Avaliações ultra-sonográfica, macroscópica e histológica da biopsia testicular em ovinos

Assessment of ultrasonographic images and gross and microscopic lesions of the testicular biopsy in sheep

Avaliações ultra-sonográfica, macroscópica e histológica da biopsia testicular em ovinos

[Assessment of ultrasonographic images and gross and microscopic lesions of the testicular biopsy in sheep]

R. Sartori ¹, N.C. Prestes ², A.M.O. Canavessi ³, W.G. Kempinas ⁴, G.J.M. Rosa ⁴

¹Dairy Science Department, University of Wisconsin

1675 Observatory Drive, Rm 852,

Madison, WI, USA, 53706

2Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP

3University of Wisconsin, Madison, WI, USA

4Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP

Recebido para publicação em 24 de novembro de 2000

Recebido para publicação, após modificações, em 3 de abril de 2002

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Devido ao fato da biopsia testicular poder acarretar hemorragia, inflamação, degeneração, aderência e fibrose, especialmente com as técnicas incisionais ou abertas, este trabalho avaliou a aplicabilidade de uma técnica menos invasiva (biopsia com agulha Tru-Cut) em ovinos na obtenção de material para histologia e acompanhou as lesões testiculares posteriores. Trinta carneiros foram igualmente divididos em três grupos: 1) controle, animais não submetidos à biopsia; 2) submetidos à biopsia + cola de fibrina nos locais da biopsia testicular e incisões da pele; e 3) submetidos à biopsia + sutura da pele escrotal após a biopsia. Exames ultra-sonográficos foram realizados pré e pós biopsia. No centésimodia, os testículos foram avaliados macro e microscopicamente após orquiectomia. A ultra-sonografia permitiu mapear as alterações ocorridas e acompanhar a evolução das seqüelas. Ao exame macroscópico, pequenas áreas de calcificação foram observadas em 55 e 70% dos testículos nos grupos 2 e 3, respectivamente. A biopsia com agulha Tru-Cut forneceu material suficiente para histologia mas ocasionou lesões focais restritas à área biopsiada. Apesar da possível ocorrência de calcificação e outras lesões mínimas, foi demonstrado que a biopsia com agulha Tru-Cut em ovinos é um procedimento seguro por não ter comprometido significativamente as características estruturais e funcionais dos testículos.

Palavras-chave: Biopsia, testículo, ovino, ultra-sonografia, histopatologia

ABSTRACT

Because testicular biopsy can cause hemorrhage, inflammation, degeneration, adhesion, and fibrosis, especially if using the incisional or open biopsy techniques, the present study evaluated if testicular biopsy with Tru-Cut needle (a less invasive technique) in rams provides enough material for histology, and followed the subsequent testicular lesions. Thirty rams were evenly assigned to three groups: 1) control, no biopsy; 2) biopsy + fibrin glue on biopsy sites and skin incisions; and 3) biopsy + scrotal skin suture after biopsy. Ultrasonographic examinations were performed before and after biopsy. Orchiectomy was carried out on day 100 and the testicles were examined for gross and microscopic lesions. Ultrasonography permitted to map testicular alterations and to follow the evolution of the lesions. Small areas of calcification were observed in 55 and 70% of testicles from groups 2 and 3, respectively. Testicular biopsy with Tru-Cut needle provided enough material for histology but induced small and focal areas of testicular lesions close to the biopsy site. In spite of the potential occurrence of calcification and other minimal lesions, it was shown that testicular biopsy with Tru-Cut needle in rams is safe because did not significantly compromise the functional and structural testicular characteristics.

