Estudo comparativo de técnicas de demonstração de amastigotas e isolamento de promastigotas no diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana

Resumos

BACKGROUND: PCR is a highly sensitive procedure for the diagnosis of LTA, but it is expensive and not readily available. Culture and smearing are practical, but they lack sensitivity. OBJECTIVE: The objective of this work is to compare the latter two methods in order to achieve a higher sensitivity at a lower cost. METHOD: Three culture media were compared in the process of isolating leishmaniasis: blood Agar Difco + Schneider + 20% fetal calf serum; Difco + Schneider + human sterile urine (2%); Schneider with sterile human urine (2%). Moreover, two techniques were compared for the demonstration of amastigotes: biopsy performed with smears, or matchstick scrapping RESULTS: The positivity and contamination indices (29-to-33% and 8-to-11%, respectively, p>0.05) were similar when comparing the cultures. The smears carried out by biopsy or the matchstick scrapping procedure had no significant differences (14 and 19%, respectively, p>0.05). Leishmania (Viannia) braziliensis predominated. CONCLUSION: In Brazil, urine may substitute fetal calf serum. The cost-to-benefit ratio is advantageous. Urine has no cost, while the market value of 500 ml of fetal calf serum is $US 185.

Diagnosis; Leishmania braziliensis; Leishmaniasis; cutaneous

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Estudo comparativo de técnicas de demonstração de amastigotas e isolamento de promastigotas no diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana^*

Raimunda Nonata Ribeiro Sampaio^I; Gilberto Brown de Andrade^II; Antonio César Pereira^III; Eurico Aparecido da Silva^VI; César Augusto Cuba Cuba^V

^IProfessora Adjunta de Dermatologia, Coordenadora do Laboratório de Dermatomicologia, Chefe do Serviço de Dermatologia do Hospital Universitário de Brasília (HUB)-Universidade de Brasília (UnB)

^IIMédico residente da Clínica Médica do Hospital Distrital de Brasília, ex-aluno da UnB

^IIIMédico, ex-aluno da UnB

^VIMédico, ex-aluno da UnB

^VProfessor Titular de Parasitologia, Coordenador do Laboratório de Parasitologia da UnB

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTOS: O PCR tem alta sensibilidade no diagnóstico da LTA, mas é caro e distante da prática. A cultura e o esfregaço são práticos, mas pouco sensíveis.

OBJETIVO: O objetivo deste trabalho foi comparar os dois últimos métodos, buscando maior sensibilidade e menor custo.

MÉTODOS:Foram comparados três meios de cultura no isolamento de leishmânia: Difco agar sangue + Schneider + soro bovino fetal (20%); Difco agar sangue + Schneider + urina humana (2%); Schneider + urina humana (2%). Foram comparadas, também, duas técnicas de pesquisa de amastigotas: esfregaço realizado com biópsia, ou raspado através de palito (matchstick).

RESULTADOS: Os índices de positividade e contaminação (29 a 33% e 8 a 11%, respectivamente, p>0.05) foram semelhantes na comparação dos cultivos. Os esfregaços com biópsia, ou palito também não tiveram diferenças significativas (14 e 19%, respectivamente, p> 0,05). A Leishmania (Viannia) braziliensis predominou.

CONCLUSÃO: No Brasil, a urina pode substituir o soro fetal bovino. Há vantagem na relação custo/benefício. A urina não tem custo enquanto 500ml de soro bovino fetal custa 185 dólares.

Palavras-chave: Diagnóstico; Leishmania braziliensis; Leishmaniose cutânea.

INTRODUÇÃO

O diagnóstico laboratorial da leishmaniose tegumentar americana pode ser realizado mediante exames parasitológicos, provas imunológicas e métodos da biologia molecular. Nos exames parasitológicos busca-se a evidenciação do parasito por meio de exames direto e indireto com a finalidade de confirmar a causa da doença.

