais State. Twenty-four strains were isolated from clinical cases of mastitis, 66 from subclinical infections and 22 from chronic infections. The chronic infection strains were isolated from the same mammary quarters of nine cows of one herd over a period of 13 months. The MIC was performed on Mueller Hinton agar and concentrations, ranging from 0.015 to 128µgml^-1, were evaluated for each antimicrobial agent. The American Type Culture Collection (ATCC) recommended quality control strains, S. aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, were included on each batch of test. All strains were susceptible to cephalothin, erythromycin, gentamicin, norfloxacin and oxacillin, 91% were susceptible to tetracycline (MIC₅₀: 0.5µgml^-1) and tylosin (MIC₅₀: 2.0µgml^-1), 65% to ampicillin (MIC₅₀: 0.125µgml^-1) and penicillin G (MIC₅₀: 0.06µgml^-1). All strains but one in the intermediate pattern, were susceptible to neomycin (MIC₅₀: 0.5µgml^-1). The resistance levels to ampicillin and penicillin were higher in strains isolated from clinical and subclinical (positive scores on CMT) cases (P<0.02). The resistance level to tylosin was also higher among the strains isolated from clinical infections (P<0.02). The strains with MIC³0.125µgml^-1 to penicillin were positive for ß-lactamase production.

Keywords: Bovine mastitis, Staphylococcus aureus, antimicrobialsusceptibility, minimuminhibitoryconcentration, b-lactamase

INTRODUÇÃO

Diversos estudos que tratam da susceptibilidade a antimicrobianos de patógenos da mastite bovina no Brasil mostram aumento crescente no padrão de resistência, principalmente para Staphylococcus aureus, o agente mais freqüentemente isolado (Langoni et al., 1991; Brito & Brito, 1996). Os resultados mostram que o aumento da resistência é maior para os antibióticos b-lactâmicos. A susceptibilidade de S. aureus ou Staphylococcus spp. coagulase positivo para penicilina tem variado de 80% a 1,0% e para ampicilina de aproximadamente 80% a 13% (Ferreiro et al., 1985; Nader Filho et al., 1986; Langoni et al., 1991; Nader Filho et al., 1992).

A utilização de antimicrobianos para o tratamento da mastite clínica ou da mastite subclínica no início do período seco é um componente importante dos programas de controle (Bramley et al., 1996). A seleção do antimicrobiano apropriado é essencial, tanto do ponto de vista da saúde do animal, quanto da produtividade da glândula mamária. Os resultados dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos ajudam o veterinário clínico na escolha do medicamento apropriado (Francis, 1989; Sumano & Ocampo, 1992).

A grande maioria dos trabalhos que avaliaram a susceptibilidade a antimicrobianos dos patógenos da mastite no Brasil empregou a técnica de difusão do antibiótico em ágar. Esse método está padronizado e apresenta um detalhamento técnico bem definido, demonstrando alto grau de reprodutibilidade entre ou intra laboratórios (Woods & Washington, 1995). Contudo, os critérios de interpretação da medida do halo de inibição que determinam a susceptibilidade ou resistência são baseados em características dos agentes antimicrobianos observadas no soro ou nos tecidos humanos, e não foram validados para os patógenos da glândula mamária (Watts & Yancey, 1994; Ziv, 1995).

A susceptibilidade a antimicrobianos é também avaliada por meio da determinação da concentração mínima inibitória. Esse método está padronizado, possui detalhamento técnico bem definido e fornece resultados quantitativos (Woods & Washington, 1995; NCCLS, 1997). Os resultados obtidos podem ser interpretados considerando as características farmacológicas e farmacocinéticas dos antimicrobianos e a concentração mínima a ser alcançada no úbere (Sumano & Ocampo, 1992).

O objetivo deste trabalho foi determinar a concentração mínima inibitória de antimicrobianos usados no tratamento de mastite para amostras de S. aureus isoladas de infecção intramamária bovina. Avaliou-se também a produção da enzima b-lactamase nas amostras que foram inibidas por concentrações de penicilina ³ 0,06µgml^-1.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram avaliadas 112 amostras de S. aureus, isoladas de quartos mamários de vacas pertencentes a 33 rebanhos leiteiros localizados na Zona da Mata do Estado de Minas Gerais. Vinte e quatro foram isoladas de casos clínicos de mastite, 25 de quartos mamários com escores negativos no Califórnia mastite teste (CMT), 41 de quartos com escores positivos no CMT (três amostras com escore traço, sete com +, cinco com ++ e 26 com +++) e 22 de quartos com infecção crônica. Estas foram isoladas dos mesmos quartos mamários de nove vacas de um mesmo rebanho no período de 13 meses, sendo obtidas 12 amostras de quatro vacas e 10 e de cinco vacas.

