Alterações da mucosa intestinal em ratos: estudo morfométrico em três diferentes tratamentos após indução experimental de sepse abdominal aguda

Alterations of intestinal mucosa in rats: morphometric study in three kinds of treatment after experimental acute abdominal sepsis induction

ARTIGO ORIGINAL

Alterações da mucosa intestinal em ratos. Estudo morfométrico em três diferentes tratamentos após indução experimental de sepse abdominal aguda¹

Alterations of intestinal mucosa in rats: morphometric study in three kinds of treatment after experimental acute abdominal sepsis induction

Ricardo Tramonte^I; Roberta O. M. Carvalho^II; Débora Cadore de Farias^III; João Daniel May Serafim^IV; Daniel Knabben Ortellado^V; Armando José d'Acampora^VI

^IProfessor Adjunto, Doutor em Histologia do Núcleo de Pesquisa da TOCE-UFSC

^IIMédica Residente em Radiologia do Hospital Universitário da UFSC

^IIIAluna da Graduação em Medicina da UFSC

^IVMédico Residente em Cirurgia do Hospital Regional de São José, Santa Catarina

^VMédico Residente em Cirurgia Geral do HU-UFSC

^VIProfessor Adjunto, Doutor em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental pela Universidade do Estado de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM). Líder do Grupo de Pesquisa TOCE-UFSC

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Verificar as possíveis alterações morfológicas da parede intestinal provocadas pela contaminação de uma monocultura bacteriana na cavidade abdominal de ratos, após tratamento por drenagem, lavagem e a combinação destes dois processos.

MÉTODOS: Foram utilizados 50 ratos fêmeas da linhagem Wistar, foram distribuídos em 5 subgrupos: grupo Controle (C) - recebeu um inóculo padrão com 1,2.10⁹ de Pseudomonas aeruginosa, intraperitonial, sem nenhum tipo de tratamento; grupo Dreno (D) - inóculo padrão e realizada a drenagem da cavidade abdominal; grupo Lavado (L) - inóculo e realizada a lavagem da cavidade abdominal com solução salina; grupo L+D - inóculo e submetido aos dois tipos de tratamentos; grupo Normal (N) sem nenhum tipo de inoculação ou tratamento. Realizou-se a análise morfométrica das lâminas coradas por H.E da mucosa intestinal e hemocultura.

RESULTADOS: Não houve diferenças estatisticamente significantes na espessura da mucosa intestinal entre os 5 subgrupos de ratos analisados no período de 24 horas após a injeção do inóculo. 37 animais que receberam o inóculo evoluíram para o óbtito entre 5,83 e 28 horas, com 2 animais do grupo L sobrevivendo por um período de 28 horas.

CONCLUSÃO: A sepse aguda não causou alterações morfológicas mensuráveis através desta metodologia na parede intestinal.

Descritores: Mucosa. Intestino. Ratos. Morfometria.

ABSTRACT

PURPOSE: To verify which are the possible morphological alterations caused by the contamination of a bacterial monoculture in the abdominal cavity of rats, after treatment by draining, washing and the combination of those two processes.

METHODS: Fifty adult female rats were distributed in five groups: 1. Control: intraperitoneal injection of Pseudomonas aeruginosa. 2. Drainage: intraperitoneal injection of P.aeruginosa and drainage of the abdominal cavity, after 6 hours. 3. Washed intraperitoneal injection of P.aeruginosa and washing of the abdominal cavity, after 6 hours. 4. Washed + drainage: intraperitoneal injection of P.aeruginosa plus drainage and washing of the cavity, after 6 hours 5. Normal: evaluation of the normal intestinal wall. After death, blood culture and peritoneal culture were performed. Fragments of jejunum were removed and processed histologically for morphometric measure.

RESULTS: There were not statistically significant differences on the intestinal mucosa's thickness between the 5 groups analyzed in the period of 24 hours. From the 40 animals which received the inoculum, 37 evoluted to death in between 5.83 and 28 hours, with 2 animals from group L surviving for a period of 28 hours.

CONCLUSION: The acute sepsis did not cause measurable morphological alterations through this methodology in the intestinal wall of these animals.

Key words: Mucosa. Morphometry. Rats. Intestin.