Keywords:Biopsy, testicle, sheep, ultrasonography, histopathology

INTRODUÇÃO

Biopsia testicular é uma técnica complementar de exame andrológico útil no diagnóstico de casos de infertilidade ou subfertilidade (Lopate et al., 1989; Olson et al., 1992), além de possibilitar estudos da fisiologia reprodutiva em machos (Freneau et al., 1989; Guimarães et al., 1989). Sendo um método direto de avaliação do órgão afetado, a técnica de biopsia permite na maioria dos casos verificar a extensão da lesão, quando presente (Levin, 1979). Diferentes técnicas de biopsia testicular foram desenvolvidas, com vantagens e desvantagens (Threlfall & Lopate, 1992; Blanchard & Varner, 1996). Dentre essas destacam-se: biopsia aberta ou incisional, biopsia por punção com agulhas "Punch", "Split" ou "Tru-Cut" e punção aspirativa com agulha fina, sendo a primeira muito invasiva e a última pouco invasiva, mas com poder de diagnóstico limitado. Quando realizadas de maneira inadequada, especialmente as técnicas aberta ou incisional, podem ocorrer complicações como hemorragia, hematoma, calcificação, fibrose, inflamação, infecções, reações auto-imunes e degeneração do epitélio germinativo e dos túbulos seminíferos (Cohen et al., 1984; Lopate et al., 1989; Threlfall & Lopate, 1992). Alguns estudos têm sido feitos com a cola de fibrina derivada de veneno de serpente em tecidos de várias espécies animais, cujas propriedades adesivas, hemostáticas e cicatrizantes (Viterbo et al., 1993; Stolf et al., 1994) poderiam prevenir ou amenizar possíveis complicações advindas do uso da biopsia testicular. O objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade de uma técnica de biopsia testicular menos invasiva (biopsia por punção com agulha Tru-Cut), associada ou não à cola de fibrina derivada de veneno de serpente.

MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi conduzido no Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu, utilizando-se 30 ovinos mestiços, com idades entre um e dois anos e peso vivo médio de 34,1 kg, clinicamente sadios, com qualidade espermática normal (Mies Filho, 1987) e adquiridos de criatórios na região de Botucatu, SP.

Os carneiros, mantidos em sistema de confinamento, receberam alimentação à base de feno de coast-cross (Cynodon dactylon) e ração concentrada, fornecidos duas vezes ao dia e água ad libitum. Após um período de adaptação de 21 dias, os animais foram distribuídos em três grupos: 1- controle, animais não submetidos à biopsia (n = 10), 2- submetidos à biopsia e tratados com cola de fibrina no local da biopsia testicular e na incisão da pele (n = 10) e 3- submetidos à biopsia com sutura da pele escrotal (n = 10).

Após anestesia local peridural ou raquidiana no espaço lombo-sacro com 2 a 3ml de cloridrato de lidocaína 1% (Xylocaína; Hoechst Marion Roussel S.A., São Paulo, SP) e colocação de uma fita de latex funcionando como garrote na base da bolsa escrotal, realizou-se uma incisão de 2cm de comprimento no sentido longitudinal da bolsa escrotal na pele, na túnica dartos e na túnica vaginal parietal. A agulha Tru-Cut (Baxter Lab., Mortom Grove, IL, EUA) foi introduzida no parênquima testicular em posição oblíqua, no sentido caudo-cranial. No ato de remoção da agulha de biopsia fez-se a contenção da hemorragia com a aplicação local da cola de fibrina (grupo 2) ou compressão mecânica local com suabe estéril (grupo 3) e após realizou-se a síntese da pele (grupo 2) com a cola de fibrina (coaptaram-se os bordos da ferida com presilha depositando-se a cola sobre a linha de incisão) ou a sutura da pele (grupo 3) com pontos separados tipo U horizontal com fio de nylon monofilamento número 3-0 agulhado (Mononylon; Brasmédica, São Paulo, SP). Esse procedimento foi realizado em ambos os testículos de cada animal submetido à biopsia.

