Comparação de diferentes doses de colagenase em modelo de indução de tendinite para eqüinos: estudo clínico e ultra-sonográfico

Comparison of different doses of collagenase-induced equine tendonitis: clinical and ultrasonographic study

ARTIGOS CIENTÍFICOS

CLÍNICA E CIRURGIA

Comparação de diferentes doses de colagenase em modelo de indução de tendinite para eqüinos: estudo clínico e ultra-sonográfico

Comparison of different doses of collagenase-induced equine tendonitis: clinical and ultrasonographic study

Ana Lucia Miluzzi Yamada^I,1; Ana Liz Garcia Alves^II; Carlos Alberto Hussni^II; José Luiz de Mello Nicoletti^II; Armen Thomassian^II; Marcos Jun Watanabe^III; Rodrigo Carneiro^I

^IPrograma de Residência em Clínica Cirúrgica de Grandes Animais, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, Brasil

^IIIPrograma de Pós-graduação em Cirurgia Veterinária, Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, Brasil

RESUMO

Neste estudo, lesões tendíneas foram induzidas experimentalmente em eqüinos por meio da administração de diferentes doses de colagenase. Foram usados 12 eqüinos adultos, clinicamente sadios e distribuídos aleatoriamente em dois grupos que receberam diferentes doses de colagenase. O grupo 1 (G1) recebeu 1,25mg e o grupo 2 (G2) recebeu 2,5mg de colagenase. Com a agulha posicionada no centro dos tendões flexores digitais superficiais dos membros torácicos, as diferentes doses de colagenase foram aplicadas conforme o grupo experimental. O acompanhamento das lesões tendíneas baseou-se em exames físicos e ultra-sonográficos, realizados a cada sete dias até o período de 28 dias pós-indução. Nas imagens ultra-sonográficas, foram avaliados os parâmetros ecogenicidade, percentual de área lesada, grau de redução e severidade das lesões do tendão flexor digital superficial. O parâmetro mais fiel em resposta às diferentes doses de colagenase administradas foi o percentual de área lesada no interior do tendão. O G2 apresentou uma melhor resposta ultra-sonográfica da tendinite do flexor digital superficial para a realização de estudos experimentais.

Palavras-chave: tendinite, colagenase, ultra-som, eqüino.

ABSTRACT

In this study, tendinous injuries were induced experimentally in horses, through the administration of different doses of collagenase. Twelve horses, clinically healthy, were distributed into two groups that received different doses of collagenase. Group 1 (G1) received 1.25mg and Group 2 (G2) received 2.5mg of collagenase. With the needle positioned at the center of the superficial digital flexor tendon in the equine forelimbs, different doses of collagenase were applied in agreement the experimental group. The monitoring of colagenase-induced tendonitis was based on physical and ultrasonographic exams, carried out every seven days until the period of 28 days post-induction. In the images of ultrasound were evaluated the echogenicity, the percentage of injured area, degree of reduction and severity of injuries of colagenase-induced tendonitis. The most accurate parameter in response to different doses of collagenase administered was the percentage of area injured in the interior of the tendon. The G2 presented one better ultrasonographic reply of the tendonitis of the superficial digital flexor for the accomplishment of experimental studies.

Key words: tendonitis, colagenase, ultrasound, equine.

INTRODUÇÃO

O tendão flexor digital superficial (TFDS) é freqüentemente agredido por diferentes mecanismos, e as lesões expressam-se no plano tecidual por fenômenos degenerativos e alterações inflamatórias em diferentes graus de intensidade (ALVES, 1998). Essas lesões cicatrizam lentamente, e de 20 a 60% dos cavalos afetados retornam à atividade atlética, mas acima de 80% deles apresentam reincidência da lesão (GENOVESE et al., 1997). Como conseqüência, observa-se que a tendinite do flexor digital superficial está entre as principais causas da diminuição de desempenho e claudicação dos eqüinos atletas, gerando grandes perdas econômicas na medicina esportiva eqüina (WILSON et al., 1996; GILLIS, 2004).

Recentes investigações científicas sobre a ultra-estrutura do TFDS, suas propriedades mecânicas e suas respostas à lesão e às modulações farmacológicas da reparação tendínea buscam elucidar dúvidas sobre a etiopatogenia da tendinite, contribuindo assim para o desenvolvimento de métodos preventivos e terapêuticos mais eficazes (ALVES et al.,1993; DOWLING et al., 2000; ALVES et al., 2001 a; ALVES et al., 2001 b).

O extrato de colagenase purificado de bactérias possui a característica de destruir enzimaticamente as fibras colágenas e, quando aplicado pela via intratendínea, pode ser utilizado modelo experimental que mimetiza os sinais clínicos e os efeitos de uma lesão de ocorrência natural, como, por exemplo, a tendinite causada pelo estresse mecânico da atividade esportiva de alto desempenho (ALVES, 1998; ALVES et al., 2002).