Introdução

A contaminação da cavidade peritoneal é considerada uma urgência médica, sua conseqüência mais temida é a sepse. Apesar do avanço científico, técnica cirúrgica minuciosa e terapia antimicrobiana adequada, a taxa de mortalidade da sepse de origem abdominal grave ainda continua em torno de 40 a 50 %^1,2,3,4,5 sendo semelhante àquela de quatro décadas atrás.

O modelo experimental de sepse é um método de estudo no qual é possível avaliar e controlar o fenômeno séptico como um processo dinâmico, desde a sua instalação até o desenvolvimento da falência terminal dos órgãos e sistemas⁶. A morte ocorre em virtude da disfunção de múltiplos órgãos e sistemas, secundária à manutenção da sepse intraperitoneal com focos residuais de infecção, ou em decorrência da translocação bacteriana e da liberação de mediadores inflamatórios.^7,8,9

Acredita-se, que o intestino delgado e o colo são muito importantes na manutenção do hipermetabolismo da sepse, na síndrome da resposta inflamatória sistêmica e na disfunção de múltiplos órgãos e sistemas^3,8,9, além de serem identificados como um dos alvos primários de lesão na sepse.^10,11

Na cavidade abdominal dos mamíferos o peritônio tem funções importantes e responde à agressão séptica com ações envolvendo a membrana peritoneal, as alças intestinais e os compartimentos líquidos do organismo que produzem então respostas secundárias endócrinas, cardíacas, respiratórias, renais e metabólicas. O objetivo de tais respostas é neutralizar, destruir ou limitar a ação dos agentes agressores e fazer reparo das lesões por estes causadas.¹² O tratamento convencional para esta condição inclui administração de fluidos e antibióticos intravenosos e remoção da fonte de contaminação da cavidade peritonial.¹³ Neste tipo de tratamento geralmente utiliza-se a drenagem da cavidade peritoneal, com emprego de dreno intraperitonial para remoção da fonte de contaminação da cavidade.

Parte significativa da literatura e dos experimentos tem se dedicado ao uso tópico de soluções contendo antibióticos, para lavagem peritoneal após a inoculação intraperitoneal de bactérias ou de um pool de bactérias.^14,15,16,17

Dentre os diversos tratamentos propostos para a contaminação peritoneal, dois são utilizados com maior freqüência: a drenagem e o lavado peritoneal, embora não haja provas científicas definitivas para sua utilização.^18,19,20,21 Não há, ainda, parâmetros fixos que determinem a indicação sistematizada da drenagem e lavado abdominais, após a instalação deste tipo de contaminação.

Sob diversas condições nutricionais e patológicas, o intestino pode sofrer atrofia, comprometendo suas funções essenciais. A atrofia intestinal é manifestada por diminuição do peso da mucosa, do conteúdo de DNA e proteína da mucosa e por alteração na sua estrutura, através da visualização da mucosa intestinal macroscópicamente.

A luz do trato gastrointestinal normalmente contém numerosas espécies de bactérias, aumentando do proximal para o distal em espécies e quantidade⁶, e uma alta concentração de endotoxinas. Cabe à mucosa intestinal a função de exercer localmente uma defesa contra a absorção e disseminação desses agentes patógenos.^{22,23,24,25,26} Os microorganismos intracelulares facultativos (Salmonella spp e Listeria monocytogenes) e as bactérias Gram negativas podem atravessar a parede intestinal de forma razoavelmente fácil. ⁶

A integridade física da mucosa provavelmente representa a principal linha de defesa dessa barreira intestinal^{26,27,28,29,30}, sendo auxiliada pelos componentes do sistema imune celular (enterócitos, macrófagos e linfócitos T) e humoral (IgG, IgM e IgA secretória).