Cem dias após a biopsia testicular procedeu-se a orquiectomia bilateral quando se avaliaram as lesões macroscópicas. As lesões foram classificadas em: ausência de calcificação = 0, calcificação de grau leve = 1 (volume testicular < 1cm³), moderada = 2 (volume testicular > 1 e < 5cm³) e severa = 3 (volume testicular > 5cm³). Para avaliação histológica, fragmentos testiculares foram coletados de pontos distintos de cada testículo, sendo um no local exato da realização da primeira biopsia, a fim de se observarem as possíveis seqüelas decorrentes da aplicação dessa técnica.

Exames ultra-sonográficos dos testículos foram realizados um dia antes da biopsia testicular e quatro, oito, 14, 24, 50, 70 e 100 dias após com aparelho de ultra-sonografia com transdutor linear de 7,5 Mhz (Scanner 200, Pie-Medical, Maastricht, Holanda). Para melhor visualização fez-se tricotomia da região e deposição de carboximetilcelulose gel sobre a pele. Foram avaliadas imagens de cortes longitudinais dos testículos e estruturas adjacentes.

Avaliações da circunferência escrotal e das características seminais (motilidade espermática progressiva, número total de espermatozóides no ejaculado e patologia espermática) foram realizadas 100 dias após a biopsia testicular segundo Blom (1973) e Mies Filho (1987). O sêmen foi obtido por eletroejaculação.

Sangue, coletado da veia jugular 90 dias após a biopsia, foi centrifugado a 1600g por 10 minutos e o soro obtido armazenado a -20^oC para dosagem de testosterona livre. A concentração sérica de testosterona foi determinada por radioimunoensaio em fase sólida utilizando kits comerciais DPC (Coat-A-Count, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, EUA). O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 6,9% e a sensibilidade da análise foi de 0,15 pg/ml.

Os dados do exame andrológico e da dosagem de testosterona foram utilizados exclusivamente para estimar a correlação entre os diferentes graus de calcificação testicular pós biopsia e as características testiculares estruturais e funcionais.

Para avaliação histológica, os tecidos foram fixados em Alfac (85 partes de álcool etílico 80%, 10 partes de formaldeído 40% e cinco partes de ácido acético glacial, preparado no momento do uso) durante 24 horas, banhados em álcool etílico 80%, desidratados, embebidos em parafina, seccionados (7m m) e corados com hematoxilina e eosina. Pela microscopia ótica, foi realizada análise histológica dos túbulos seminíferos e do tecido intersticial com avaliação do aspecto geral e do epitélio germinativo. Para diagnóstico das formações de calcificação em algumas regiões do testículo próximas ao local da biopsia selecionou-se material macroscopicamente comprometido para confecção de lâminas, as quais foram coradas pela técnica de Von Kossa (McManus & Mowry, 1960), específica para deposições de cálcio.

A comparação dos graus de calcificação testicular entre os três grupos foi feita considerando-se o teste não paramétrico de Kruskal Wallis (Zar, 1984) usando-se a média de cada animal (calcificação nos dois testículos) como a variável resposta. Para o estudo de correlação entre os graus de calcificação e as características testiculares estruturais e funcionais 90 ou 100 dias após biopsia testicular foi utilizado o procedimento PROC CORR do programa computacional SAS (SAS, 1989).