O isolamento bacteriano foi feito a partir de leite coletado antes da ordenha, após cuidadosa anti-sepsia das tetas com álcool a 70%. Os jatos de leite foram coletados diretamente em frascos estéreis, colocados em caixas isotérmicas com gelo e encaminhados imediatamente ao laboratório para processamento. Volumes de 10µl de cada amostra foram semeados com alça calibrada e descartável em cada quadrante de uma placa de ágar-sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, de acordo com as recomendações de Harmon et al. (1990). As bactérias identificadas como S. aureus apresentaram reação fermentativa no meio de Hugh & Leifson, produção de catalase, coagulase e acetoína (Harmon et al., 1990).

A determinação da CMI foi feita pelo método da diluição dos antimicrobianos em ágar Mueller-Hinton, de acordo com as recomendações do NCCLS (1997). Foram utilizadas placas de vidro circulares de 100mm de diâmetro. Antes da esterilização, a parte externa do fundo das placas foi marcada em divisões quadriculadas de aproximadamente 1,4cm de lado, de modo que cada placa contivesse até 32 quadrados, permitindo a avaliação de até 32 amostras por placa.

Foram avaliadas concentrações de 128 a 0,015625µgml^-1 de cada antimicrobiano. As soluções foram preparadas de acordo com as recomendações de Anhalt & Washington (1985).

O meio de cultura foi preparado em volumes de 50ml e esterilizado em frascos individuais. Após esterilização, a temperatura do meio foi equilibrada entre 48 e 50^oC em banho-maria e o volume apropriado das soluções dos antimicrobianos foi adicionado para se obterem as concentrações desejadas. Foram preparadas duas placas para cada concentração, 18 horas antes da realização do teste. Em todos os testes foram incluídas duas placas sem os antimicrobianos como controle.

A suspensão-inóculo de cada amostra a ser testada foi preparada em solução salina (NaCl p/v 0,85%), a partir de culturas de 18-20 horas em ágar sangue, e a turbidez da suspensão padronizada com o tubo 0,5 da escala de MacFarland. As placas foram inoculadas com alças descartáveis, calibradas de 1µl, dentro de 30 minutos de preparo do inóculo.

Os seguintes antimicrobianos foram testados: ampicilina, cefalotina, eritromicina, gentamicina, neomicina, norfloxacina, oxacilina, penicilina G, tetraciclina e tilosina.

As amostras de bactérias da American Type Culture Collection (ATCC) recomendadas como controle de qualidade dos testes de susceptibilidade, Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), foram inoculadas em cada teste.

A leitura foi realizada após 18-20 horas de incubação a 35^oC, iniciando-se pelas placas sem antimicrobiano, depois pelas amostras-padrão, comparando-se as CMI obtidas às esperadas, seguindo-se as amostras em teste. Na determinação do ponto final de inibição, o aparecimento de somente uma colônia ou de crescimento muito leve no local do inóculo, difícil de ser visualizado a olho nu, não foi considerado (NCCLS, 1997). A susceptibilidade das amostras foi determinada de acordo com Woods & Washington (1995) e NCCLS (1997), considerando as seguintes CMI: ampicilina, £0,25µgml^-1, cefalotina, £8,0µgml^-1, eritromicina, £0,5µgml^-1, gentamicina, £4,0µgml^-1, norfloxacina, £4,0µgml^-1, oxacilina, £2.0µgml^-1, penicilina G, £0,12µgml^-1 e tetraciclina, £4,0µgml^-1. Para neomicina (£8,0µgml^-1), a concentração recomendada para susceptibilidade foi de acordo com o Mastitis Laboratory - National Veterinary Institute, Uppsala, Suécia, e para tilosina (£2,0µgml^-1), seguiu-se a recomendação do fabricante (Elanco, comunicação pessoal).

As diferenças encontradas na freqüência de amostras susceptíveis entre os diferentes grupos de amostras foram analisadas pelo teste do qui-quadrado (Wardlaw, 1987).

A produção de b-lactamase foi detectada usando nitrocefina, uma cefalosporina cromogênica, impregnada em bastões (Oxoid, ß-lactamase BR66). Foram testadas todas as amostras que apresentaram CMI³0,06µgml^-1 para penicilina (Woods & Washington, 1995). As colônias em meio de ágar-soja tripticaseína foram tocadas com os bastões contendo o reagente, e a leitura da viragem da coloração para vermelho foi feita de acordo com a recomendação do fabricante.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da determinação da CMI são apresentados na Tab. 1. Nas colunas CMI₅₀ e CMI₉₀ são apresentadas as menores concentrações (em µgml^-1) que inibiram 50% e 90% das amostras de S. aureus, respectivamente. As variações observadas nas CMI são apresentadas na quarta coluna. Pode-se observar que 100% das amostras foram susceptíveis à cefalotina, eritromicina, gentamicina, norfloxacina e oxacilina, 91% à tetraciclina e tilosina, 65% à ampicilina e penicilina e 99% à neomicina. Somente uma não foi susceptível à neomicina, a qual apresentou um padrão classificado como intermediário.

