Viabilidade de Escherichia coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC não-O157) produtoras de toxina Shiga em queijo minas frescal

Viability of Escherichia coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC non-O157) Shiga toxin-producing in minas frescal cheese

Resumos

A existência de um reservatório animal é de grande importância na transmissão de Escherichia coli, produtora de toxina shiga (STEC) aos humanos. Epidemiologicamente, o sorotipo O157:H7 tem sido o mais envolvido em surtos de doença humana causada por STEC, porém surtos envolvendo STEC não pertencentes ao sorogrupo O157 (STEC não-O157) têm sido descritos. Inúmeros trabalhos constatam uma elevada ocorrência destes microrganismos em fezes de bovinos no Brasil, entretanto, pouco se sabe sobre a transmissão destes aos produtos de origem animal em nosso país. Neste trabalho, foi avaliada a viabilidade de E.coli O153:H25; O113:H21 e O111:H8 em Queijo Minas Frescal (QMF), produzido com inóculos de STEC não O157: H7 e armazenados a 8ºC. Realizaram-se contagens de E. coli e psicrotróficos totais após o processamento do queijo e com intervalos de sete e quinze dias. Foi observado aumento nas contagens de E. coli STEC não O157: H7 e psicrotróficos totais logo após o processamento do QMF, bem como durante o armazenamento a 8ºC, temperatura máxima recomendada pela legislação brasileira. Demonstra-se que, caso haja contaminação da matéria-prima com STEC não O157: H7 (deste estudo), o processamento do QMF não elimina os microrganismos e a temperatura máxima recomendada pela legislação não inibe a multiplicação bacteriana, mantendo-se o risco à população. Reforça-se, portanto, a atenção à qualidade da matéria-prima, das ferramentas de qualidade no campo e na indústria de alimentos para garantir a inocuidade do produto final

STEC não-O157; queijo minas frescal; toxina shiga

The existence of an animal reservoir is of great importance in the transmission of shiga toxin-producing E. coli (STEC) to humans. Epidemiologically serotype O157:H7 has been the most involved in human disease outbreaks caused by STEC, however STEC not belonging to serogroup O157 (STEC non-O157) have been described in outbreaks. Studies have revealed a risk in occurrence of these organisms in feces of cattle in Brazil, but little is known about the transmission to animal's products origin in our country. This study evaluated the viability of E. coli O153:H25, O113:H21 and O111:H8 in Minas Frescal Cheese (MFC), produced with non- STEC O157:H7 and stored at 8ºC. Counts of E. coli and total psychrotrophic were performed after processing and at intervals seven and fifteen days. There were an increase in the counts of E. coli and total psychrotrophic just after MFC processing as well as during storage at 8°C. The results demonstrated that, if the raw material (milk) is contaminated with STEC non O157:H7 (this study), the MFC processing does not eliminate the microorganisms and the maximum temperature recommended does not eliminate bacterial growth, keeping the risk to the population. The results reinforces, the attention to the quality of the raw material, the quality tools in the field and in the food industry to ensure the safety of final products

(STEC non-O157); minas frescal cheese; shiga toxin-producing

INTRODUÇÃO:

A existência de um reservatório animal é de capital importância na transmissão de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) aos humanos (PEARCE et al., 2004). Embora alguns trabalhos constatem uma elevada ocorrência de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) em bovinos no Brasil (CERQUEIRA et al. 1997; 1999; GONZALEZ, 2003; TRISTÃO, 2007), pouco se sabe sobre a transmissão por produtos de origem animal em nosso país, como carne, leite e seus derivados.

Epidemiologicamente, o sorotipo O157:H7 tem sido o mais envolvido em surtos de doença humana causada por STEC (KARMALI, 1989; TARR, 1995; PATON & PATON, 1998). Contudo, surtos envolvendo STEC não pertencentes ao sorogrupo O157 (STEC não-O157) têm sido descritos. Infecções envolvendo STEC não-O157 vêm sendo relatadas em vários países e mais de 50 sorotipos destas STEC têm sido isolados de humanos com colite hemorrágica e Síndrome hemolítica urêmica (SHU) (JOHNSON et al., 1996; CAPRIOLI et al., 2005 LEOTTA et al., 2008).