RESULTADOS

Na primeira avaliação ultra-sonográfica antes das cirurgias os testículos apresentavam-se sem alterações. Após a biopsia, o exame ultra-sonográfico permitiu a identificação, mapeamento e acompanhamento da evolução das alterações testiculares. No quarto dia após a cirurgia as imagens mais evidentes em 30 testículos foram pequenas áreas de sombra acústica (Fig. 1). Em 10 testículos não se observaram alterações. Outros achados foram: grandes áreas circulares hipoecóicas no parênquima testicular (quatro casos) sugerindo hematomas (Fig. 2), pequenas áreas variando de hipo a hiperecóicas no ponto de inserção da agulha de biopsia (nove casos) e linhas anecóicas entre as túnicas (quatro casos) caracterizando derrame de líquidos (Fig. 3). Do quarto ao 14º dia os achados foram semelhantes. A partir do 24º dia as imagens apresentaram mudança drástica, havendo predomínio de formações lineares hiperecogênicas que, na maioria dos casos, refletiam perfeitamente o trajeto da agulha (Fig. 4). No 50º dia as áreas afetadas apresentavam-se mais extensas, e em alguns casos havia regiões hiperecogênicas distantes do ponto da biopsia, semelhantes a calcificações (Fig. 5). A partir do 50º dia, as imagens apresentaram pouca alteração, destacando-se apenas o aumento da ecogenicidade das áreas lesadas. Em um caso observou-se uma grande área de imagem hipoecogênica heterogênia, referente a um hematoma extra testicular próximo à cauda do epidídimo (Fig. 6). O processo involuiu e no 100º dia não se observou nenhuma alteração.

A principal lesão macroscópica foi a presença de áreas sugestivas de calcificação, de tamanhos variados (Fig. 7), onde a grande maioria aparecia na região de entrada da agulha de biopsia, com formato cônico, estreitando-se em direção ao mediastino. Em alguns casos a lesão ocorria em região distante do ponto de biopsia, mas sempre próxima à albugínea e geralmente na porção superior do testículo. No grupo-controle os testículos apresentaram-se sem alterações, diferente (P<0,05) do que ocorreu com os testículos submetidos à biopsia. No grupo 2 foram observados 11 testículos (55%) com calcificação e no grupo 3, 14 (70%). Entre esses dois grupos não se observou diferença (P>0,05) quanto à calcificação (Tab. 1).

Apesar da alta incidência de calcificação testicular (25/40; 62,5%) em decorrência da biopsia, não se observou correlação (P>0,10) entre o grau de calcificação e: circunferência escrotal (r = 0,38), motilidade espermática progressiva (r = -0,08), número total de espermatozóides no ejaculado (r = 0,06), patologia espermática (r = 0,02) e concentração sérica de testosterona livre (r = -0,06), aproximadamente 100 dias após a biopsia testicular bilateral.

A análise dos cortes histológicos do material de biopsia revelou que o fragmento retirado (média de 55 túbulos seminíferos por biopsia) foi suficiente para avaliação do aspecto geral do epitélio seminífero e do tecido intersticial (Fig. 8), apesar de haver discreta separação e distorção dos túbulos seminíferos, e que o parênquima dos testículos apresentava aspecto normal.

Ao final do experimento e após a orquiectomia pôde-se observar nos cortes correspondentes à área da primeira biopsia que o procedimento provocou lesões focais pequenas uni ou bilateral, com presença de número variável porém constante de túbulos seminíferos atrofiados e desorganizados, caracterizados pela diminuição do número de espermátides ou mesmo ausência de várias camadas de células do epitélio germinativo (Fig. 9). Os túbulos mais severamente degenerados apresentaram-se encolhidos (redução do diâmetro tubular), com grandes espaços entre eles, algumas vezes com grande quantidade de fibras do conjuntivo (fibrose peritubular), exibindo total perda das células germinativas, restando apenas células de Sertoli (Fig. 10). Nas áreas vizinhas aos locais de atrofia foram encontradas grandes áreas de tecido com aspecto histológico normal (Fig. 9 e 10).

Em praticamente todos os cortes distantes do trajeto da agulha o tecido testicular mostrou-se íntegro. Outro tipo de lesão comum nos dois grupos de animais foi a vacuolização e desestruturação do epitélio germinativo, sempre no sítio da biopsia (Fig. 9). A biopsia também provocou estase espermática pela interrupção de alguns dos túbulos seminíferos na área de incisão da agulha. Macroscopicamente observou-se nas biopsias frescas e fixadas calcificação distrófica nas áreas correspondentes ao local de incisão da agulha. Pela técnica de Von Kossa foi possível confirmar a deposição de cálcio nos túbulos seminíferos severamente atrofiados nas áreas de lesão.

