O desmame precoce afeta o ganho de peso e a composição corporal em camundongos adultos?

Does early weaning influence weight gain and body composition in adult mice?

ORIGINAL ORIGINAL

O desmame precoce afeta o ganho de peso e a composição corporal em camundongos adultos?

Does early weaning influence weight gain and body composition in adult mice?

Marcelo Macedo Rogero; Maria Carolina Borges; Ivanir Santana de Oliveira Pires; Julio Tirapegui

Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental, Laboratório de Bioquímica da Nutrição. Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 14, 05508-900, São Paulo, SP, Brasil. Correspondência para/Correspondence to: J. TIRAPEGUI. E-mail: <[e-mail]>

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar o efeito do desmame precoce sobre o ganho de peso e a composição corporal de camundongos adultos jovens.

MÉTODOS: Camundongos Swiss Webster, machos, foram desmamados precocemente (14º dia de vida) ou amamentados até o 21º dia de vida (grupo controle). Após o desmame, os animais foram alimentados com ração elaborada para roedores em crescimento até o 63º dia de vida, quando então foram sacrificados.

RESULTADOS: O peso corporal dos animais do grupo desmamado de forma precoce foi significantemente maior no 28º, 35º e no 63º dias de vida em relação ao grupo controle (p<0,05). Porém, o consumo de ração não diferiu entre os grupos. A concentração sérica de proteínas totais, albumina e ferro, bem como a concentração hepática, muscular e cerebral de proteínas, ácido desoxirribonucléico e a relação proteína/ácido ribonucléico, não diferiram significantemente entre os grupos. O grupo desmamado precocemente apresentou maior quantidade absoluta de massa magra, lipídeos, proteínas e cinzas, em comparação ao grupo controle (p<0,05). A quantidade relativa de umidade, lipídeos, massa magra, proteínas e cinzas não diferiu entre os grupos.

CONCLUSÃO: O desmame precoce, associado à ingestão de ração elaborada para roedores em crescimento, resultou em aumento do ganho de peso, porém não afetou a composição corporal de camundongos adultos.

Termos de indexação: Aleitamento materno. Camundongos. Composição corporal. Consumo alimentar. Desmame precoce.

ABSTRACT

OBJECTIVE: The objective of this study was to assess the effect of early weaning on weight gain and body composition of young adult mice.

METHODS: Swiss Webster male mice were weaned early, on the 14^th day of life, or breastfed until the 21^st day of life (control group). After weaning, the animals were fed a chow specifically made for growing rodents up to the 63^rd day of life, when they were sacrificed.

RESULTS: The body weight of the animals from the early-weaned group was significantly greater on the 28^th, 35^th, 63^rd days of life compared to those from the control group (p<0.05). Nevertheless, no significant difference in the food intake between the groups was observed. The concentration of serum total proteins, albumin and iron, as well as the concentration of protein, DNA and the protein/RNA ratio in the liver, muscle and brain, did not differ between the groups..The early-weaned group showed an increased absolute quantity of lean mass, lipids, protein and ash compared with the control group (p<0.05). The relative quantity of water, lipids, lean mass, protein and ash did not differ between the groups.

CONCLUSION: Early weaning, associated with the consumption of a chow specifically made for growing rodents, led to an increase in weight gain, but did not influence body composition in adult mice.

Indexing terms: Breastffeeding. Mice. Body composition. Food consumption. Weaning.

INTRODUÇÃO

A obesidade é considerada um problema de saúde pública em países desenvolvidos e em alguns países em desenvolvimento^1,2. Crianças e adolescentes com excesso de peso têm maior risco de apresentar sobrepeso e obesidade na idade adulta, independentemente da presença de obesidade nos pais^3,4. Aliado a isso, esses indivíduos, quando adultos, são mais suscetíveis a desenvolver doenças crônicas não transmissíveis, a exemplo das enfermidades cardiovasculares⁵. Uma vez que intervenções direcionadas à redução de peso para essa população não são satisfatoriamente efetivas, a identificação de estratégias visando à prevenção do excesso de peso na infância e na adolescência é de extrema importância na diminuição, a longo prazo, da incidência de doenças crônicas não transmissíveis^6,7.

Conjuntamente ao impacto da amamentação sobre o estado nutricional e sobre a imunocompetência de roedores e de seres humanos^8-12, há evidências de um possível papel do aleitamento materno na prevenção do sobrepeso e da obesidade na infância e na adolescência. Nesse contexto, bebês amamentados têm maior capacidade de autorregulação da ingestão energética em relação a bebês que recebem alimentação complementar precocemente^13,14. Além disso, neonatos alimentados artificialmente apresentam picos maiores e mais prolongados de secreção de insulina no período pós-prandial em relação a bebês amamentados, o que, possivelmente, ocasiona maior estímulo à deposição de proteínas e de lipídeos, influenciando na composição corporal dessa população^15-17.

