Desenvolvimento pós-fecundação de oócitos bovinos pré-maturados em fluido folicular

Post-fertilization development of bovine oocytes pre-matured in follicular fluid

Desenvolvimento pós-fecundação de oócitos bovinos pré-maturados em fluido folicular

Post-fertilization development of bovine oocytes pre-matured in follicular fluid

W.F. Sá^I; V.E.L. Vizcarra^II; A.M. Ferreira^I; L.S.A. Camargo^I; M.C.C. Araújo^III

^IEmbrapa Gado de Leite Rua Eugênio do Nascimento, 610 36038-330 - Juiz de Fora, MG

^IIEstudante de mestrado - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

^IIIEstudante de doutorado - Universidade Federal de Minas Gerais

RESUMO

Estudou-se o efeito da pré-maturação em fluido folicular bovino (FFb) sobre o potencial de desenvolvimento de ovócitos bovinos imaturos. Complexo cumulus- ovócitos (CCO) e FFb foram obtidos de ovários coletados em matadouro. O FFb foi inativado e os CCOs imaturos distribuídos em quatro tratamentos: (T1) 70% de FFb em Talp Hepes, (T2) 100% de FFb, (T3) 100% de Talp Hepes, e (T4) controle. Em T1, T2 e T3 os CCOs foram pré - maturados por cinco horas a 37ºC em ar e posteriormente maturados in vitro. Em T4 a maturação ocorreu logo após a aspiração. Depois de fecundados in vitro, os ovócitos foram co-cultivados com células do cumulus por 10 dias. Avaliaram-se as taxas de clivagem, de produção de blastocistos no sétimo e oitavo dias pós- fecundação (PF), de produção total e de blastocistos eclodidos no oitavo e nono dias PF. Calcularam-se as taxas de blastocistos no sétimo e oitavo dia e de blastocistos eclodidos em função do total de blastocistos produzidos. As taxas de clivagem, de produção total e de blastocistos eclodidos não diferiram entre os tratamentos (P>0,05), entretanto a produção de blastocistos no sétimo dia foi menor nos tratamentos com FFb e Talp Hepes (P<0,05). Concluiu-se que FFb e Talp Hepes na pré-maturação por cinco horas atrasam o desenvolvimento embrionário sem comprometer a taxa de produção total de embriões ou sua viabilidade.

Palavras-chave: bovino, ovócito, fluido folicular, produção de embriões

ABSTRACT

The effect of the pre-maturation with bovine follicular fluid (bFF) on developmental competence of immature bovine oocytes was studied. Cumulus-oocytes complexes (COC) and bFF were obtained from ovaries collected at slaughterhouse. bFF was inactivated prior to use and COCs were distributed in four treatments: (T1) 70% of bFF in Talp hepes, (T2) 100% of bFF, (T3) 100% of Talp Hepes medium, and (T4) control group. In T1, T2, and T3, COCs were incubated during 5h at 37ºC before proceeding with in vitro maturation. In T4, maturation was performed soon after follicular aspiration. After in vitro fertilization, the presumptive zygotes were co-cultured with cumulus cells during 10 days. It was evaluated cleavage, blastocyst on seventh and eighth days post-fertilization (PF), overall blastocyst and hatched blastocyst on eighth and ninth days PF. It was also calculated the ratio of blastocyst on seventh and eighth days, and hatched blastocyst in function of overall blastocyst production. Cleavage, overall blastocyst and hatched blastocyst rates were similar (P>0.05) among treatments. However, blastocyst production on seventh day was lower (P<0.05) for bFF and Talp Hepes. These results indicate that bFF and Talp Hepes in pre-maturation for five hours caused a delay on embryonic development, although the overall blastocyst production and viability were not affected.

Keywords: bovine, oocyte, follicular fluid, embryo production

INTRODUÇÃO

Técnicas de maturação de ovócitos e de fertilização in vitro têm sido desenvolvidas para o aproveitamento de ovócitos, com o objetivo de produzir embriões em larga escala. Apesar dos avanços alcançados pela técnica, os embriões produzidos in vitro ainda apresentam diferenças morfológicas e metabólicas daqueles produzidos in vivo, geralmente provocados pelas condições de cultivo in vitro (Holm, Callesen, 1998). Essas alterações têm tornado os embriões produzidos in vitro mais sensíveis ao resfriamento e à congelação do que os obtidos in vivo (Massip, 2001), diminuído a viabilidade pós-descongelação e a taxa de gestação (Holm, Callesen, 1998) e mantido baixa a eficiência da técnica (Marquant-Leguienne, Humblot, 1998). As diferenças podem ser atribuídas à menor competência dos ovócitos aspirados dos folículos, e à falhas nos processos de maturação e fecundação do ovócito, ou no cultivo do embrião.