Algumas estimativas sugerem que STEC não-O157 sejam responsáveis por 25% dos casos de SHU nos EUA (JOHNSON et al., 1996). Em países como Chile (OJEDA et al., 1995), Argentina (LOPEZ et al., 1989) e Austrália (GOLDWATER & BETTELHEIM, 1994), STEC não-O157 são responsáveis pela maioria dos casos de SHU. Cepas STEC não-O157 têm sido frequentemente isoladas de pacientes com diarreia não-sanguinolenta (PIERARD et al., 1990; BROOKS et al.,2005). Na literatura, já foram reportados isolamentos de STEC não- O157 em produtos de origem animal em diversos países (BOSILEVAC & KOOHMARAIE, 2011; FARROKH et al., 2013; MOHAMMED et al., 2014).

Entre os derivados do leite, o queijo é um dos principais produtos, tendo, ademais, alta demanda de consumo. O queijo minas frescal encontra-se entre os queijos mais consumidos no Brasil (LIMA FILHO, 2010).

Diante do exposto, o presente trabalho visa a avaliar a viabilidade de Escherichia coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC não-O157) em queijo minas frescal.

MATERIAL E MÉTODOS:

As cepas utilizadas no presente trabalho foram E. coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC não-O157), isoladas de bovino no estado do Rio de Janeiro (GONZALEZ, 2003). A identificação destes microrganismos foi confirmada através de testes bioquímicos e morfológicos. Inóculos de 10³ e 10⁵ células ml^-1 de cada cepa foram adicionados separadamente em leite do tipo B pasteurizado, utilizado no processamento dos queijos minas frescal. Ao leite aquecido a 35°C, adicionaram-se 200ppm de CaCl₂, e 0,0625g L^-1 de coalho Halamix (Chr. Hansen A/S). Uma vez obtido um coágulo firme, foi realizado o corte da massa, com consequente liberação de soro. Procedeu-se à mexedura a 45°C por 15 minutos. A dessoragem foi realizada manualmente, com o auxílio de peneiras. A salga foi realizada através da adição de sal (2,1%), diretamente na massa do queijo, após a etapa de dessoragem. Após o preparo, estes foram armazenados a 8°C (FURTADO, 2005). Os leites utilizados como matéria-prima e os queijos não inoculados foram submetidos a análises para verificação de algumas características físico-químicas, como pH, acidez e umidade e dos padrões microbiológicos de Salmonella sp, Estafilococos coagulase positiva, Coliformes termotolerantes e Listeria spp, descritos na Resolução RDC n^o 12, de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001), complementado com análises de psicrotróficos totais. Também foi realizada a pesquisa de E. coli O157:H7 no leite (ZADIK et al., 1993), a fim de garantir a ausência deste microrganismo na matéria-prima.

Os queijos foram mantidos a 8°C e analisados quanto à recuperação de células viáveis de E.coli (KORNACKI; JOHNSON, 2001), assim como contagem de psicrotróficos totais (COUSIN et al., 2001) nos tempos de 0 (após o processamento), 7 e 15 dias. Todos os experimentos foram realizados em três repetições independentes, em duplicata.

Após a contagem e isolamento de E.coli dos queijos inoculados, realizou-se pesquisa por Polymerase Chain Reaction (PCR) dos genes produtores de toxina shiga (stx1 e stx2) (GONZALEZ, 2003).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

De acordo com os resultados físico-químicos e microbiológicas obtidos do leite tipo B pasteurizado, a matéria-prima foi considerada em conformidade com os parâmetros legais e de literatura, sendo própria para a elaboração dos queijos. Não foi detectado coliforme a 45ºC e E. coli O157:H7 nas amostras de leite, assegurando que os microrganismos enumerados no experimento não foram oriundos da matéria-prima utilizada. As análises físico químicas dos queijos não inoculados apresentaram valores médios de umidade 58%, pH 6,6 e acidez 0,11%. Os valores de umidade, pH e acidez estavam em conformidade com os padrões oficiais de queijo Minas Frescal (BRASIL, 1996, BRASIL, 2006). Não foram observadas contagens de E. coli e a contagem de psicrotróficos variou de 3,6 x 10⁴ UFCg^-1 a 5,0x10⁵ UFC g^-1.

Os leites inoculados com a cepa O153: H25 a 10³UFC ml^-1 apresentaram contagem média de 3,8x10⁴ UFC g^-1 após a produção do queijo e 5,4x 10⁵UFC g^-1 de psicrotróficos. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 6,5x10⁶UFC g^-1 e 1,9x10⁷UFC g^-1 para E.coli e de 2,7x10⁷UFC g^-1 e 2,2x10⁹UFC g^-1 para psicrotróficos, respectivamente (Figura 1).

Figura 1
: Contagens de STEC não O157 em queijo minas frescal, preparado após inoculação de 10³UFC ml^-1 dos microorganismos em leite.

