Estudo clínico e laboratorial da pneumonia de bezerros induzida pela inoculação intrabronquial de Mannheimia haemolytica

Clinical and laboratorial studies of experimentally induced pneumonic pasteurellosis in calves

Estudo clínico e laboratorial da pneumonia de bezerros induzida pela inoculação intrabronquial de Mannheimia haemolytica

[Clinical and laboratorial studies of experimentally induced pneumonic pasteurellosis in calves]

J.J. Fagliari

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, km 5 14.884-900, Jaboticabal, SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Foram utilizados 14 bezerros da raça Holandesa entre 15 e 30 dias de idade, sete inoculados com 5ml de solução salina fosfato-tamponada Dulbecco (DPBS) e sete inoculados com 5x10⁹ UFC de Mannheimia haemolytica/5 ml de DPBS, via intrabronquial. O exame clínico e as colheitas de sangue e de lavado broncoalveolar foram realizados antes e 4, 6, 12 e 24 horas após a inoculação. O exame histopatológico dos pulmões revelou lesões de pneumonia fibrinosa hemorrágica. Os sinais clínicos surgiram quatro horas após a inoculação das bactérias. Os sete bezerros enfermos apresentavam apatia, respiração abdominal, alteração dos ruídos respiratórios, hipertermia, elevação das freqüências cardíaca e respiratória e arritmia cardíaca. Os exames de laboratório mostraram aumento na contagem de hemácias e do volume globular, indicando hemoconcentração. A diminuição de PO₂ e a elevação de PCO₂ sugerem inadequada ventilação pulmonar. Observaram-se neutrofilia e alto número de neutrófilos e monócitos no fluido broncoalveolar. O pH do sangue e as concentrações plasmáticas de HCO₃, Na e K não apresentaram alterações significativas.

Palavras-chave: bezerro, pneumonia, Mannheimia haemolytica, diagnóstico

ABSTRACT

Seven control Holstein calves were inoculated intrabronchially with 5.0ml of Dulbecco’s phosphate-buffered saline solution (DPBS). Other seven calves were inoculated with 5´ 10⁹ Mannheimia haemolytica organisms/5.0 ml of DPBS. Bronchoalveolar fluid and blood samples were collected immediately before and at 4, 6, 12, and 24 hours after inoculation. Clinical examination was performed at the same time points. Histologically haemorragic and fibrinotic pneumonia was observed. Seven sick calves had lethargy, abdominal respiratory pathern, altered respiratory sounds, hypertemia, increased heart and respiratory rates, and cardiac arrhythmia. Pneumonic calves showed higher packed cell volume and red cell count, suggesting hemoconcentration. Pneumonic calves also had decreased PO₂ and increased PCO₂ suggesting poor pulmonary ventilation. Neutrophilia and high neutrophil and monocyte counts in bronchoalveolar fluid were detected due to pulmonar inflammation. Blood pH and plasma concentrations of HCO₃, Na, and K had no significant changes.

Keywords: calf, pneumonia, Mannheimia haemolytica, diagnosis

INTRODUÇÃO

Vários microrganismos têm sido isolados da infecção pulmonar e os mais freqüentemente incriminados são as bactérias dos gêneros Pasteurella, Mycoplasma e Haemophilus (Wikse, 1995). A Mannheimia haemolytica (antes denominada Pasteurella haemolytica) é uma das principais responsáveis pela enfermidade em bezerros com duas semanas a cinco meses de idade, especialmente quando o colostro é fornecido tardiamente ou em quantidade insuficiente (Vestweber, 1986).

A pneumonia induzida por M. haemolytica é um dos poucos modelos experimentais de lesão pulmonar no qual a via respiratória é a porta de entrada dos microrganismos, permitindo o estudo da fisiopatogênese da lesão pulmonar séptica, à semelhança do que ocorre na infecção natural (Whiteley et al., 1991). Esse modelo foi utilizado com sucesso por Rashid et al. (1997), inoculando as bactérias por via intrabronquial. A infecção por M. haemolytica causa pneumonia grave acompanhada de exsudato fibrino-necrótico e hemorragia alveolar (Scolombe et al., 1985; Vestweber et al., 1990; Whiteley et al., 1991), sendo a morte atribuída à insuficiência respiratória e ao choque septicêmico ou endotoxêmico (Rashid et al., 1997). Há evidência da implicação dos neutrófilos na patogênese da enfermidade (Maheswaran et al., 1992; Ackerman et al., 1996; McClenahan et al., 1999), assim como das interleucinas e do fator de ativação plaquetária, os quais estimulam os neutrófilos e podem favorecer a instalação da lesão do endotélio pulmonar (McClenahan et al., 2000).