Enquanto está dentro de um folículo não-ovulatório, o reinício da meiose do ovócito é inibido por fatores presentes no ambiente folicular (Sirard et al., 1998). Entretanto, logo após a aspiração, o ovócito perde contato com o fluido folicular e reinicia a meiose espontaneamente, tornando importante o tempo entre a aspiração e o início da maturação in vitro, a fim de não comprometer a capacidade de fertilização do ovócito e de desenvolvimento do embrião (Dominko, First, 1997). Portanto, é necessário que o ovócito seja colocado o quanto antes em ambiente e meio de cultivo adequado para a maturação in vitro , ou então que a sua maturação seja inibida por meio de condições induzidas, até que se dê início ao cultivo para a maturação in vitro. Esses procedimentos também se aplicam quando as punções foliculares são feitas longe do laboratório de produção in vitro de embriões.

Sabe-se que o ovócito tem competência para completar a maturação meiótica ao atingir diâmetro aproximado de 110µm. Muitos dos ovócitos aspirados são provenientes de folículos terciários, com diâmetro entre 80 e 110µm (Hyttel et al., 1997), de menor competência, sendo necessário um período de pré-maturação para alcançá-la, a fim de proporcionar maturação citoplasmática mais completa (Hendriksen et al., 2000).

O fato de o ovócito reiniciar a maturação nuclear logo após a aspiração e de a maioria dos ovócitos aspirados ainda não possuir total competência de desenvolvimento, devido à menor capacidade citoplasmática, mostra assincronia entre a maturação nuclear e a citoplasmática. O uso de meios que inibem ou retardam a meiose para proporcionar tempo suficiente para a maturação citoplasmática pode aumentar a competência dos ovócitos. Esse artifício permite maior tempo de maturação citoplasmática sem afetar a duração da maturação nuclear. A inibição da meiose nuclear logo após a aspiração pode ser obtida com o auxílio de inibidores de síntese de proteínas ou com fluido folicular, que contêm inibidores da meiose (Sirard et al., 1998).

Entre os fatores inibidores da meiose encontrados no fluido folicular estão o ácido linoléico, a hipoxantina e o fator inibidor da maturação (OMI), que provavelmente são produzidos pelas células da parede folicular (Dostal, Pavlok, 1996; Sirard et al., 1998). Pelo fato de ser fisiológico, o fluido folicular pode inibir a maturação do ovócito sem comprometer seu potencial de desenvolvimento, caracterizando-o como meio que permite a pré-maturação, proporcionando melhor sincronia entre a maturação citoplasmática e a nuclear. O uso do fluido folicular como meio de pré-maturação pode também auxiliar na manutenção dos ovócitos durante o transporte, principalmente quando eles forem coletados em locais distantes do laboratório.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do cultivo do oócito imaturo em fluido folicular antes do início da maturação in vitro sobre a competência de desenvolvimento pós fecundação.

MATERIAL E MÉTODOS

Os complexos cumulus-ovócitos (CCOs) e o fluido folicular foram obtidos de ovários de fêmeas bovinas abatidas em matadouro. Os ovários foram acondicionados em garrafa térmica com solução fisiológica a 34°C aproximadamente e transportados até o laboratório, onde foram lavados com a mesma solução de transporte, depositados em béquer e mantidos em banho-maria a 37^oC, para posterior aspiração dos folículos e obtenção dos CCOs.

Um "pool" de fluido folicular bovino (FFb), obtido de 30 ovários coletados em um mesmo dia, pela aspiração de folículos com 2 a 6mm de diâmetro, foi centrifugado duas vezes por 15 minutos a 300´g. O sobrenadante, inativado a 56^oC por 30 minutos, foi filtrado, do qual retirando alíquotas para serem armazenadas a –15^º C.

Os CCOs foram aspirados de folículos de 2 a 8 mm de diâmetro e o conteúdo depositado em cálice cônico contendo Talp Hepes (Bavister et al., 1983), acrescentado de 3g/l de albumina sérica bovina (BSA), fração V, e mantido a 37ºC em banho-maria. Após 15 minutos, desprezou-se o sobrenadante e o sedimento foi recolhido em placa de petri contendo o mesmo meio, onde os CCOs foram avaliados e selecionados. Consideraram-se viáveis os CCOs que possuíam no mínimo três camadas de células, citoplasma homogêneo e sem alterações visíveis, conforme avaliação de Hawk and Wall (1994). Após a seleção, os CCOs foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos (com quatro repetições cada): tratamento 1 (T1, n=139), 70% de FFb em Talp-Hepes; tratamento 2 (T2; n=157), 100% de FFb; tratamento 3 (T3; n=143), 100% de Talp-Hepes e tratamento 4 (T4-controle; n=92), CCOs levados para maturação in vitro logo após a aspiração e seleção.

