Alterações histológicas em enxerto de osso homógeno preparado e armazenado com duas técnicas diferentes

Histological alterations in homogenous bone graft with two tecniques of preparation and storage

ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS EM ENXERTO DE OSSO HOMÓGENO PREPARADO E ARMAZENADO COM DUAS TÉCNICAS DIFERENTES¹

Alfredo Benjamin Duarte da Silva², Leandro Rodrigues³, Wanda Jorgetti⁴, Júlio Moraes Besteiro⁵, Marcus Castro Ferreira⁶, Carolina Gomes Gonçalves⁷, Luciane Machado dos Reis⁸

Duarte da Silva AB, Rodrigues L, Jorgetti W, Besteiro JM, Ferreira MC, Gonçalves CG, dos Reis LM. Alterações histológicas em enxerto de osso homógeno preparado e armazenado com duas técnicas diferentes. Acta Cir Bras 2000; 15 (supl 3): 74-77.

RESUMO: Esta pesquisa analisa as alterações histológicas de enxerto ósseo homógeno preparado de diferentes modos. Em um grupo, ossos metatársicos-l de ratos foram armazenados a -70° Celsius e em outro grupo, os ossos foram descalcificados e estocados em temperatura ambiente após terem sido liofilizados. Esses ossos foram enxertados nas regiões inguinais de ratos e retirados para estudo histológico no trigésimo dia de pós-operatório. Macroscopicamente os ossos não descalcificados e armazenados a -70°C estavam envoltos por uma cápsula delgada, facilmente desprendida e apresentavam consistência de osso cortical. Microscopicamente observou-se absorção da superfície endostal com diminuição da camada cortical e aumento da cavidade medular. A cortical estava sofrendo processo de reabsorção e a superfície óssea externa possuía uma cápsula fibrosa delgada e células inflamatórias. Os ossos descalcificados e liofilizados, na macroscopia, apresentavam-se de consistência amolecida e estavam envoltos por uma cápsula espessa e firmemente aderida. Microscopicamente, a maior parte da arquitetura óssea estava preenchida por material acelular e avascular, muito semelhante à cartilagem e envolvendo o tecido, uma cápsula fibrosa espessa com células inflamatórias. Portanto, existiam diferenças histológicas dos enxertos ósseos homógenos, dependendo do preparo e do armazenamento do osso.

DESCRITORES: Liofilização. Ósseo-integração. Transplante ósseo. Ratos

Duarte da Silva AB, Rodrigues L, Jorgetti W, Besteiro JM, Ferreira MC, Gonçalves CG, dos Reis LM. Histological alterations in homogenous bone graft with two tecniques of preparation and storage. Acta Cir Bras 2000; 15 (supl 3): 74-77.

SUMMARY: This research analyzes histologic alterations in allogenic bone graft from rats wich were prepared in two different ways. In one group (n=6), metatarsic-l bones not descalcified were stored at -70°C. In the other (n=6), the bones were desminerlised and freeze-drying. The bones were grafted into the groin region of rats and studied 30 days after. In the macroscopic evaluation, the bones not descalcified and stored at -70°C were surrounded by a thin capsule with consistency of cortical bone. Microscopically, it was observed reabsorption of endostal area with a decrease in the cortical thickness, and increase in the intracortical cavity. The bones descalcified and freeze-drying, in a macroscopic evaluation, were surrounded by a thick capsule and the consistency of the bone was softened. Microscopically, the bone showed a tissue without cells and vases, wich was very similar to cartilage; and a thick and fibrous capsule with inflamatory cells. Therefore, there were histologic differences in the allogenic bone grafts, and these differences depend on the way the bone was prepared and stored.

SUBJECT HEADINGS: Freeze drying. Bone transplantation. Osseointegration. Rats.

INTRODUÇÃO

Enxerto ósseo é o tecido ósseo sem vascularização, transplantado para outra região com a finalidade de reconstruir perdas do esqueleto causadas por traumas, infecções e ressecções de tumores⁷. Ele pode ser: autógeno; homógeno ou xenógeno. Tanto o autógeno quanto o homógeno têm sido amplamente utilizados na prática cirúrgica; já o xenógeno, por apresentar grande resposta antigênica, é menos empregado¹.