Cabe ainda destacar que o leite materno contém hormônios e fatores de crescimento, como a leptina e o Fator de Crescimento Epidermal (EGF), os quais podem influenciar na adiposidade por meio da diminuição da ingestão alimentar e do aumento do gasto energético e pela inibição da diferenciação de adipócitos e da redução do acúmulo de lipídeos nessas células, respectivamente^18-20. Desse modo, o desmame precoce e a consequente privação desses compostos presentes no leite materno podem ter influência sobre o risco de desenvolver obesidade na idade adulta^21-25.

Apesar de o efeito protetor do aleitamento materno em relação à adiposidade ser biologicamente plausível, os resultados obtidos em estudos epidemiológicos são inconsistentes. Alguns estudos concluem que o aleitamento materno protege contra o sobrepeso e a obesidade na infância e na adolescência^26-29, ao passo que outros não encontraram associação entre essas variáveis^30-32. Somam-se a esse fato a escassez de estudos longitudinais, bem como a dificuldade de estabelecer uma relação causal entre o aleitamento materno e a obesidade, visto que diversos são os fatores de confusão que interferem nessa associação, dentre os quais se destacam os aspectos socioeconômicos^33-35.

Em virtude da ampla diversidade de fatores que permeiam a relação entre aleitamento materno, crescimento e ganho de peso, estudos observacionais que investigam os benefícios do aleitamento materno apresentam muitos problemas metodológicos. Idealmente, seriam necessários estudos randomizados para avaliar a relação entre desmame precoce e adiposidade. Não obstante, por razões éticas, este tipo de estudo é apenas realizado em animais³⁵. Ademais, a maior parte dos estudos que investigou a associação entre aleitamento materno e excesso de peso utilizou o Índice de Massa Corporal (IMC) para a idade como preditor de adiposidade. No entanto, uma vez que esse índice não diferencia a massa gorda e a massa magra, não está bem estabelecido o efeito da introdução precoce de alimentos complementares sobre a composição corporal desses indivíduos. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do desmame precoce sobre o ganho de peso e a composição corporal de camundongos adultos jovens.

MÉTODOS

Foram utilizados camundongos Swiss Webster, machos, desmamados no 14º e no 21º dias de vida, obtidos de colônias de produção e de experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e do Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos sob condições ambientais controladas, temperatura de 22°C, com variação de 2°C, umidade relativa de 55%, com variação de 10% e ciclo de iluminação 12h claro/12h escuro (luz acesa às 7h). Os animais foram pesados diariamente, sendo verificado o peso final dos mesmos imediatamente antes do sacrifício. O ganho de peso em relação ao início do protocolo experimental (14º dia de vida) foi calculado no 21º, 28º, 35º, 42º, 49º, 56º e 63º dias de vida, com base na fórmula: (peso (g)/peso inicial (g) – 1) * 100.

Os animais foram obtidos a partir do acasalamento de duas fêmeas, de dois meses de idade e primíparas, com um macho. Após a constatação da prenhez, as fêmeas foram mantidas em gaiolas individuais durante todo o período de gestação. Após o nascimento dos filhotes, fez-se a sexagem dos neonatos para oito camundongos machos, que foram mantidos com a mãe durante o período de 14 ou de 21 dias de vida. De modo a igualar a ingestão de leite entre os filhotes, foram colocados sempre oito animais com cada mãe. Os animais amamentados até o 21º dia de vida, período regular de Amamentação (AMAM) de camundongos, foram considerados como grupo controle, ao passo que os camundongos Desmamados (DESM) no 14º dia de vida constituíram o grupo desmamado precocemente. Cabe destacar que os filhotes não tinham acesso à ração materna.

No momento do desmame (14º ou 21º dia de vida), os animais foram cuidadosamente retirados da gaiola na qual estava a mãe, e transferidos para gaiolas que continham a ração. No momento da introdução dos animais na nova gaiola, eles foram posicionados próximos à ração, visando a facilitar o seu reconhecimento e o seu consumo. Além disso, foram utilizados comedouros com abertura lateral, o que facilitou o acesso à ração por esses animais. No período entre o desmame e o 63º dia de vida, os camundongos foram alimentados ad libitum com água e com ração elaborada para roedores em crescimento, de acordo com o American Institute of Nutrition³⁶.

No 63º dia de vida, os animais foram previamente anestesiados com cloridrato de quetamina (50mg/kg de massa corporal) associado ao cloridrato de xilazina (50mg/kg de massa corporal), por via intraperitonial, e só então sacrificados. O sacrifício foi realizado no período da manhã, entre 8 e 12 horas. O sangue foi coletado do plexo axilar para a obtenção do soro, a partir do qual foram determinadas as concentrações de proteínas totais, de albumina e de ferro. Posteriormente à coleta do sangue, o músculo gastrocnêmio, o fígado e o cérebro foram dissecados e imediatamente pesados e congelados a - 80°C, para posterior determinação da concentração de proteína, de RNA (ácido ribonucléico) e de DNA (ácido desoxirribonucléico). A partir da carcaça dos animais, foi realizada a análise da sua composição química, ou seja, a quantificação de umidade, de proteínas, de lipídeos e de cinzas.