Em TI, T2 e T3 os CCOs foram pré-maturados nos respectivos meios durante cinco horas a 37ºC em tubos de centrífuga de 1,5ml, vedados com parafilme e posteriormente submetidos à maturação durante 24 horas. A maturação foi igual para todos os tratamentos, ocorrendo em meio TCM-199, acrescidos de 10% de soro de vaca em cio (SVC) e 20µg/ml de FSH, segundo Costa (1994), em estufa incubadora à 38,6^ºC, com 95% de umidade e 5% de CO₂ em ar atmosférico.

Após a maturação, 30-40 CCOs foram colocados em gotas de 100µl de meio Fert-Talp suplementado com 10µg/ml de heparina e com 2,0 a 2,5 x10⁶ espermatozóides/ml, cobertas com óleo mineral e mantidas durante 22 horas nas mesmas condições da maturação. Os espermatozóides foram obtidos pelo método de swim up. Ao final da fecundação, os zigotos com suas respectivas células do cumulus foram transferidos para o meio CR2aa (Rosenkranks, First, 1994), onde foram cultivados por 10 dias em 5% de CO₂ à 38,8ºC. Metade do meio foi trocado com 72h após início do cultivo da fecundação (pf).

Avaliaram-se a taxa de clivagem no momento da troca do meio, com 72h pf, a taxa de produção de blastocisto com sete e oito dias, a produção total e a taxa de blastocistos eclodidos no 8º e 9º dia pf. Analisaram-se as taxas de produção de blastocistos no sétimo e oitavo dia e de blastocistos eclodidos em função do total de blastocistos produzidos. Os resultados foram analisados pelo teste de qui-quadrado, com exceção da taxa de blastocistos eclodidos, analisada pelo teste exato de Fisher. Considerou-se significante nível de P<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As taxas de clivagem, de blastocistos no oitavo dia, de produção total de blastocistos e de blastocistos eclodidos não diferiram (P>0,05) entre os tratamentos (Tab.1). A taxa de blastocistos no sétimo dia foi menor (P<0,05) nos tratamentos 1, 2, quando comparada à do tratamento 4.

O fato de não haver diferença nas taxas de clivagem, de produção total de blastocistos e de blastocistos eclodidos mostra que os ovócitos recém-aspirados, mantidos por cinco horas com 70 ou 100% de FFb, tiveram potencial de desenvolvimento embrionário semelhante aos submetidos ao Talp Hepes ou à maturação logo após a aspiração folicular. Um possível modo do FFb manter a viabilidade do ovócito seria pelo bloqueio da progressão da meiose por fatores presentes nesse fluido (Sirard et al., 1998; Behrensdorf, 1999), evitando que a maturação nuclear tenha duração mais longa, prejudicial ao desenvolvimento embrionário (Dominko, First, 1997). Esse bloqueio seria revertido quando os ovócitos fossem transferidos para o meio de maturação (Ayoub, Hunter, 1993). Compostos presentes no FFb, como FSH, prolactina e AMPc, estimulariam células da granulosa a secretarem OMI (fator inibidor da meiose), que ao passar pelas "junções gap" manteria o ovócito na fase de dictióteno (Wassarman, 1988; Fleming, Waton, 1993). O tratamento com Talp Hepes, que não possui ação de bloqueio da maturação nuclear (Behrensdorf, 1999), também manteve a viabilidade ovocitária, com taxas de clivagem e de produção de blastocistos semelhantes ao tratamento com FFb e controle (Tab.1). Contudo, o Talp Hepes utilizado foi suplementado com BSA fração V, que em estudo recente mostrou retardar a quebra da vesícula germinal e diminuir a taxa de metáfase II com 18h de cultivo (Ali, Sirard, 2002). É possível então que o FFb e a BSA adicionados ao meio de cultivo tenham ação retardatória na progressão da meiose, provavelmente agindo de maneira diferente. Como este experimento não avaliou a taxa de retenção da maturação nuclear ao final da 5h de cultivo pré-maturação, não se pode afirmar se houve ou não atraso no reinício da meiose.

O tempo de pré-maturação utilizado pode também não ter sido suficiente para prejudicar a viabilidade dos ovócitos. Isto indicaria que a ação do FFb e de Talp Hepes na manutenção do potencial de desenvolvimento do ovócito durante 5h antes da maturação pode ter sido independente do atraso da meiose, proporcionando apenas a nutrição dos ovócitos nesse período, mantendo sua viabilidade sem incrementar a maturação. Apesar de os oócitos competentes reiniciarem a meiose espontaneamente após serem aspirados dos folículos (Thibault et al., 1987), sabe-se que é necessária a presença de fatores estimulantes da maturação, como LH, que aumentam a capacidade de desenvolvimento pós-fecundação (Cha, Chian, 1998).