Sabe-se que o exame ultra-sonográfico do TFDS é essencial para a avaliação e o acompanhamento da cicatrização da lesão tendínea (FERRARO et al., 2003). Nesse exame, um TFDS normal apresenta-se isoecóico e em corte longitudinal é composto por fibras longas e paralelas e de ecogenicidade característica. A lesão recente do TFDS apresenta-se anecóica resultante da hemorragia, fibrólise ou tecido de granulação inicial (REEF, 1998). Já a destruição do colágeno pela administração da colagenase é caracterizada por áreas hipoecóicas ou anecóicas, e o decréscimo da ecogenicidade depende diretamente da dose de colagenase administrada (SPURLOCK et al., 1989). A utilização de um modelo experimental em que haja padronização das lesões tendíneas permite a aplicação de diferentes protocolos terapêuticos, além de possibilitar o estudo do processo de formação da lesão e do processo cicatricial (CREVIER-DENOIX et al., 2005; MARXEN et al., 2004).

Nesse sentido, por meio da presente pesquisa objetivou-se padronizar lesões tendíneas induzidas experimentalmente em eqüinos a partir da administração de diferentes doses de colagenase, avaliando-se aspectos clínicos e ultra-sonográficos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 12 eqüinos adultos, machos e fêmeas, com faixa etária média de seis anos e peso médio de 400kg, sem raça definida e clinicamente sadios. Antes do período experimental foram submetidos a exames físicos e laboratoriais para a constatação do estado de higidez e a exame de claudicação visando à verificação da normalidade do aparelho locomotor. Durante todo o experimento foram mantidos em baias individuais e alimentados com feno de capim "coast-cross", água ad libitum e suplementados com ração comercial e composto mineral para eqüinos.

Os cavalos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos conforme a dose de colagenase aplicada nos membros torácicos: grupo 1 (G1) foi composto de seis animais submetidos à aplicação de 1,25mg de colagenase^a, correspondente a 0,5mL de solução a 2,50%; e o grupo 2 (G2) foi composto de seis animais submetidos à aplicação de 2,5mg de colagenase, correspondente a 1,0mL de solução a 2,5%. Antes do protocolo de aplicação da colagenase os cavalos foram submetidos à palpação do TFDS para observação de sensibilidade dolorosa, aumento de volume e temperatura local e ao exame ultra-sonográfico para verificar possíveis alterações que pudessem comprometer as avaliações preconizadas.

Os exames ultra-sonográficos foram realizados com o eqüino contido em tronco e em posição quadrupedal. Após tricotomia da região palmar do 3° metacarpiano, o TFDS foi avaliado com o aparelho ultra-sonográfico provido de transdutor linear de 7,5MHz^b, sendo obtidas imagens em cortes transversais e longitudinais registradas por meio da impressão em papel^c´.

Com o cavalo contido em tronco foi realizada sedação com xilazina a 10%^d na dose de 0,5mg kg^-1 pela via intravenosa e anestesia local por meio do bloqueio perineural dos nervos digitais palmares lateral e medial no terço proximal da região metacarpiana, onde foram aplicados 2mL de lidocaína sem vasoconstrictor^e em cada ponto. A região foi então preparada com antissepsia com álcool iodado e uma agulha hipodérmica 30x8^f foi introduzida na região palmar do TFDS a 15cm distal ao osso acessório do carpo, no sentido perpendicular à pele até atingir o centro do tendão. O posicionamento da agulha e a aplicação da colagenase foram acompanhados pela ultra-sonografia. O procedimento de aplicação de colagenase foi o mesmo para ambos os membros torácicos e grupos, porém as doses de colagenase aplicadas intratendíneas foram de 1,25mg e 2,50mg de colagenase, respectivamente, para os grupos G1 e G2.

O monitoramento das lesões tendíneas baseou-se nos exames clínicos e ultra-sonográficos realizados a cada sete dias até o período de 28 dias pós-indução (D7, D14, D21 e D28). Ao exame clínico foi avaliado o aumento de volume, classificado em escore de 0 a 5 (0 = sem aumento de volume; 1 = discreto aumento de volume; 2 = aumento de volume evidente; 3 = moderado aumento de volume; 4 = severo aumento de volume; 5 = aumento de volume grave) e graus de claudicação segundo STASHAK (2002), em que I = claudicação não observada a passo, mas reconhecível ao trote; II = claudicação notada ao passo e evidente ao trote; III = claudicação evidente ao passo e ao trote; IV = claudicação que quase não suporta peso algum no membro; V = impotência funcional do membro ou decúbito.