Variação no padrão de susceptibilidade de amostras de S. aureus isoladas de mastite tem sido observada entre regiões e mesmo entre rebanhos de uma região (Owens & Watts, 1988). Isso dificulta comparar os resultados obtidos neste estudo com outros realizados em outras regiões do Brasil. Além disso, o método utilizado difere do empregado em outros trabalhos brasileiros. As amostras avaliadas apresentaram níveis maiores de susceptibilidade que os relatados por Langoni et al. (1991) e Nader Filho et al. (1992) no Estado de São Paulo. Esses autores encontraram, respectivamente, percentuais de susceptibilidade de 23,1% e 15,2% para ampicilina, 72,1% e 66,1% para gentamicina, 13,7% e 1,7% para penicilina e 57,2% e 23,7% para tetraciclina. A susceptibilidade de S. aureus isolados no Rio Grande do Sul (Ferreiro et al., 1985) para eritromicina (97,3%) e oxacilina (95,5%) foi mais próxima à encontrada neste estudo, porém para penicilina G (46,4%) e tetraciclina (74,1%), foi menor. Amostras de S. aureus originárias da Zona da Mata do Estado de Minas Gerais foram avaliadas anteriormente por Ferreiro & Melo (1981). Os percentuais de susceptibilidade relatados para eritromicina, penicilina e tetraciclina foram, respectivamente, 99,3%, 61% e 91,6%. Considerando-se esses percentuais, observa-se que houve pequena variação na susceptibilidade para esses antimicrobianos (Tab. 1).

Todas as amostras resistentes à penicilina produziram b-lactamase, enquanto que as susceptíveis foram negativas. Dentre as amostras testadas, uma apresentou o padrão de produção da b-lactamase indutível, isto é, somente foi positiva após cultivo em presença de penicilina. A maior susceptibilidade à oxacilina e a menor à penicilina G e ampicilina estão de acordo com seus espectros de atividade, isto é, resistência às penicilinases (Yao & Moellering, 1995). Devido à maior estabilidade in vitro, a oxacilina é recomendada para avaliar a susceptibilidade das penicilinas resistentes às penicilinases (meticilina) (Woods & Washington, 1995). Segundo Ziv (1995), enquanto aproximadamente 50% dos S. aureus apresentam resistência à benzilpenicilina, a resistência à meticilina é rara entre aqueles isolados de glândula mamária bovina. Amostras de S. aureus resistentes à meticilina, isoladas de 20 rebanhos leiteiros na Bélgica, apresentaram características homogêneas, indicando serem uma única ecovariedade, possivelmente de origem humana (Devriese & Hommez, 1975). Ainda no grupo dos b-lactâmicos, o resultado de 100% de susceptibilidade a cefalotina indica que deverá ser obtido para outras cefalosporinas de espectro de atividade mais amplo, de segunda ou terceira geração.

Na Tab. 2 são apresentados os resultados da variação da susceptibilidade para ampicilina, penicilina, tetraciclina e tilosina entre os quatro grupos de amostras. O nível de resistência para ampicilina, penicilina e tilosina foi maior (P< 0,02) nas amostras isoladas de casos clínicos. O mesmo foi observado para ampicilina e penicilina (P< 0,02) nas isoladas de mastite subclínica com escores positivos no CMT. Mesmo considerando o pequeno número de amostras avaliadas por grupo, estes resultados indicam que os dois grupos de amostras estão mais sujeitos à pressão seletiva por parte dos antimicrobianos.

As amostras isoladas de infecção crônica apresentaram maior percentual de susceptibilidade. Isso, provavelmente, está relacionado aos procedimentos adotados no rebanho com relação ao uso de antimicrobianos para tratamento da mastite. Ziv (1995) observou que o tratamento no início do período seco durante 20 anos em alguns rebanhos não levou à seleção de variantes resistentes associadas ao tratamento. Este resultado sugere que estudos sobre o padrão de susceptibilidade de patógenos da mastite em rebanhos, considerando o esquema de tratamento empregado, poderão contribuir com informações úteis para orientar o uso racional de antimicrobianos.

Os resultados mostraram que, apesar do emprego disseminado de antimicrobianos para tratamento da mastite, tanto durante a lactação como no início do período seco, a maioria das amostras apresentou susceptibilidade aos antimicrobianos testados. A indicação terapêutica deve levar em consideração os valores obtidos pelas CMI, pois o tratamento deve proporcionar níveis de antimicrobiano maiores que a CMI no local da infecção. As propriedades farmacocinéticas do composto, incluindo solubilidade em lipídio, constante de dissociação e afinidade de se ligar à proteína, determinam a capacidade de penetração nos tecidos, a distribuição entre sangue e leite e a proporção ativa não ligada a outras substâncias no corpo do animal (Francis, 1989; Sumano & Ocampo, 1992). Com essa informação, o veterinário clínico poderá realizar a terapia de maneira racional, de modo a alcançar os benefícios esperados, tanto para a saúde do animal como para o controle da mastite.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (CAG 2235/96) e ao Dr. Rui da Silva Verneque pelas sugestões dadas para a análise estatística.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Out 2001

Histórico

• Recebido
  09 Nov 2000