Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de queijo-de-minas artesanal do Serro (MG) frente a microrganismos indicadores

Antimicrobial activity of lactic acid bacteria from artisanal minas cheese against indicator microorganisms

Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de queijo-de-minas artesanal do Serro (MG) frente a microrganismos indicadores

[Antimicrobial activity of lactic acid bacteria from artisanal minas cheese against indicator microorganisms]

D.P. Alexandre, M.R. Silva, M.R. Souza, W.L.M. Santos

Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30.123-970 - Belo Horizonte, MG

Recebido para publicação em 2 de abril de 2001

Recebido para publicação, após modificações, em 24 de janeiro de 2002

Projeto financiado pela FAPEMIG processos de números CAG-2298/97 e CAG-00084/00

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Isolaram-se 192 cepas de bactérias lácticas de cinco amostras de queijo-de-minas artesanal, oriundos da região do Serro, MG. Os resultados da prova de inibição direta indicaram que 48 cepas isoladas (25%) foram capazes de inibir o crescimento in vitro de microrganismos indicadores, dentre os quais Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. As 48 cepas foram submetidas à prova de inibição indireta. Verificou-se que 20,8% (10/48) das cepas demonstraram amplo espectro antimicrobiano frente a microrganismos como: Salmonella enteritidis var. typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Listeria innocua. Nenhuma das cepas isoladas foi capaz de inibir Escherichia coli.

Palavras-chave: Bactéria láctica, queijo artesanal do Serro, atividade antimicrobiana

ABSTRACT

A total of 192 strains of lactic acid bacteria were isolated from five samples of artisanal minas cheese, from Serro region - Minas Gerais State. The results of direct inhibition test indicated that 48 strains (25%) inhibited the in vitro growth of the indicator microorganisms: Staphylococcusaureus and Listeriamonocytogenes. Those 48 strains were tested by the indirect inhibition test, and 10 strains (20.8%) showed a wide antimicrobial spectrum against Salmonellaenteritidisvar. typhimurium, Staphylococcusaureus, Listeria monocytogenes and Listeria innocua. None of the isolated strains was able to inhibit Escherichia coli.

Keywords: Lactic acid bacteria, artisanal cheese, antimicrobial activity

INTRODUÇÃO

Mesmo com as pressões de modernização dos processos de produção, que no curso da história forçaram a introdução da pasteurização do leite destinado à fabricação de queijos, as práticas tradicionais permanecem vivas e atuantes em Minas Gerais (Vargas et al., 1998). Sobrevivendo a essas transformações, resta a secular fabricação de queijo da região do Serro (Furtado, 1980).

O queijo artesanal da região do Serro é produzido desde o século XVIII e, atualmente, expressivo número de pessoas vivem exclusivamente da produção e comercialização desse tipo de queijo (Furtado, 1980; Vargas et al., 1998).

O leite cru constitui boa fonte de bactérias lácticas passíveis de serem utilizadas pela indústria laticinista nacional, especialmente pelo fato de estarem adaptadas às condições do clima e da matéria-prima, sendo ainda necessários maiores estudos sobre suas características individuais e específicas.

As bactérias lácticas têm grande importância econômica, já que de forma natural ou adicionada intencionalmente, desempenham importante papel na fermentação de grande variedade de alimentos. Suas atividades metabólicas não apenas contribuem para o desenvolvimento de características sensoriais desejáveis com também permitem conservar ou aumentar o valor nutritivo da matéria-prima (Magro et al., 2000a).

As bactérias lácticas constituem um grupo de microrganismos Gram-positivos e catalase negativos muito heterogêneos. Os gêneros tradicionais são: Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Vagococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc e Carnobacterium (Schleifer et al., 1995).

A capacidade de produzir grande quantidade de ácidos orgânicos (fundamentalmente ácido láctico), por fermentarem os carboidratos presentes nos alimentos e conseqüentemente reduzirem o pH, é o fator primário em que se baseia a atividade antimicrobiana das bactérias lácticas (Magro et al.,2000a). Além disso, as bactérias lácticas têm capacidade de produzir outras substâncias inibitórias, tais como: peróxido de hidrogênio, diacetil, metabólitos de oxigênio entre outras (Piard & Desmazeaud, 1991).

As bacteriocinas produzidas por bactérias lácticas têm despertado grande interesse científico e industrial devido ao seu potencial como biopreservantes alimentares (Jack et al., 1995; Magro et al., 2000b). Esses compostos antimicrobianos têm recebido especial interesse tanto da comunidade científica como das indústrias alimentícias. Este interesse está relacionado com o fato de algumas bacteriocinas inibirem bactérias adulterantes e patogênicas (Adams & Nicolaides, 1997; Magro et al., 2000a).