Pelos resultados de produção de embriões por dia de surgimento em função do total de blastocistos produzidos ao final do cultivo, afim de ressaltar o efeito do dia de surgimento, verifica-se que no tratamento 4 quase todos os blastocistos (94,1%) surgiram no sétimo dia após início da fecundação, diferente (P<0,05) dos tratamentos 1, 2 e 3, em que 70,7% a 76,6% dos blastocistos surgiram nesse mesmo dia (Tab.2). Por esse motivo, no tratamento 4 surgiram menos blastocistos no oitavo dia (5,9%) do que nos outros tratamentos. A taxa de blastocistos eclodidos continuou semelhante entre os tratamentos. Esse cálculo permitiu identificar diferença entre os tratamentos 3 e 4 quanto ao surgimento de blastocistos no sétimo dia. Na primeira análise, feita em função do total de ovócitos, observou-se apenas tendência numérica em ser diferente (Tab.1). A diferença quanto ao dia de surgimento do blastocisto indica desenvolvimento mais lento dos embriões nos tratamentos com FFb e Talp Hepes, talvez provocada pela ausência de fatores que otimizem a maturação nuclear e citoplasmática nesses dois meios, discutida inicialmente, como também pela ausência de condições atmosféricas ideais para a MIV, como 5% de CO2 (Gordon, 1994), uma vez que a pré-maturação foi realizado em ar atmosférico. Esse desenvolvimento não foi suficiente para afetar a produção total de blastocistos ou a taxa de blastocistos eclodidos. Contudo, não se pode afirmar se a manutenção dessa viabilidade se traduzirá em implantação e gestação após a transferência para as receptoras, sendo necessário mais estudos que avaliem o desenvolvimento embrionário pós-implantação e fetal.

Diversos fatores ajudam a explicar a perda da função do FFb observada neste experimento como meio adequado para a pré-maturação. Fluido folicular de folículos pequenos (1-2 mm) e médios (3-5 mm) são mais eficientes em reter a meiose do que folículos maiores (Dode et al., 2000), como também possuem diferenças na sua constituição protéica (Rodovalho et al., 2000). Uma comunicação íntegra entre as células do cumulus e o ovócito também é necessária para que o FFb tenha efeito inibitório sobre a meiose (Dostal, Pavlok, 1996). Como os ovócitos aspirados de ovários coletados em matadouro provêm de ambientes foliculares diversos, com diferentes níveis de crescimento ou atresia, provavelmente têm diferentes exigências nutricionais. Isso torna mais difícil identificar um meio que não somente iniba a meiose, como também atenda às exigências ovocitárias durante um período prolongado, o qual é necessário para a pré-maturação. A partir da aspiração folicular, auxiliada por ultra-sonografia a cada três-quatro dias, pode-se conseguir um grupo de ovócitos mais homogêneos, uma vez que todos os folículos devem estar em fase semelhante de crescimento folicular e, nesse caso, deverá ser mais fácil identificar um meio adequado para a pré-maturação de todos os ovócitos de um mesmo grupo de aspiração.

Os resultados mostram que ovócitos podem ser mantidos por até 5h após a aspiração folicular em FFb ou Talp Hepes, em ambiente a 37ºC em ar, sem interferir na produção final, apesar do desenvolvimento embrionário mais lento. O período de pré-maturação, citado como necessário para aumentar a competência de desenvolvimento do ovócito (Hendriksen et al., 2000), deve ser maior do que as 5h avaliadas, uma vez que não se observou melhora na produção e viabilidade dos blastocistos produzidos. Em virtude do lento desenvolvimento embrionário observado nos tratamentos com FFb e TALP Hepes, a pré-maturação mais prolongada nesses meios pode eventualmente prejudicar a produção de blastocistos e sua implantação. O uso do FFb como agente positivo na pré-maturação requer futuros estudos levando-se em conta o tempo necessário para permitir melhor maturação citoplasmática e o status do folículo de origem do ovócito e do FFb.

CONCLUSÕES

A manutenção de ovócitos recém-aspirados em 70% ou 100% de fluido folicular bovino (FFb) ou em Talp Hepes por cinco horas retarda o desenvolvimento embrionário sem comprometer a produção final de blastocistos. Novos estudos são necessários para se estabelecer a viabilidade desses embriões após a transferência para receptoras.

Recebido para publicação em 26 de fevereiro de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 25 de novembro de 2002

E-mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Out 2003
• Data do Fascículo
  Jun 2003

Histórico

• Aceito
  25 Nov 2002
• Recebido
  26 Fev 2002