DISCUSSÃO

O presente trabalho demonstrou a viabilidade da técnica de biopsia testicular com agulha Tru-Cut em ovinos e descreveu a evolução das lesões testiculares posteriores à biopsia, pelo acompanhamento ultra-sonográfico independente do uso da cola de fibrina derivada de veneno de serpente no local da biopsia e na incisão da pele ou da sutura da pele.

Com relação à ultra-sonografia, pouco se sabe sobre a evolução das imagens diante da ocorrência de um processo traumático, tal como a biopsia testicular e sua correlação com os achados macroscópicos e microscópicos. Algumas imagens coletadas no presente trabalho coincidem com as relatadas nas publicações sobre esse assunto. Destacaram-se as formações lineares hipoecogênicas extra testiculares nos primeiros dias após a biopsia, demonstrando pequeno derrame de líquido entre as túnicas, semelhantes à descrição de Eilts et al. (1989). Segundo Ahmad et al. (1991), discretas formações lineares hipoecogênicas podem ser observadas em testículos normais. A redução de tamanho das áreas circulares hipoecóicas e o aumento de sua ecogenicidade representando hematomas em organização foram observados por Del Vento et al. (1992) em eqüinos e por Ahmad & Noakes (1995) em caprinos e ovinos. Eilts et al. (1989) e Ahmad & Noakes (1995) observaram pontos ecogênicos em caprinos 30 dias após lesão testicular. Esses últimos constataram por meio de exames macro e microscópicos que as imagens observadas eram realmente de calcificação. Assim como Ahmad & Noakes (1995), os exames macroscópicos e histológicos do presente estudo confirmaram que as áreas com imagens de ecogenicidade densa referiam-se à processos de calcificação. Diferente de relatos sobre a imagem ultra-sonográfica observada nos casos de calcificação testicular (Ahmad & Noakes, 1995), neste experimento não se observou sombra acústica em muitos testículos onde a calcificação foi comprovada macro e microscopicamente. Deve-se destacar que em muitos casos em nenhum momento pôde-se notar qualquer alteração sugestiva de lesão testicular, prevalecendo as imagens homogêneas, apesar da utilização de um transdutor com imagem de alta resolução (7,5 Mhz). Del Vento et al. (1992), ao utilizar transdutor de 5,0 Mhz, falharam em identificar lesões nos testículos submetidos à biopsia de cinco eqüinos, apesar de apresentarem alterações macroscópicas pós castração.

Em princípio concluiu-se que a técnica de biopsia utilizada era inviável, pois acarretaria conseqüências severas. Contudo, não se observaram diferenças entre animais com diferentes graus de calcificação quanto à biometria testicular, qualidade espermática e concentração sérica de testosterona. Estes resultados fazem sentido se se considerar que o volume testicular comprometido com calcificação era mínimo (< 10% do volume total do testículo), mesmo quando o processo foi classificado como severo.