A manutenção da integridade celular do epitélio intestinal evita a migração trans-epitelial de partículas da luz intestinal, enquanto a preservação das junções intercelulares previne o movimento dessas partículas através dos canais paracelulares.^28,29,31,32

Um aumento na absorção de macromoléculas, bactérias e toxinas bacterianas tem sido demonstrado em situações onde a mucosa intestinal está danificada por inflamação, infecção ou neoplasia.²⁹ O significado dessa afirmação ainda é difícil de ser determinado, mas os trabalhos mais recentes sugerem que a translocação de microorganismos e toxinas ativa uma reação inflamatória em cadeia que promove a falência orgânica.^{22,23,24,26,30,31}

A atrofia da mucosa do trato gastrointestinal (principalmente intestino delgado) na sepse é amplamente discutida na literatura.^{1,4,6,7,22,26,29,30,33,34,35} Entretanto, todos os trabalhos consultados utilizam métodos de indução de sepse que causam alterações lentas no organismo, tornando o tempo de sobrevida mais prolongado.

Para avaliar atrofia do intestino delgado, a maioria dos trabalhos encontrados na literatura utiliza parâmetros morfológicos através de análise patológica. Esses parâmetros incluem arquitetura da parede do trato gastrointestinal, evidências de congestão ou hemorragia, inflamação de mucosa e submucosa e necrose.^36,37,38,39 Entretanto, todos esses parâmetros são subjetivos e dependem da observação do examinador, portanto qualitativos.⁴⁰

Na literatura analisada, são raros os trabalhos que utilizam procedimentos histomorfométricos para avaliar os efeitos sobre a parede intestinal provocados por sepse, além disto, não existe nenhum trabalho que realiza a indução de sepse com Pseudomonas aeruginosa, ou seja, com uma monoculatura bacteriana e com tempo de sobrevida curto (em horas) a fim de verificar quais as alterações iniciais provocadas pela indução da sepse na mucosa intestinal após os tratamentos de lavagem e/ou dreno que são amplamente utilizados na prática médica após o estabelecimento de um processo séptico na cavidade abdominal.

Desta forma, propôs-se a avaliar morfométricamente a camada mucosa do intestino delgado de ratos após sepse experimental de origem abdominal empregando-se técnicas que permitem quantificar as possíveis alterações morfológicas da mucosa intestinal em microscopia óptica ,comparando-se os 3 tipos de tratamento empregados após a indução de uma sepse provocada por um único tipo de bactéria.

Métodos

Este trabalho passou pela aprovação da Comissão de Ética em Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

Para o presente trabalho foram utilizados 50 ratos fêmeas da linhagem Wistar, todos do sexo feminino, com idade média de 120 dias e peso entre 150 e 250g, provenientes do Biotério Central da UFSC.

Os animais receberam alimentação própria, com acesso livre a dieta e água durante todo o experimento, sendo mantidos sob luz natural, em gaiolas apropriadas e condições ambientais de ruído, temperatura e umidade, padronizadas. Os animais foram distribuídos em cinco subgrupos de dez ratos cada um, conforme a descrição a seguir:

1) Grupo controle - C: no qual injetou-se (1 ml de inóculo bacteriano para cada 100g de peso do animal) um inóculo padrão intraperitonealmente de Pseudomonas aeruginosa, por via transparietal em 10 (dez) ratos . Este inóculo padrão estava em solução aquosa de Cloreto de Sódio a 0,9 %, na quantidade de 1,2 .10 ⁹ bactérias por mililitro de suspensão. Esses animais foram submetidos à avaliação clínica constante e não receberam nenhum tipo de tratamento.

2) Grupo dreno - D: injetou-se o mesmo inóculo padrão intraperitonealmente, por via transparietal em dez ratos. Esses animais foram submetidos à avaliação clínica constante e após seis horas da inoculação, os animais foram anestesiados e realizada uma antissepsia da parede abdominal, laparotomia e drenagem da cavidade abdominal através de um dreno laminar. Após a operação foi realizada observação clínica do animal até o momento do óbito.

3) Grupo lavado – L: injetou-se o mesmo inóculo padrão intraperitonealmente, por via transparietal em dez ratos. Esses animais foram submetidos à avaliação clínica constante e após seis horas da inoculação, os animais foram anestesiados e realizada antissepsia da parede abdominal, laparotomia e lavagem da cavidade abdominal com 20 ml de solução aquosa de cloreto de sódio na concentração de 0,9%. Após a operação foi realizada observação clínica do animal até o momento do óbito.