As perspectivas de utilização do enxerto homógeno aumentaram após Urist (1965) ter observado formação de osso quando se realizava transplante de fragmentos ósseos sem células¹³. Isto se deve ao fato de que substâncias originárias do tecido ósseo transplantado em forma de enxerto têm a capacidade de induzir células mesenquimais do hospedeiro a se transformarem em osteoblastos, esse processo foi denominado de osteoindução^4,7,10. Essas substâncias são proteínas conhecidas como "bone morfogenetic proteins" (BMPs)¹³.

Existem várias técnicas de preparo do osso homógeno para enxerto, todas com o objetivo de diminuir a antigenicidade do osso e evitar a destruição das proteínas osteoindutoras^10,11,12. O enxerto ósseo pode ser esponjoso ou cortical, utilizado a fresco ou armazenado congelado em diferentes temperaturas^11,12, parcial ou totalmente desmineralizado^1,6,8. Pode, ainda, ser submetido ao processo de liofilização e estocado em temperatura ambiente^,11,12. Estes métodos causam diferenças biológicas durante a incorporação óssea, que parecem influenciar no sucesso da enxertia óssea homógena^1,6,8,11,12.

Embora os conceitos de enxertia homógena sejam bastante difundidos, os centros que utilizam esse procedimento para reconstrução óssea não apresentam um consenso no padrão de preparo e armazenamento desses ossos.

Tendo em vista esses fatos, o objetivo deste trabalho é estudar, em ratos, as alterações histológicas de enxerto de osso homógeno preparado e armazenado com duas técnicas diferentes: osso não descalcificado e armazenado a -70^oC e osso descalcificado e armazenado em temperatura ambiente após liofilização.

MÉTODOS

O animal de experimento foi o rato Wistar-Furth, macho, adulto, pesando entre 350 e 450 gramas. Após as cirurgias, os ratos que foram submetidos a enxertia do osso homógeno permaneciam em gaiolas unitárias, com temperatura e luminosidade controladas e dieta "ad libitum".

De 6 animais foram retirados os ossos metatársicos-I das patas traseiras, totalizando 12 ossos, os quais foram divididos em dois grupos: grupo 1 (n=6), onde os metatársicos foram unicamente congelados a -70°C; grupo 2 (n=6), no qual os metatársicos foram descalcificados e liofilizados. Posteriormente, esses ossos foram enxertados, como osso homógeno, nas regiões inguinais direita e esquerda de outros seis ratos. A região inguinal direita foi receptora de osso do grupo 1 e a região inguinal esquerda de osso do grupo 2. Após, trinta dias os enxertos foram retirados e submetidos a estudo histológico.

A indução anestésica foi realizada com pentobarbital sódico intraperitoneal, na dose de 30 mg/kg, e a manutenção com doses fracionadas de 10 mg/kg, quando necessário.

Foi realizada incisão longitudinal da pele da face interna de ambas as patas traseiras dos ratos e retirados os ossos metatársicos-I, dos quais foi removido o periósteo com lâmina de bisturi com auxílio de microscópio cirúrgico. As incisões das patas traseiras foram fechadas com dois pontos separados, subdérmicos, de fio monofilamentar de náilon 6-0.

Para a realização do enxerto de osso homógeno foi realizada incisão de 3,5 cm em ambas as regiões inguinais. No subcutâneo da região inguinal direita era enxertado o osso homógeno congelado e no subcutâneo da região inguinal esquerda era enxertado o osso homógeno descalcificado-liofilizado. As incisões eram fechadas como já descrito.

Preparo do osso homógeno

Após a retirada dos ossos metatársicos da pata traseira dos ratos de ambos os grupos, os mesmos foram limpos de tecidos adjacentes com o auxílio de microscópio. A seguir os ossos foram estocados em geladeira a -70^º Celsius. Na segunda semana, os ossos do grupo 2 foram descongelados e submetidos a desmineralização. Este processo foi realizado através de banhos químicos que estão descritos no quadro 1, sendo o último passo a liofilização do osso por 2 horas.