O presente trabalho teve como objetivos isolar bactérias lácticas de queijos artesanais produzidos na região do Serro - Minas Gerais e avaliar a capacidade inibitória do crescimento bacteriano dessas cepas frente a diversos microrganismos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram coletadas cinco amostras de "queijo-de-minas do Serro" entre fevereiro e maio de 2000. As amostras foram adquiridas na Cooperativa dos Produtores de Queijo da Região do Serro, localizada no Ceasa-MG. Os queijos tinham, em média, 15 dias de estocagem.

De cada amostra coletaram-se assepticamente 20 gramas de diversas áreas da amostra, utilizando-se material previamente esterilizado, as quais foram transferidas para uma bolsa plástica contendo 180ml de água peptonada 1% e cloreto de sódio 0,85%. A bolsa plástica foi levada ao "Stomacher 400", onde se procedeu a homogeneização por cinco minutos. O homogeneizado foi incubado em estufa de cultura a 35ºC, por duas horas. A seguir, alíquotas de 1ml foram inoculadas em tubo de ensaio contendo 9ml de água peptonada 1% e cloreto de sódio 0,85%. A partir desse tubo foram obtidas diluições subseqüentes até a diluição 10^-6. De cada uma das diluições, alíquotas de 100ml foram semeadas em sistema de "pour plate" em ágar MRS (OXOID) em placas de petri (90x15 mm) e incubadas em estufa bacteriológica (Estufa de cultura Modelo 002 CB Fanem Ltda), a 35ºC, por 48 horas (Santos,1993).

Após o crescimento, as colônias selecionadas (preferencialmente as maiores lisas e com bordas definidas) foram transferidas para placas contendo ágar MRS (OXOID), sendo uma delas mantida como "stock" (placa-mãe) e as demais destinadas à prova de inibição direta

Para a realização da prova de inibição indireta foi preparado o sobrenadante livre de células (SC). Foram pipetados 100ml da cepa de bactéria láctica selecionada, transferidos para tubos com 10ml de caldo MRS (Merck) e incubados a 35ºC por 18 horas. Após esse período o conteúdo foi centrifugado ("Sorvall Superspeed" modelo RC-2b) (10.000 rpm durante 10 minutos), teve o pH ajustado na faixa de 6,3-6,4, foi filtrado por meio de membranas filtrantes GS em éster de celulose com 0,22mm de diâmetro de poro e 25mm de diâmetro ("Millipore") e posteriormente liofilizado (Liofilizador "Metal-Lux" modelo MLL10-3-80) (-50ºC por 15-19 horas). Finalmente o material foi ressuspendido utilizando-se tampão fosfato 4mM pH 7, com a finalidade de se obter um sobrenadante 20 vezes mais concentrado.

Obtido o SC, para cada cepa indicadora foram preparadas seis placas de Petri destinadas ao teste de difusão do SC. Foram utilizadas placas de Petri (90x15mmmm ) incubadas a 37ºC durante duas horas para secagem e fixação do ágar. Em seguida foram realizados oito furos com 6mm de diâmetro e em cada furo foram adicionados 50ml do SC das cepas de bactérias lácticas a serem testadas. As placas foram levadas à estufa de cultura à 4ºC, onde permaneceram por duas horas e em seguida incubadas a 37ºC durante 24-48 horas. Os halos de inibição ao crescimento desses microrganismos indicadores foram mensurados com a ajuda de um paquímetro. Halos £ 1mm foram considerados como halos inibitórios (Santos,1993).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De cada amostra de queijo foram isoladas 38 cepas, em média, totalizando 192 cepas coletadas. Todas as cepas foram examinadas na prova de coloração pelo método de Gram e pela prova de catalase; as Gram-positivas e catalase negativas foram classificadas como pertencentes ao grupo das bactérias lácticas.

Para a avaliação preliminar da capacidade inibitória, observou-se formação de halos de inibição bem definidos ao redor das cepas de bactérias lácticas isoladas, e sua presença foi relacionada com a capacidade de inibição direta do microrganismo indicador testado. Foram utilizados cinco microrganismos indicadores, Lactobacillus sake 2714, Listeria innocua BL 86/26, Listeria monocytogenes Scott A, Staphylococcus aureus FRI-184 e Staphylococcus carnosus Mc1.