Durante a fase de multiplicação no tecido pulmonar a M. haemolytica libera substâncias como neuramidase (Frank, Tabatabai, 1981), protease (Otulakowski, 1983) e leucotoxina (Maheswaran et al., 1993), com capacidade de estimular os mecanismos de defesa do organismo, especialmente os fatores de coagulação, o sistema complemento, neutrófilos, monócitos e macrófagos, os quais provocam liberação de mediadores inflamatórios e diversas alterações sistêmicas.

O objetivo deste estudo foi estudar algumas características clínicas e de laboratório de bezerros com pneumonia induzida pela inoculação intrabronquial de M. haemolytica, durante 24 horas após a inoculação.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 14 bezerros da raça Holandesa, com 15 a 30 dias de idade. Após a ingestão de colostro foram mantidos em observação em baias individuais até o início da pesquisa, quando receberam leite in natura e ração comercial própria. No início do experimento, após jejum de 12 horas antes da inoculação, foram divididos em dois grupos experimentais submetidos aos seguintes tratamentos: grupo I - inoculação intrabronquial de 5,0ml de solução salina fosfato-tamponada Dulbecco-DPBS (DPBS-Sigma, St Louis, USA) (controle); grupo 2 - inoculação intrabronquial de 5x10⁹ unidades formadoras de colônias (UFC) de M. haemolytica sorotipo A₁, amostra 12296 (Vega et al., 1987), suspensas em 5,0ml de DPBS, de acordo com a técnica preconizada por Rashid et al. (1997). Para aliviar o desconforto os bezerros receberam 0,10mg de cloridrato de xilazina (Rompum-Bayer, São Paulo, Brasil )/kg de peso corporal, por via intramuscular, antes da inoculação dos microrganismos.

A M. haemolytica sorotipo A₁, amostra 12296, foi isolada de bezerro com pneumonia naturalmente adquirida. Após o cultivo, as placas com agar cérebro-coração (Brain Heart Agar-Sigma, St Louis, USA) foram incubadas a 37° C, em ambiente contendo 5% de CO₂, durante 12 horas. Em seguida os microrganismos foram transferidos para caldo cérebro-coração³ a 37° C, por dois a três horas, sob movimentação constante. Após esse procedimento as bactérias foram semeadas em meio RPMI 1640 (RPMI 1640- Sigma, St Louis, USA) livre de fenol e suplementado com 200 mM de l-glutamina, durante duas a quatro horas. O número de bactérias foi ajustado para 1x10⁹ UFC/ml de DPBS (Vega et al., 1987).

Os animais foram examinados, procedendo-se auscultação das regiões pulmonar e cardíaca, inspeção das mucosas oral e ocular e aferição da temperatura retal e das freqüências cardíaca e respiratória (Rosenberger, 1983), imediatamente antes e 4, 6, 12 e 24 horas após a inoculação das bactérias. Nesses momentos foram obtidas amostras de sangue, após cateterização da veia jugular direita e artéria femoral esquerda, e de lavado broncoalveolar, por meio de sonda apropriada, infundindo e aspirando lentamente 30ml de DPBS (Rashid et al., 1997). Vinte e quatro horas após a inoculação de M. haemolytica os bezerros foram sacrificados em virtude da evolução aguda da infecção para coma, utilizando-se dose elevada de barbitúrico (Nembutal-Abbott, São Paulo, Brasil), e submetidos à necropsia, ocasião em que foram colhidos fragmentos de pulmões do centro e da margem das áreas lesadas, para estudo histológico. Procedeu-se a inoculação de apenas um animal por dia.