Dois métodos parasitológicos importantes são o esfregaço em lâmina, utilizando fragmento de tecido obtido por biópsia ou por raspado da lesão,¹ e o crescimento de Leishmania em cultura obtida pela inoculação do material retirado da punção aspirativa da lesão ou da biópsia triturada. Ambos os métodos têm baixos percentuais de achado de parasito principalmente em se tratando de Leishmania (Viannia) braziliensis.^2,3,4 Os exames de demonstração de parasito por esfregaços são importantes porque são facilmente realizados e podem fornecer o diagnóstico com rapidez se observada a correta preparação da lâmina. Há mais sucesso no achado do parasito em cultura do que no esfregaço. A pesquisa parasitológica por inoculação em hamster, apesar de ser mais sensível, é lenta e onerosa. Realizar três aspirados em diferentes locais da lesão aumenta a sensibilidade do isolamento das promastigotas em culturas das lesões cutâneas.^2,3

Howard e colaboradores demonstraram que a urina humana estimula a divisão celular in vitro de Leishmania, podendo facilitar o cultivo primário de células infectadas.⁵ Armstrong e colaboradores relataram que a urina humana estéril adicionada ao meio de cultura também estimula a divisão celular de formas promastigotas e facilita o cultivo primário de células infectadas de tecido animal, podendo substituir o soro fetal bovino nos meios de cultura.⁶ Foram usadas, em ambos casos, cepas já identificadas e mantidas em criopreservação.

O objetivo deste estudo foi verificar se a urina humana estéril, adicionada ao meio Difco e Scheneider, seria mais eficiente ou poderia substituir o soro bovino fetal em cultivos de espécies de Leishmanias existentes no país, bem como se as técnicas de esfregaço, com coleta do material por biópsia ou matchstick, poderiam ter sensibilidades diferentes.

PACIENTES E MÉTODOS

Foram selecionados 21 doentes portadores de lesões cutâneas de LTA atendidos em ambulatório especializado dessa enfermidade no Hospital Universitário de Brasília (HUB), Universidade de Brasília. Todos os pacientes foram submetidos à reação de Montenegro, pesquisa indireta de anticorpos fluorescentes, exame histopatológico e posterior tratamento das lesões da pele. Haviam sido previamente esclarecidos a respeito do trabalho para o qual deram seu consentimento. Foram incluídos os pacientes com lesão da pele compatível com LTA e que tivessem, além da intradermorreação de Montenegro positiva, pelo menos outro exame específico positivo: esfregaço, cultura, IFI ou exame histopatológico. A assepsia das lesões foi realizada com soro fisiológico a 0,9%, álcool iodado e álcool a 95o, nessa seqüência. Os locais dos aspirados e biópsias foram anestesiados com lidocaína a 2% contendo adrenalina, excetuando-se esta última quando se tratava de extremidades. Com seringa munida de agulha de 25 x 8mm, contendo 0,5ml de solução salina com gentamicina (100mcg/ml), introduzida sob leve pressão na borda de superfície íntegra e infiltrada da lesão, o material foi aspirado e inoculado nos tubos de cultura.

Foram usados meios de cultura com três composições diferentes: 1. Difco ágar-sangue complementado com 0,5ml de Schneider (20% de soro bovino fetal) como sobrenadante (D+S+SB); 2. meio similar ao anterior acrescido de urina humana estéril (U) em concentração de 2% filtrada em milipore bacteriológico com filtro de 0,45m (D+S+SB+U); 3. meio contendo Schneider (sem soro bovino fetal) suplementado com U a 5% (S+U). Todos os meios foram acrescidos de gentamicina na concentração de 100mcg/ml. Foram realizados quatro aspirados em cada lesão e inoculados aleatoriamente em três tubos contendo o meio D+S+SB, três com D+S+SB+U e dois contendo S+U. Os meios de cultura, depois de inoculados, foram incubados a 23 ºC +/-1 ºC e examinados semanalmente com microscópio de luz invertida, durante 30 dias, após os quais foram desprezados os tubos negativos.

Na técnica para demonstração de amastigotas, a biópsia foi realizada na borda infiltrada e com superfície íntegra da lesão, utilizando-se punch de 4mm de diâmetro, e o fragmento foi comprimido sobre duas lâminas, depois da retirada do excesso do sangue em papel de filtro. As lâminas permaneceram durante período que variou de dois a três minutos em temperatura ambiente para secar e, em seguida, foram fixadas com álcool metílico (metanol) por quatro minutos e coradas pelo Giemsa e, posteriormente, examinadas sob óleo de imersão à microscopia ótica (x100) por 15 minutos.