Preparo histológico dos ossos

Após a retirada dos ossos da região inguinal, no trigésimo pós operatório, os mesmos foram fixados em álcool a 70%. As amostras foram processadas sem descalcificação e embebidas em metilmetacrilato. De cada caso foram realizadas quatro lâminas com dois cortes de cinco micrômetros, coradas com azul de toluidina (pH 6,8). Por fim, as lâminas foram estudadas com auxílio de microscópio óptico.

RESULTADOS

A macroscopia dos ossos do grupo 1 (não descalcificados e congelados a -70°C) mostrou que estes estavam envoltos por uma cápsula fibrosa delgada. Apresentavam consistência endurecida como a observada em osso cortical. Já os ossos do grupo 2 (descalcificados e liofilizados) estavam envoltos por uma cápsula fibrosa espessa e firmemente aderida ao osso. Sua consistência era bastante amolecida, com características de cartilagem.

Na microscopia do grupo 1, observou-se absorção da superfície endostal com diminuição da camada cortical e aumento da cavidade medular, sendo que a cortical estava sofrendo processo de trabeculação. A superfície óssea externa apresentava cápsula fibrosa e células inflamatórias que englobavam todo o tecido ósseo.

Na microscopia do grupo 2, viu-se um tecido homogêneo, que em sua maior parte era acelular e avascular, porém com limites externos precisos e semelhantes ao de osso metatársico. Em algumas poucas regiões encontrou-se presença de tecido ósseo mineralizado e a deposição de tecido osteóide. Todo esse conjunto estava envolto por uma cápsula aderente, espessa e rodeada por células inflamatórias.

DISCUSSÃO

Os enxertos ósseos homógenos estão sendo utilizados na prática clínica com bons resultados¹. Alguns centros médicos criaram serviços específicos, denominados de "Banco de Ossos", para o desenvolvimento dessa nova modalidade de reconstrução óssea⁹. Cada centro apresenta uma preferência por determinado tipo de osso, havendo controvérsias quanto ao modo de preparo e armazenamento dos mesmos^1,11.

Considerando estes aspectos, este trabalho procurou estabelecer parâmetros que auxiliassem o desenvolvimento de pesquisas experimentais de enxerto homógeno em nosso meio.

O animal escolhido para desenvolver essa pesquisa foi o rato Whistr-Furth, por ser de fácil manuseio e freqüentemente utilizado em estudos de enxerto ósseo⁹.

A incorporação do enxerto ósseo apresenta cinco estágios: 1) inflamatório, com aumento da atividade osteoclástica; 2) revascularização do enxerto; 3) osteocondução, na qual o enxerto tem a função de arcabouço para o crescimento de vasos e formação de osso; 4) osteoindução, na qual células mesenquimais do hospedeiro são induzidas, por proteínas (BMPs) encontradas no enxerto, a se transformarem em osteoblastos e 5) remodelação óssea, com características de formação e reabsorção contínua de osso^3,5,7.

O sucesso do enxerto ósseo homógeno está relacionado a sua atividade osteoindutora, já que o mesmo não possui células ósseas vivas para iniciar a osteogênese^3,5,7 e na resposta imunológica causada pela histocompatibilidade enxerto-hospedeiro^10,12.

Em nosso estudo realizamos no grupo 2 a desmineralização óssea, pois as proteínas osteoindutoras (BMPs) apresentam grande atividade quando o osso é submetido a descalcificação pelo ácido clorídrico^3,5.

O tempo de desmineralização óssea está relacionado com a quantidade de cálcio presente no osso e varia de acordo com o tipo de osso e animal em experimento⁸. Utilizamos o metatársico-I de ratos, que apresenta 70-80% do volume do osso calcificado². Baseado na literatura que estabelece tempos de desmineralização entre 1 e 24 horas^8,9 e na observação das características de consistência do material durante o processo de descalcificação, estabeleceu-se um tempo médio de 4 horas de desmineralização do osso.