Na ultra-sonografia, foram avaliados os parâmetros: Ecogenicidade da lesão (0 = ecóico; 1 = predomínio ecóico; 2 = 50% ecóico e 50% anecóico; 3 = predomínio anecóico; 4 = totalmente anecóico), segundo GENOVESE et al. (1986); percentual de área lesada no interior de cada tendão, (área da lesão/área total do tendão) x 100, segundo GENOVESE et al. (1990); percentual de redução da lesão, mensurando o percentual da área da lesão inicial e das avaliações subseqüentes e o paralelismo das fibras colágenas, avaliado por meio das imagens longitudinais (0 = ausência de paralelismo; 1 = discreto; 2 = parcial; 3 = total); e grau de severidade da lesão, expresso pela relação entre a ecogenicidade e o percentual de área da lesão, em escala de 0 a 10.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 4, em que o primeiro fator foi representado pelas diferentes doses aplicadas (G1 e G2) e o segundo fator foi representado pelas diferentes épocas de avaliação (sete, 14, 21 e 28 dias) e com seis repetições (sendo cada repetição um animal). Os dados foram submetidos à análise de variância e, em caso de significância (P<0,05), foram submetidos ao Teste de Tukey para a comparação de médias, em nível de 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A resposta imediata da administração da colagenase relacionou-se com os achados das pesquisas realizadas por ALVES et al. (2002), MARXEN et al. (2004) e BARREIRA (2005), as quais verificaram alterações clínicas locais em todos os animais, nas primeiras 24 a 48 horas após a aplicação da enzima. Nos grupos experimentais, foram observados sinais de processo inflamatório, tais como aumento de temperatura, aumento de volume e sensibilidade dolorosa locais. A face palmar do TFDS, no ponto de aplicação da colagenase, tornou-se espessada para os dois grupos. MARXEN et al. (2004) relataram que o aumento de volume no ponto de aplicação conserva-se até o final do experimento, explicado por GOODSHIP et al. (1994), os quais descrevem que o espessamento do TFDS na fase inicial deve-se à presença de líquido inflamatório e na fase final, ao tecido cicatricial neoformado.

ALVES et al. (2002) relataram que as reações posteriores à aplicação de colagenase, encontradas ao exame físico e ultra-sonográfico, se assemelharam às lesões provocadas por excesso de exercícios. Em G1, o processo inflamatório inicial apresentou-se evidente, não seguindo o padrão encontrado na literatura (HENRY et al., 1986). A partir da terceira semana, após a indução da lesão, G1 apresentou menor resposta inflamatória local. Apesar de não haver significância estatística, foi observado que o exame físico de G1 foi diferente de G2 (Tabela 1) em todos os momentos, sendo as imagens ultra-sonográficas vantajosas para acompanhar a evolução da lesão tendínea, já que não houve uma constante relação entre a gravidade das lesões nas imagens ultra-sonográficas e os achados do exame clínico (ALVES, 1998).

As enzimas bacterianas agridem as moléculas de colágeno em múltiplos locais ao longo da cadeia, causando rápida solubilização do colágeno, destruição de células e matriz não-colágena, com conseqüente ruptura das fibras (SPURLOCK et al., 1989; FOLAND et al., 1992). Tal processo resulta em hemorragias, formação de hematomas, inflamação, acúmulo de fluídos, quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos e deposição de fibrina para o local lesionado (ALVES, 1998). MARR et al. (1993) relataram que a anecogenicidade foi resultante principalmente de hemorragia intratendínea, separação de fibras e edema.

As imagens ultra-sonográficas de G1 na primeira semana apresentaram lesões com menor ecogenicidade, percentual de área lesada e menor severidade em comparação com o G2 no mesmo período (Tabelas 1, 2 e 3). O G2 apresentou escore médio de severidade de lesão maior nas duas primeiras semanas.

Uma lesão recente do TFDS deve apresentar-se como área anecóica ou hipoecóica, podendo ser difusa ou localizada. G1 apresentou lesões difusas nos primeiros sete dias de experimento, e G2, lesões localizadas, explicadas pela diferente dose de colagenase administrada. As lesões localizadas receberam maior escore de ecogenicidade e porcentagem de lesão por possuírem melhor delimitação, resultando em maior severidade de lesão. MACHADO et al., (2000); ALVES et al., (2002); MARXEN et al., (2004) e BARREIRA (2005) relataram que lesões induzidas com diferentes doses de colagenase (1,25mg, 2,5mg) apresentam padronização desde o sétimo dia até o vigésimo dia após a aplicação da enzima.