Das 192 cepas de bactérias lácticas avaliadas pelo método de inibição direta, 48 (25%) levaram à formação de halo de inibição sobre pelo menos um dos microrganismos indicadores testados e 144 (75%) não foram capazes de inibir nenhum dos microrganismos indicadores utilizados. Dabéset al. (2001) encontraram resultados semelhantes, isto é, das 288 cepas isoladas, 79,5% não apresentaram atividade antimicrobiana frente aos microrganismos testados. Prado et al. (2000) e Carvalho (1996) encontraram valores de 67,6% e 70,8%, respectivamente. Martínez et al. (1995), ao avaliarem 180 cepas, observaram que apenas 13% apresentaram alguma atividade inibitória e 87% não apresentaram nenhuma atividade. Os resultados obtidos são apresentados na Tab. 1.

Prado et al. (2000), ao testarem a atividade inibitória direta de cepas de bactérias lácticas isoladas de embutidos cárneos, observou que das 336 cepas isoladas, 40 (11,9%) inibiram cepas de Staphylococcus aureus FRI-184. Valores semelhantes foram encontrados no presente estudo, no qual 15,6% (30 cepas) foram capazes de inibir esse mesmo microrganismo. Dabéset al. (2001) encontraram resultados semelhantes, 13,5%, enquanto que Coventry et al. (1997) observaram que 13% das cepas isoladas de produtos cárneos inibiram o crescimento do S. aureus e 25% das cepas originárias de produtos lácteos conseguiram essa inibição.

Quanto à atividade antimicrobiana direta frente à Listeria monocytogenes Scott A, 29 cepas (15,1%) apresentaram capacidade de inibição a esse microrganismo. Alguns trabalhos semelhantes, utilizando esse mesmo indicador, mostraram valores próximos, como Carvalho (1996), 9,8% de inibição positiva, e Cintas et al. (1997) 8,3% de inibição direta frente à Listeria. Coventry et al. (1997) observaram que 25% das cepas isoladas de produtos lácteos foram capazes de inibir o crescimento desse patógeno.

Dabéset al. (2001), ao avaliarem a capacidade inibitória direta frente ao Staphylococcus carnosus e Lactobacillus sake, observaram que 32,2% e 28,8% de cepas, respectivamente, inibiram os crescimentos desses microrganismos. Esses valores foram um pouco maiores do que os encontrados neste estudo, de 22,4% e 20,3%, respectivamente.

Quanto ao teste de inibição indireta, os resultados encontram-se na Tab 2.

A maioria dos microrganismos indicadores utilizados tiveram alta sensibilidade aos sobrenadantes testados, excetuando-se Escherichia coli B-41, não inibida por nenhum sobrenadante. Pode-se observar que os patógenos Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Salmonella enterica subsp. enterica var. typhimurium foram inibidos por grande parte dos SC testados. A única bactéria láctica testada (Lactobacillus sake) mostrou-se mais resistente do que as demais, na qual apenas 33,3% das cepas isoladas produziram atividade antagonista frente a esse microrganismo.

Desconsiderando a Escherichia coli B-41, dos 48 SC testados apenas oito (16,6%) não mostraram atividade inibitória contra os microrganismos indicadores, pois possivelmente os fatores de inibição demonstrados no teste de inibição direta para essas cepas não se encontram no SC. Somente 10 SC (20,8%) provocaram halos de inibição contra todos os indicadores, concluindo-se que essas cepas apresentaram amplo espectro de atividade frente à bactérias de gêneros diferentes.

Nenhum SC foi capaz de inibir Escherichia coli B-41. Semelhante resultado foi encontrado por Uhlman et al. (1992) e Ennahar et al. (1996). Vignolo et al. (1993), ao utilizarem cepas de Lactobacillus casei CRL 705, obtiveram inibição frente à E. coli, enquanto que Vescovo et al. (1996), ao usarem quatro cepas de Lactobacillus e uma de Pediococcus, obtiveram ação inibitória frente a esses patógenos com apenas duas cepas de Lactobacillus spp.

Foram encontrados valores de inibição de 83,3% para Salmonella enterica subsp. enterica var. typhimurium ICB, 33,3% para Lactobacillus sake 2714, 56,2% para Staphylococcus aureus FRI-184, 66,6% para Listeria innocua BL-86/26 e 58,3% para Listeria monocytogenes Scott A. Os valores encontrados por Dabéset al. (2001) foram menores, 28,8% para Staphylococcus aureus FRI-184 e 32,2% para Listeria monocytogenes Scott A.

CONCLUSÕES

As cepas isoladas demonstraram atividade inibitória frente ao Lactobacillus sake 2714, Listeria innocua BL 86/26, Listeria monocytogenes Scott A, Staphylococcus aureus FRI-184, Staphylococcus carnosus Mc1, Salmonella enterica subsp. enterica var. typhimurium ICB. Nenhuma das cepas isoladas foi capaz de inibir o microrganismo Escherichia coli B-41.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2002

Histórico

• Recebido
  02 Abr 2001
• Aceito
  24 Jan 2002