4) Grupo lavado + dreno – LD: injetou-se o mesmo inóculo padrão intraperitonealmente, por via transparietal em dez ratos. Esses animais foram submetidos à avaliação clínica constante e após seis horas da inoculação, os animais foram anestesiados e realizada antissepsia da parede abdominal, laparotomia, lavagem da cavidade abdominal com 20 ml de solução aquosa de cloreto de sódio na concentração de 0,9% e drenagem da cavidade através de um dreno laminar. Após a operação foi realizada observação clínica do animal até o momento do óbito.

5) Grupo normal – N: Dez animais hígidos, os quais não receberam a injeção intraperitoneal do inóculo padrão, foram anestesiados e induzidos à eutanásia para obtenção de amostras de jejuno para avaliação morfométrica de parede intestinal normal.

Para a anestesia foi utilizada uma solução de Ketamina (5 ml) e Xilasina a 2% (1 ml) sendo injetado 0,5 ml da solução, pela via intramuscular, na face interna da pata traseira direita do animal. O animal foi considerado anestesiado, quando havia perdido o reflexo córneo-palpebral e não exibia qualquer reação motora pela preensão do coxim adiposo de sua pata dianteira. Realizou-se a síntese da parede abdominal por planos. Para as camadas peritoneal e muscular, foi utilizado fio de polipropileno 5-0, em chuleio contínuo interrompido a cada quatro pontos. A pele foi suturada com fio monofilamentar de Nylon® 5-0 com pontos simples.

Nos animais em que se usou o dreno abdominal, foram utilizados dispositivos tipo "colar cervical", conforme descrito por Ely e col.⁴¹ com o objetivo de manter a imobilidade da cabeça do animal e, portanto, evitar que o mesmo retirasse o dreno. Após o óbito, os animais foram submetidos a incisão tóraco-abdominal, para a realização do inventário das cavidades.

Foram realizadas hemoculturas de todos os grupos de animais experimentais, para isto, foi colhida uma amostra de 1 ml de sangue intracardíaco sob condições assépticas. Essa amostra foi preservada em meio específico para cultivo de bactérias aeróbicas (Pedi-BacT® - Lab. Organon Teknika).

Para avaliação histológica, foram retirados fragmentos de intestino delgado com 2 cm de comprimento, num ponto localizado a 5 cm distalmente ao ângulo de Treitz. As peças retiradas foram lavadas em solução salina e fixadas em solução de Bouin por um período de 24hs. A seguir, as peças foram submetidas ao processo de inclusão em parafina, seguindo a técnica histológica de rotina adotada pelo serviço. Os tempos de desidratação e diafanização foram padronizados previamente, sendo os mesmos para todos os grupos experimentais de animais analisados.

Após a inclusão em parafina das peças de intestino delgado foram obtidos 10 cortes semi-seriados de 10 µm de espessura segundo um mesmo plano de corte transversal ao intestino delgado de todos os animais . Os tempos de pescagem dos cortes foram padronizados para todos os grupos experimentais, a fim de se evitar alterações provocadas pelos procedimentos técnicos empregados na técnica histológica de rotina. As lâminas assim obtidas foram coradas pela Hematoxilina-Eosina e submetidas á análise morfométrica⁴² . Com a régua ocular, previamente calibrada foram realizadas medidas da espessura total da parede do intestino delgado e da espessura da camada mucosa e submucosa em três (3) vilosidades intestinais. Apenas vilosidades seccionadas longitudinalmente da sua base até o seu ápice com uma única camada de células epiteliais foram consideradas para avaliação das espessuras do intestino delgado.

A medida da espessura total da parede do intestino delgado foi realizada colocando o ponto zero da régua ocular na camada serosa abaixo da vilosidade medindo-se a espessura até a última camada de células epiteliais em micrômetros.

A medida da camada mucosa e submucosa foi realizada colocando-se o zero da régua ocular entre as células da camada muscular circular interna e as da submucosa, medindo-se até a última camada de células epiteliais no ápice da vilosidade. Foram realizadas medidas das 3 (três) melhores vilosidades visualizadas, sendo utilizado como resultado, o valor médio dessas medidas.

Resultados

O tamanho médio das medidas obtidas da mucosa e da parede intestinal distribuídas entre os diversos grupos pode ser avaliada na Tabela 1.