Houve diferença significativa para ecogenicidade nas quatro semanas de avaliação (P<0,05). Na primeira semana, G1 apresentou ecogenicidade 38,5% menor do que G2. Na segunda semana, não houve diferença significativa entre G1 e G2. Para a terceira e a quarta semana, G1 apresentou maior ecogenicidade do que G2 (27% e 44,1%, respectivamente). Os resultados demonstrados por G2 correlacionam-se com os resultados apresentados na literatura consultada, os quais indicam que a colagenase tem maior ação até os 20 primeiros dias, e a remissão dos sinais clínicos da fase aguda acontece a partir deste período, o G1, ao contrário de G2, apresentou lesões progressivas (Tabela 2).

Observa-se que G1 apresentou um percentual de área lesada menor que G2 nas duas primeiras semanas do experimento (Tabela 3). O G2 apresentou lesões com percentual de área lesada semelhantes durante as quatro semanas. A dose de 1,25mg provocou 19,2% de lesão a menos que a dose de 2,5mg, independente da semana (P<0,01). Houve diferença significativa entre G1 e G2 (P<0,01) no decorrer do experimento. Para G1, houve menor porcentagem de área lesada na primeira e na segunda semana em comparação ao G2. Além disso, G2 apresentou 59,1% a mais de área lesada nas duas primeiras semanas em relação a G1. Na terceira semana, não houve diferença significativa entre as doses e na quarta semana a porcentagem de área lesada foi 40,5% maior quando foi utilizada a dose de 1,25mg.

O G1 manteve lesões difusas e progressivas até a terceira semana de experimento, o que não torna prático o acompanhamento ultra-sonográfico para o emprego de estudos de cicatrização tendínea. O G2, por sua vez, apresentou lesões com rápido decréscimo de ecogenicidade e um quase constante percentual de área lesada, possibilitando melhor correlação com os aspectos clínicos e experimentais. (ALVES et al., 2002; MARXEN et al., 2004; BARREIRA, 2005). Inferimos que a resposta alterada de G1 em relação ao desenvolvimento das lesões tendíneas e a G2 se deve à maior mobilidade dos animais desse grupo; decorrente de menor lesão inicial e da menor dose aplicada, resultando em lesões ainda severas ao final do experimento.

A severidade da lesão na primeira semana foi significativamente diferente ao serem comparadas as duas doses. O G1 apresentou lesões menos severas que G2 para a primeira e a segunda semana. Na terceira e na quarta semana, G1 apresentou lesões mais severas que G2 (Tabela 4).

Na terceira semana, G1 apresentou remissão da resposta inflamatória local, porém evolução progressiva das lesões nas imagens ultra-sonográficas, resultando em percentual de redução da lesão igual a zero para todas as semanas. O G2 apresentou uma média do percentual de redução dos membros torácicos de 13,90% na terceira semana e de 28,60% na quarta semana, demonstrando diferença em relação ao G1. MARXEN et al. (2004) relataram que os animais apresentaram maior severidade de lesão entre o sétimo e o vigésimo terceiro dia após indução. A partir da segunda semana após a injeção de colagenase as lesões tendem a reduzir de gravidade e apresentar áreas cicatriciais com fibras colágenas pouco organizadas e espessamento de bainha tendínea. Esses dados foram compatíveis com G2, e o G1 apresentou lesões extensas, anecóicas ou hipoecóicas até o final do experimento (MACHADO et al., 2000; ALVES et al., 2002; BARREIRA, 2005).

CONCLUSÕES

Conclui-se que a ultra-sonografia apresentou vantagens por ser um método não-invasivo de estudo e possibilitar uma avaliação estrutural mais precisa, complementando o exame físico. Para o estudo de tratamentos e lesões do TFDS, o protocolo de 2,5mg de colagenase (G2) é o mais adequado para indução de tendinite, já que o G2 apresentou resultados mais condizentes comparados aos casos clínicos.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa de Iniciação Científica concedida, processo n° 04155192R.

FONTES DE AQUISIÇÃO

a - Colagenase tipo 1 C-0130 - Sigma Pharmaceutical, EUA.

b - SSD 900 marca ALOKA - Berger, Brasil.

c - Impressora térmica UP8 - Sony, Brasil.

d - Sedazine - Fort Dodge Saúde Animal, Brasil.

e - Xylestesin 2% - Cristália, Brasil.

f - Agulha descartável - Becton, Dickinson and Company, Brasil.

COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA

O presente estudo foi aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal da FMVZ-UNESP de acordo com os princípios Éticos na Experimentação Animal (COBEA), protocolo número 005/2005 - CEEA.

Recebido para publicação 10.04.08

Aprovado em 04.11.08

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Mar 2009
• Data do Fascículo
  Jul 2009

Histórico

• Aceito
  04 Nov 2008
• Recebido
  10 Abr 2008