Para a realização do hemograma foram utilizadas amostras de sangue obtidas em frascos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). As contagens de hemácias e leucócitos foram feitas em hemocitômetro e os esfregaços sangüíneos corados pelo método de Wright (Jain, 1986) e examinados em microscópio para contagem diferencial de glóbulos brancos. O pH, as pressões de O₂ (PO₂) e CO₂ (PCO₂) e as concentrações sangüíneas de HCO₃, Na e K foram determinadas em analisador apropriado (pH/Blood gas/Electrolytes Analyser Beckman, Houston, USA) imediatamente após a obtenção do sangue arterial. A concentração sérica de proteína total foi calculada por refratometria (Jain, 1986). A contagem de leucócitos do lavado broncoalveolar foi realizado em hemocitômetro, calculando-se a contagem diferencial em esfregaços corados pelo método de Wright (Jain, 1986). Quando a quantidade de hemácias era suficientemente elevada para interferir com a contagem de glóbulos brancos adicionava-se uma gota de reagente de lise (Erythrolyse-Serotec, Washington DC, USA). A concentração de proteína total do fluido broncoalveolar foi determinada pelo método de coomassie blue (Micro protein kit-Sigma, St. Louis, USA). A hemoglobina foi dosada por espectrofotometria utilizando-se a técnica de Harboe (1985) e leitura em comprimento de onda de 415nm. Para o exame histológico, os fragmentos de pulmões foram imersos em solução fixadora de formol a 10%. Depois de sua fixação e inclusão em blocos de parafina foram obtidas secções seriadas de 5m m de espessura, destinadas à montagem das lâminas histológicas, coradas com hematoxilina-eosina.

Utilizou-se a análise de perfil (Morrison, 1967) e os contrastes entre as médias foram determinados pelo teste Tukey (P<0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os pulmões de bezerros do grupo-controle não apresentaram lesões macro ou microscópica; os dos inoculados mostraram lesões firmes de coloração vermelha a amarronzada, com margens claramente definidas. O exame histopatológico revelou hemácias no interior dos alvéolos e células inflamatórias entremeadas com líquido e fibrina. Notou-se lesão fibrino-necrótica típica de pneumonia causada por M. haemolytica, anteriormente verificada por Scolombe et at. (1985), Vestweber (1986), Whiteley et al. (1991), Rashid et al. (1997) e McClenahan et al. (2000). Observaram-se, com freqüência, acúmulos de fibrina nos alvéolos, nas regiões interlobulares e na superfície dos pulmões, áreas multifocais de hemorragias, bactérias em todas as secções e grande número de neutrófilos nos alvéolos. É provável que a liberação de substâncias quimiotáticas em função da multiplicação bacteriana possa ter provocado o afluxo de neutrófilos e macrófagos aos pulmões, agravando as lesões decorrentes da inoculação de M. haemolytica,à semelhança do relatado por Scolombe et al. (1985), Maheswaran et al. (1992) e McClenahan et al. (1999).

Os bezerros inoculados apresentavam apatia, congestão de membranas mucosas, respiração predominantemente abdominal, alteração dos ruídos respiratórios, com predomínio de crepitações, e arritmia cardíaca. A temperatura retal variou de 37,8 ± 0,56° C a 39,8 ± 0,57° C, com aumento gradativo e contínuo ao longo das 24 horas de estudo (Tab.1). Seis horas após a inoculação das bactérias verificou-se que a temperatura era significativamente superior à do grupo-controle. É provável que a hipertemia seja atribuída à ação direta ou indireta das substâncias liberadas pelos microrganismos durante sua multiplicação, como relataram Frank e Tabatabai (1981), Otulakowski (1983), Maheswaran et al. (1993) e Rashid et al. (1997). As freqüências cardíaca e respiratória apresentaram comportamento semelhante ao das variações de temperatura retal, com valores entre 69,6± 7,9 e 124,1± 20,9 batimentos/minuto e de 45,6± 3,8 a 54,5± 7,1 movimentos/minuto. É provável que tanto as substâncias liberadas durante o crescimento bacteriano, quanto a lesão pulmonar que se instala a partir de duas horas da inoculação de M. haemolytica (Wikse, 1995), contribuíram para tais alterações.