Quando esses resultados são submetidos ao estudo estatístico de Análise de Variâncias, que compara médias de diferentes grupos, não se identifica diferença estatisticamente significante entre os grupos (P>0,05).

Quanto à avaliação do tempo de óbito dos animais experimentais, pôde-se observar que dos 40 animais utilizados, 37 evoluíram para o óbito em um período de tempo que variou de 5,83 horas até 28 horas. Nos grupos controle e lavado + dreno, todos os animais evoluíram para o óbito nas primeiras 24 horas. No grupo dreno, 9 animais evoluíram para o óbito em até 36 horas, havendo um sobrevivente após esse período. No grupo lavado houve dois sobreviventes e o tempo de óbito foi de até 28 horas.

A Tabela 2 mostra o resultado obtido nas hemoculturas dos diversos grupos experimentais , com a obtenção de sangue intracardíaco colhido em condições assépticas e plaqueado em meio para cultivo de bactérias anaeróbicas (Pedi-BacT® -Lab.Organon Teknika). O resultado da hemocultura indica que dos 40 animais analisados, em 36 deles (90%) houve crescimento de Pseudomonas aeruginosa na hemocultura e em 21 (52,5%) houve crescimento de Escherichia coli.

A Tabela 3 apresenta o tempo médio de sobrevida dos animais experimentais que obtiveram êxito letal em até 36 horas, distribuídos entre os diferentes grupos.

Estatisticamente, não foi possível (p > 0,05) demonstrar diferença entre o tempo médio de óbito dos animais nos diferentes grupos experimentais.

Quando comparados o tempo de óbito dos animais experimentais com a medida da altura da camada mucosa e da parede intestinal, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05) (Figura 1).

Os resultados de hemocultura e cultura peritoneal foram submetidos ao teste estatístico de análise de correspondência, para variáveis qualitativas, que não mostrou significância estatística (p > 0,05) entre os diferentes grupos estudados.

Quando comparada à medida da altura da camada mucosa e da lâmina própria com os achados da hemocultura e cultura peritoneal, não se evidenciou diferença estatisticamente significante (p > 0,05).

Discussão

A morfometria, quando utilizada para avaliar a atrofia da mucosa do trato gastrointestinal, torna-se um método objetivo com parâmetros quantitativos específicos, e não só qualitativos. Um dos parâmetros utilizados é a mensuração da espessura da camada mucosa intestinal, com ênfase para o tamanho das vilosidades, que podem apresentar modificações em seu tamanho após um desafio séptico.^43,44,45

Além da sepse , a análise morfométrica também é utilizada em modelos experimentais de isquemia do trato gastrointestinal ^5,43,45, nutrição parenteral ^33,42, e colite.^40,44,43

A maior parte dos trabalhos na literatura pesquisada indica que a sepse e o choque séptico ocasionam uma diminuição importante da resistência vascular sistêmica e uma má distribuição do fluxo sanguíneo no organismo.^{5,30, 38,42,44,45,46}

Essa redistribuição do fluxo sanguíneo privilegiaria áreas mais nobres como o cérebro e os rins em detrimento de órgãos como o trato gastrointestinal, pâncreas e, em menor proporção, a musculatura esquelética.^{10,11,45,47,48}

Esse regime de isquemia, associado ao estado de hipermetabolismo próprio da sepse levaria à atrofia da mucosa.

Yassim e col. ⁴³ utilizando um método de isquemia e reperfusão, compararam a análise morfológica com a análise morfométrica da parede do intestino delgado. Foram encontradas nítidas alterações de tamanho nas vilosidades da camada mucosa na ausência de alterações morfológicas na microscopia óptica, concluindo que a morfometria tem uma sensibilidade maior que a análise morfológica no intestino delgado.

Neste trabalho não se verificou alterações estatisticamente significativas do tamanho das vilosidades intestinais nos diversos grupos experimentais analisados, já que o método empregado no presente experimento não provoca uma isquemia e analisa os resultados em tempos diferentes daqueles utilizados pelos autores supracitados. Suspeita-se que essa maior resistência à lesão do jejuno, quando comparada ao íleo ou ao colo, seja decorrente de uma maior vascularização desse segmento, havendo maior proteção contra a lesão isquêmica.