Já os leites inoculado a 10⁵ apresentaram contagem média de 9,8x10⁶ após a produção do queijo e 4,0x10⁶UFC g^-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 1,9x10⁷ e 2,2x10⁷UFC g^-1 para E. coli e de 2,2x10⁹ e 3,6x10⁹ UFC g^-1 para psicrotróficos totais, respectivamente (Figura 2).

Figura 2: Contagens de STEC não O157 em queijo minas frescal, preparado após inoculação de 10⁵UFC ml^-1 dos microorganismos em leite.

Os leites inoculados com a cepa O113:H21 à 10³ apresentaram contagem média de 9,5x10⁴UFC g^-1 de E. coli após a produção do queijo e de 2,2x10⁶UFC g^-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram de 7,5x10⁷ e 6,4x10⁷UFC g^-1 para E. coli e de 7,4x10⁸ e 6,1x10⁸UFC g^-1 psicrotróficos totais, respectivamente. Os leites inoculados a 10⁵ desta cepa apresentaram contagem média de 5,7x10⁶UFC g^-1 após a produção do queijo e 6,6x10⁶UFC g^-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as contagens médias foram de 5,5x10⁷UFC g^-1 e 9,2x10⁷UFC g^-1 para E. coli e de 7,6x10⁸UFC g^-1 e 1,1x10⁹UFC g^-1 para psicrotróficos, respectivamente.

Os leites inoculados com a cepa O111:H8 a 10³ apresentaram contagem média de 7,6x10⁴ UFC g^-1 de E. coli após a produção do queijo e de 2,5x10⁴ UFC g^-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 1,5x10⁷ e 1,2x10⁹UFC g^-1 para E. coli e de 1,8x10⁸UFC g e 3,6x10¹⁰ UFC g^-1 para psicrotróficos totais, respectivamente. Os leites inoculados a 10⁵ apresentaram contagem média de 1,2x10⁶UFC g^-1 após a produção do queijo e 4,1x10⁴UFC g^-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 1,7x10⁷UFC g^-1 e 2,5x10⁹UFC g^-1 para E. coli e de 1,0x10⁸UFC g^-1 e 3,1 x 10¹⁰ para psicrotróficos totais, respectivamente. Todos os isolados selecionados foram positivos para os genes produtores de toxina.

São escassos os relatos na literatura sobre o comportamento de STEC não-O157 sob condições que controlam o desenvolvimento microbiano em alimentos, apesar de terem sido relatadas como importante agente etiológico de doenças em humanos, em algumas regiões do mundo (PATON & PATON, 1998; BRETT et al., 2003). No Brasil, esse sorotipo tem sido isolado com considerável frequência em fezes bovinas (GONZALEZ, 2003; IRINO, 2005).

Em relação a E.coli, o aumento na contagem logo após o processamento do queijo demonstra que temperaturas de processamento do QMF (35° e 42°C) favorecem a atividade microbiana durante o tempo de processamento. Durante o tempo de armazenamento, houve aumento da produção microbiana mesmo a 8°C, temperatura máxima recomendada pela legislação brasileira (BRASIL,1997), portanto a temperatura de 8ºC, para o armazenamento do produto, não foi suficiente para inibir a multiplicação da cepa do presente estudo. A temperatura de armazenamento é um ponto crítico para a segurança do produto, assim como a higiene de toda cadeia produtiva do QMF, já que este caracteriza-se por ser um produto de alta umidade, a ser consumido fresco. Testes preliminares realizados, em meio de cultivo TSB, com o microrganismo em questão à temperatura de 4°C, pH 5,5 e pH 7,0 demonstraram que, apesar de ter células viáveis, houve uma redução da contagem microbiana em relação ao inoculo de até dois ciclos logarítmicos em 7 e 15 dias, sinalizando, portanto, que trabalhos futuros devem ser realizados em QMF para verificar limites seguros de temperatura, podendo levar à revisão dos limites máximos de temperatura recomendados pela legislação.

CONCLUSÃO:

Demonstra-se que, caso haja contaminação da matéria-prima com STEC não O157 (deste estudo), o processamento do QMF não elimina os microrganismos e a temperatura máxima recomendada pela legislação não inibe ou elimina o crescimento bacteriano, mantendo-se o risco à população. Reforça-se, portanto, a atenção à qualidade da matéria-prima, das ferramentas de qualidade no campo e na indústria de alimentos para garantir a inocuidade do produto final.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan 2015