Diversos pesquisadores relataram que se os dois testículos têm a mesma consistência e biometria, o material obtido na biopsia unilateral freqüentemente é histologicamente representativo de ambos (Paufler & Foote, 1969; Meinhard et al., 1973). As observações deste trabalho (lesões focais no sítio da biopsia testicular e em áreas de calcificação distantes dessas em testículos com biometria normal) discordam dessas afirmações. A quantidade de cortes histológicos dos túbulos seminíferos presente nas lâminas variou de 30 a 80, a maioria com 50 a 60 cortes. Em trabalhos com outras técnicas, a biopsia com agulha calibre 14 de Vim-Silverman forneceu, em média, lâminas com 13 túbulos seminíferos e com agulha de Vim-Silverman calibre 12, 45 túbulos com pequena distorção do tecido intertubular (McDonald & Hudson, 1960). Lunstra & Echternkamp (1988) coletaram fragmentos de testículos de carneiros com dimensões aproximadas de 3mm x 10mm e peso médio de 70mg e relataram que nesse material houve alteração mínima (separação das células espermáticas) na qualidade das lâminas histológicas. Cohen et al. (1984), comparando agulha Tru-Cut com a técnica aberta, concluíram que a aparência histológica do interstício testicular foi melhor com o método aberto, mas apesar disso a acurácia do diagnóstico com a Tru-Cut não foi afetada. No presente trabalho apenas três biopsias (7,5%) não forneceram material testicular adequado para o exame histológico pois as lâminas continham apenas albugínea testicular. Com resultados semelhantes, Cohen et al. (1984), em 20 biopsias realizadas com a mesma agulha em homens, encontraram apenas albugínea em uma das lâminas (5%). Kessaris et al. (1995), em 24 biopsias percutâneas com agulha ASAP 18 em homens, falharam em prover tecido adequado em dois casos (8,3%). Portanto, não se pode descartar a possibilidade, apesar de ser rara, de ocorrer insucesso na coleta de tecido testicular com a agulha Tru-Cut, ou com qualquer outra técnica pouco invasiva. Para minimizar esse problema, Kessaris et al. (1995) enfatizaram a necessidade de na biopsia percutânea se fazer incisão na pele antes da introdução da agulha. McDonald (1960) observou alterações testiculares (calcificações) somente no sítio da biopsia testicular e Eaglessome et al. (1979) e James et al. (1979) encontraram uma zona central de alterações no trajeto da agulha. A extensão das lesões histológicas observadas 100 dias após a biopsia na maior parte do material é semelhante às relatadas por McDonald (1960), Eaglessome et al. (1979) e James et al. (1979), porém, em alguns casos a calcificação testicular, apesar de próximo ao sítio da biopsia, não se restringiu apenas ao trajeto da agulha. Essa observação é pertinente pois Veeramachaneni et al. (1986) descreveram que a deposição de cálcio é atribuída ao acúmulo de espermatozóides mortos ou degenerados nos túbulos seminíferos obstruídos.A calcificação distrófica nas áreas correspondentes aos locais de incisão da agulha foi a lesão histológica mais significativa observada aos 100 dias após a biopsia. McDonald (1960) revelou os mesmos achados com sete e 13 semanas após a biopsia em touros, porém não encontrou mais nenhum sinal de calcificação testicular 12 meses depois e sugeriu ter havido reabsorção dos depósitos de minerais, além da resolução de qualquer dano no epitélio seminífero. Eaglessome et al. (1979) não observaram lesões microscópicas 180 dias após biopsia testicular em touros. Portanto, pode-se deduzir que as lesões testiculares acarretadas pela biopsia além de focais e restritas talvez desapareçam com o passar do tempo. Com relação às técnicas de preparo do material histológico e concordando com as observações de Sartori Filho et al. (1996), comprovou-se que o fixador Alfac comportou-se de forma adequada, permitindo a montagem de lâminas histológicas de alta qualidade, além de ser de fácil confecção e utilização.

CONCLUSÕES

Os achados ultra-sonográficos posteriores à biopsia testicular permitiram mapear as alterações ocorridas e acompanhar a evolução das seqüelas. Apesar da possível ocorrência de calcificação e outras lesões mínimas, foi demonstrado que a biopsia com agulha Tru-Cut em ovinos é um procedimento seguro por não comprometer as características estruturais e funcionais dos testículos. A cola de fibrina não apresentou vantagem quanto à prevenção de lesões testiculares decorrentes da biopsia em relação à sutura convencional.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem I. A. Thomazini-Santos, M. J. Toscano, M. J. S. M. Giannini and B. Barraviera, do CEVAP, UNESP, Botucatu, pela cola de fibrina derivada de veneno de serpente e ao suporte financeiro da FAPESP (processo 95/3958-0) e bolsas da CAPES.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 2002
• Data do Fascículo
  Jun 2002

Histórico

• Recebido
  03 Abr 2002