Outro fator que influencia na osteoindução do enxerto homógeno é o modo de armazenamento desses ossos. No momento os métodos utilizados são a congelação do material a baixas temperaturas e a liofilização óssea^10,11.

A temperatura ideal de congelação do osso é -70ºC, já que em temperaturas mais elevadas enzimas líticas permanecem ativas destruindo as propriedades osteoindutoras. Além do congelador, pode ainda ser empregado o nitrogênio líquido para obter temperaturas de até -179ºC¹¹.

A liofilização ou "freeze-drying" para armazenamento do osso consiste no resfriamento do osso a -70^oC por um período após o qual o material é colocado em um liofilizador. Esse aparelho forma um vácuo enquanto a temperatura é mantida a -35^o C, retirando até 95% da água¹¹. O osso pode ser armazenado em temperatura ambiente o que facilita o envio do material para hospitais de diferentes localidades¹. Outra vantagem é que o tempo de armazenamento é indefinido. Ainda, a liofilização óssea diminui a resposta imunológica enxerto-hospedeiro¹⁰.

Porém, tanto a liofilização quanto a desmineralização alteram a força mecânica do enxerto, impedindo seu uso em locais do esqueleto ósseo que necessitem de grande suporte^8,10.

No grupo 2, em que realizou-se a descalcificação e a liofilização do osso, observou-se, macroscopicamente, que o mesmo apresentava resistência mecânica diminuída e, conseqüentemente, pouca função de suporte. Esse dado é reforçado pela microscopia, na qual viu-se tecido avascular muito semelhante à cartilagem. É possível explicar essas alterações, já que o processo de ossificação do osso desmineralizado ocorre de maneira endocondral⁶.

No grupo 1, em que ossos não descalcificados foram armazenados congelados, o enxerto parecia estar sendo gradativa e lentamente absorvido por osteoclastos^3,5,7. A incorporação do osso homógeno ocorre com maior lentidão porque o enxerto desencadeia uma resposta imunológica interferindo na osteoindução e na revascularização⁷.

Portanto, foi nítida a diferença histológica entre o enxerto homógeno não descalcificado e armazenado congelado quando comparado ao modelo de enxerto homógeno descalcificado e liofilizado. Entretanto, esta pesquisa deverá ser estendida por um período superior a quatro semanas para que possam ser observados estágios mais avançados da incorporação óssea.

CONCLUSÕES

1. Existem diferenças histológicas entre o enxerto de osso homógeno, em ratos, armazenado a -70^oC quando comparado ao enxerto de osso homógeno descalcificado e liofilizado .

2. O enxerto de osso homógeno armazenado a -70^oC apresenta grande quantidade de osso mineralizado sofrendo processo de absorção no trigésimo dia após a enxertia.

3. O enxerto de osso homógeno descalcificado e liofilizado apresenta, no trigésimo dia após a enxertia, tecido homogêneo avascular e acelular, na sua maior parte, muito semelhante a cartilagem.

REFERÊNCIAS

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13. Urist M. Bone formation by osteoinduction. Science 1965; 150:893-9.

NOTAS

1

. Trabalho realizado na Disciplina de Cirurgia Plástica e Queimaduras da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

2. Mestre em Cirurgia Plástica e Preceptor da Residência de Cirurgia Plástica do Hospital Univeritário Cajuru.

3. Acadêmico de Medicina.

4. Doutora em Medicina da USP, Médica da Disciplina de Nefrologia da USP, responsável pelo laboratório de Doenças Ósseas da USP.

5. Titular da Sociedade Brasileira de Cirurgia Plástica, Doutor em Medicina, Médico da Disciplina de Cirurgia Plástica FMUSP.

6. Titular da Sociedade Brasileira de Cirurgia Plástica, Doutor em Medicina, Médico da Disciplina de Cirurgia Plástica FMUSP.

7. Acadêmica de Medicina.

8. Mestre em Medicina pela USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Abr 2001
• Data do Fascículo
  2000