Zabel e col.⁴⁷ demonstraram que existe um gradiente entre a pO₂ da mucosa e a pO₂ da serosa do trato gastrointestinal e que essa diferença se agrava em regimes de hipoperfusão.

Com base nesssas teorias, pode-se concluir que a sepse gera uma redistribuição do fluxo para fora da circulação esplâncnica e para longe da mucosa, tornando as vilosidades do intestino delgado o principal alvo da lesão isquêmica.

A outra causa de lesão mucosa, provavelmente associada à hipoperfusão, é a pobre extração e utilização dos nutrientes (principalmente aminoácidos como a glutamina) pela mucosa do trato gastrointestinal, apesar das taxas normais de O_2.^8,28,48 A glutamina é a principal fonte de energia para os enterócitos^7,50 e na sepse ou endotoxemia a glutamina intestinal está reduzida, podendo causar alterações metabólicas locais e consequentemente atrofia mucosa.^{5, 33,50,51,52,53}

O método de morfometria utilizado neste experimento é semelhante ao método utilizado por Nascimento e col.⁴² e por Myers e col.³⁷ utilizando para mensuração da altura das vilosidades uma régua adaptada à lente ocular do microscópio óptico.

Nakka e col.³³, utilizando duas formas de nutrição parenteral total após sepse por E. coli em ratos, encontraram alterações no tamanho da mucosa apenas no íleo terminal, não encontrando alterações no jejuno, ou nos pontos médios do intestino delgado ou do colo. Estes resultados estão de acordo com os encontrados em nosso trabalho, já que analisamos a porção inicial do jejuno destes animais.

Esses trabalhos suportam a hipótese de que a mucosa do intestino delgado é mais responsiva a alterações tanto experimentais quanto clínicas, quando comparada com a mucosa do intestino grosso.

Os trabalhos mais recentes^{1,2,5,42,33,40} utilizam, para avaliar morfometricamente a altura da camada mucosa, imagens digitalizadas do microscópio óptico que são analisadas por um programa de computador específico.

Farges e col.³⁶ utilizando lipopolissacarídeos de Escherichia coli para induzir endotoxemia em ratos encontraram uma diminuição da altura das vilosidades no íleo. Entretanto, a altura das vilosidades do jejuno não se alterou, assim como a profundidade das criptas, tanto no jejuno quanto no íleo.

No presente trabalho, foi avaliada apenas a altura da camada mucosa e da parede intestinal do jejuno. Assim como na literatura, no jejuno não houve alterações evidentes na parede intestinal que pudessem ser avaliadas à luz da microscopia óptica.

A exata fisiopatologia da lesão na mucosa do intestino delgado ainda não está completamente elucidada.

Embora a atrofia da mucosa o tracto gastrointestinal (principalmente intestino delgado) na sepse seja amplamente discutida na literatura^{1,22,26,29,30,34,35,42}, todos os trabalhos consultados utilizam métodos de indução de sepse que causam alterações lentas no organismo, tornando o tempo de sobrevida mais prolongado. No método utilizado de indução de sepse com Pseudomonas aeruginosa, o tempo de sobrevida médio entre todos os grupos foi de 15,5 horas, provavelmente não havendo tempo de evolução suficiente para causar uma atrofia de mucosa visualizável na microscopia óptica.

Com base no exposto acima , este trabalho nos permite concluir que a sepse aguda não causou alteração mensurável na parede intestinal ou na camada mucosa do intestino delgado empregando-se lavagem, dreno ou a associação dos dois processos no tratamento de ratas após o desafio séptico com Pseudomonas aeruginosa, provavelmente devido ao tempo extremamente curto de análise empregado neste modelo experimental.

Conclusão

A sepse aguda não causou alterações morfológicas mensuráveis na parede intestinal de ratos.

Data do recebimento: 05/12/2003

Data da revisão: 09/01/2004

Data da aprovação: 25/01/2004

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

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Trabalho do Núcleo de Pesquisa da Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de Santa Catarina (TOCE-UFSC).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Mar 2006
• Data do Fascículo
  Abr 2004

Histórico

• Revisado
  09 Jan 2004
• Recebido
  05 Dez 2003
• Aceito
  25 Jan 2004