Na margem interna da mesma lesão foi feita escarificação com um palito de madeira, extremidade em bizel matchstich, previamente autoclavado. O material coletado foi espalhado sobre duas lâminas para cada paciente, submetidas à mesma seqüência já descrita para a coleta do material para as culturas. O método estatístico utilizado foi o teste do Qui-quadrado para análise em tabelas do tipo 2x2, para verificação de diferença entre grupos.

RESULTADOS

Dos casos estudados 77% tinham de zero a quatro meses de evolução, 19%, de cinco a oito meses, e 4% acima de oito meses de evolução da doença.

As técnicas de isolamento de promastigotas nos três meios apresentaram índices de positividade e contaminação semelhantes (29 a 33% e 8 a 11%, respectivamente) (Tabela 1). As técnicas para demonstração de amastigotas entre o esfregaço realizado por biópsia realizada com punch e a técnica realizada com palito matchstick também tiveram índices de positividade semelhantes (14 e 19%, respectivamente). Comparados os resultados dos vários meios de cultura, assim como os resultados da pesquisa de amastigotas, pelo teste do Qui-quadrado, as diferenças não foram significantes.

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

A verificação da presença do parasito na lesão suspeita de LTA é o que confirma esse diagnóstico. Com as técnicas disponíveis na prática usual, entretanto, o sucesso no achado de Leishmania é representado por baixos percentuais (para pesquisa no esfregaço 18% a 52%).^1,7 O achado do parasito torna-se ainda mais difícil nos casos em que o agente etiológico é a Leishmania (Viannia) braziliensis, bem como se a lesão for da mucosa.⁴ Torna-se praticamente impossível achá-lo nas formas cutânea verrucosa e mucosa crônica, com pouca atividade da doença.

Hoje, há métodos de biologia molecular, como o PCR, dotados de grande sensibilidade no diagnóstico da LTA.⁸ Essa técnica, entretanto, necessita de equipe especializada, infra-estrutura adequada, tornando pouco prática e também onerosa sua execução, estando ainda distante de entrar na prática diária. Os autores acreditam, portanto, ser de importância procurar, hoje, dentro da realidade do país, aperfeiçoar os métodos disponíveis em todos os níveis de saúde que permitam direcionar a terapêutica e melhorar o prognóstico da doença.

No HUB, onde estes casos foram estudados, os pacientes procedem predominantemente dos estados de Goiás, Minas Gerais, Bahia e Distrito Federal. A maioria dos casos do referido hospital é de L (V) braziliensis, vindo depois L (L) amazonensis e, raramente, outras espécies, como L(V) shawi,^9,10 constituindo um bom modelo para testar as espécies que aqui predominam. A preponderância de L (V) braziliensis justifica os baixos índices de achado de Leishmania nos resultados, e, quanto aos índices de contaminação, foram aceitáveis no cultivo em todos os meios empregados.

Como referido, outros autores já haviam comprovado a eficácia da urina humana no crescimento de amastigotas em cultivo de células e de promastigotas mantidas em laboratório, oriundas de países orientais ou de procedência desconhecida. No trabalho aqui relatado os cultivos foram realizados com material colhido do doente e avaliados em espécies que predominam ou existentes no país, como a (L(V) braziliensis, L(L) amazonensis e L(V) shawi), levando os autores a concluir que a urina humana pode substituir o soro fetal bovino, também no Brasil. Essa é uma alternativa vantajosa quando se analisa a relação custo/benefício. Um frasco de 500ml de soro fetal bovino custa, em média, 185 dólares, enquanto a urina humana não tem nenhum custo.

Recebido em 5.07.2001.

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 16.04.2002.

* Trabalho realizado no Serviço de Dermatologia do HUB; Laboratório de Dermatomicologia e Laboratório de Parasitologia da UnB

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Maio 2006
• Data do Fascículo
  Out 2002

Histórico

• Aceito
  16 Abr 2002
• Recebido
  05 Jul 2001