Os valores do eritrograma (Tab.2) evidenciam hemoconcentração gradativa ao longo do tempo, a partir de seis horas da inoculação, possivelmente devido ao jejum hídrico a partir de 12 horas antes do início da pesquisa. Os resultados do leucograma (Tab.3) indicam discretas variações na contagem total de leucócitos. Notou-se que a partir de quatro horas da inoculação ocorreu diminuição do número de linfócitos, e às 12 e 24 horas o número de neutrófilos segmentados de bezerros enfermos foi significativamente maior do que o do grupo-controle e do que o valor obtido antes do início do experimento. Em bovinos, essa resposta leucocitária sugere infecção bacteriana (Jain, 1986).

O pH e as concentrações de HCO₃, Na e K do sangue arterial de bezerros inoculados apresentaram discretas variações, embora com tendência de elevação da natremia e potassemia (Tab.4). A PO₂ diminuiu ao longo do tempo, com valores significativamente menores do que os dos bezerros sadios às 12 e 24 horas de estudo. A PCO₂ elevou-se gradativamente, com maiores valores nesses dois momentos. Possivelmente a ação bacteriana causou lesões que influenciaram a ventilação pulmonar e, conseqüentemente, os teores dos gases sangüíneos. A concentração sérica de proteína total elevou-se no decorrer da pesquisa, com valores significativamente maiores em bezerros inoculados, a partir de 12 horas de estudo, indicando que os mediadores inflamatórios liberados influenciaram o metabolismo protéico, possivelmente o das proteínas de fase aguda.

Os resultados das análises do lavado broncoalveolar (Tab. 5) indicaram aumento significativo do número de leucócitos ao longo do tempo, de 509 ± 155/ml antes da inoculação a 22.397 ± 3.105/ml no momento final, em decorrência principalmente da elevação do número de neutrófilos (de 251 ± 92/ml para 20.261 ± 6.432/ml). O aumento do número de macrófagos, de 258 ± 87/ml para 2.136 ± 732/ml, também contribuiu para o acréscimo na contagem leucocitária. Pode-se atribuir à ação bacteriana, direta ou indireta, o efeito quimiotático pulmonar a estes tipos celulares (Rashid et al., 1997; McClenahan et al., 2000).

Como era esperado, a concentração de hemoglobina no lavado broncoalveolar foi significativamente maior nos bezerros inoculados a partir de quatro horas da inoculação. Alteração semelhante foi constatada no conteúdo de proteína total. A elevação da concentração de hemoglobina pode ser atribuída, em parte, à lesão vascular ocorrida durante o lavado e, principalmente, às substâncias liberadas pela M. haemolytica. O aumento no teor protéico deveu-se, provavelmente, à reação inflamatória induzida pelos fatores anteriormente descritos.

CONCLUSÕES

O modelo de indução de pneumonia mediante a inoculação intrabronquial de Mannheimia haemolytica sorotipo A₁, amostra 12296, mostrou-se efetivo. O inóculo contendo 5x10⁹ UFC de M. haemolytica suspensas em 5,0ml de DPBS provocou quadro clínico agudo, com evolução para coma irreversível dentro de 24 horas após a inoculação. Como na prática veterinária a pneumonia apresenta um período de evolução clínica mais longo, é possível que a utilização de inóculo com número inferior ao utilizado possa ser mais adequada ao estudo da pneumonia de bezerros. Redução de P0₂, elevação de PCO₂, neutrofilia e alto número de neutrófilos e monócitos no fluido broncoalveolar foram as principais informações obtidas nos exames de laboratório, e podem ser utilizadas no diagnóstico da pneumonia de bezerros, em especial a causada por P. haemolytica.

AGRADECIMENTO

O autor agradece o apoio financeiro concedido pelo CNPq.

Recebido para publicação em 26 de fevereiro de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 19 de setembro de 2002

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Abr 2003
• Data do Fascículo
  Fev 2003

Histórico

• Recebido
  26 Fev 2002
• Aceito
  19 Set 2002