O cálculo do tamanho da amostra a ser utilizada foi efetuado com base em critério estatístico, sendo utilizados: a) 8 animais para a determinação dos parâmetros séricos e para a determinação da concentração tecidual de proteína, RNA e DNA; b) 13 animais para composição corporal; c) e 15 animais para os dados de peso corporal e de consumo de ração³⁷. Todos os procedimentos realizados com os camundongos foram aprovados pelo Comitê de Ética sobre experimentação com animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

A concentração sérica de ferro e de albumina foi determinada segundo descrito por Goodwin et al.³⁸ e Doumas³⁹, respectivamente. A concentração sérica de proteínas totais foi dosada por método colorimétrico, utilizando-se kit comercial (CELM, São Paulo, Brasil). Em relação aos parâmetros teciduais, a concentração de proteína no fígado, no músculo gastrocnêmio e no cérebro foi determinada em consonância com a metodologia descrita por Lowry et al.⁴⁰. A determinação da concentração de RNA e de DNA desses tecidos foi realizada de acordo com o descrito por Munro & Fleck⁴¹ e por Gendimenico et al.⁴², respectivamente. O conteúdo de umidade, de lipídeos, de proteínas e de cinzas presentes na carcaça dos camundongos foi determinado segundo o descrito por Donato et al.⁴³.

Os dados foram expressos como Média e Desvio-padrão (DP). Os resultados obtidos entre os grupos controle (AMAM) e o grupo desmamado precocemente (DESM) foram previamente analisados quanto à normalidade e submetidos ao Teste t para variáveis independentes, adotando-se um valor de alfa de 0,05. Todos os cálculos foram realizados com auxílio do programa GraphPad Prism versão 4.0.

RESULTADOS

O peso dos animais ao nascimento não diferiu significantemente entre os grupos DESM (1,55, DP= 0,31 g) e AMAM (1,55, DP= 0,27 g). No entanto, o peso corporal, bem como o percentual de ganho de peso dos animais do grupo DESM, foi significantemente maior no 28º, 35º e 63º dias de vida em relação ao grupo AMAM (Figuras 1 e 2). O consumo de ração absoluto e relativo não diferiu entre os grupos no período compreendido entre o 21º e o 63º dias de vida (Figuras 3 e 4). A concentração sérica de ferro, de albumina e de proteínas totais não diferiu entre os grupos. Também não foi observada diferença significante entre os grupos em relação à concentração de proteína e de DNA e à razão proteína/RNA no fígado, no músculo gastrocnêmio e no cérebro.

No que concerne à composição química da carcaça, o grupo DESM apresentou aumento significante da quantidade absoluta de massa magra, de lipídeos, de proteína e de cinzas (Figura 5). Contudo, não foi observada diferença significante na quantidade relativa de massa magra, de umidade, de lipídeos, de proteína e de cinzas entre os grupos experimentais.

DISCUSSÃO

Este estudo avaliou o efeito do desmame precoce a partir do 14º dia de vida dos animais, sendo que o período total de amamentação de camundongos é de 21 dias. A escolha da data de desmame foi devida ao fato de, em um estudo piloto, ter sido verificado que camundongos desmamados com idade inferior a 14 dias de vida apresentavam elevada taxa de mortalidade nos dois a três dias posteriores ao desmame. Essa observação está relacionada, em parte, ao fato de a abertura dos olhos de camundongos recém-nascidos ocorrer em torno do 10º-12º dia de vida, o que dificulta a realização de um protocolo experimental em que o animal deva livremente ingerir a ração ofertada⁴⁴. Sendo assim, foi avaliado neste estudo o efeito do desmame precoce em camundongos que foram desmamados após terem completado 2/3 do período de amamentação habitual.

Em relação aos parâmetros indicativos do estado nutricional (concentração sérica de albumina, de proteínas totais e de ferro; concentração hepática, muscular e cerebral de proteína e de DNA e razão proteína/RNA), não foi observada diferença entre os grupos, o que sugere que os animais do grupo DESM não apresentaram prejuízo no estado nutricional no 63º dia pós-natal. Isso, possivelmente, está relacionado ao fato de a ração oferecida ser especificamente elaborada para roedores em crescimento³⁶. Essa ração tem como fonte protéica a caseína e é acrescida de cisteína, aminoácido limitante da caseína, o que possibilitou a manutenção do estado nutricional protéico dos animais do grupo DESM, em comparação àquele observado em animais amamentados durante 21 dias. Contudo, é relevante destacar que as determinações bioquímicas foram realizadas em animais com 63 dias de vida, ou seja, somente 49 dias após o desmame, fato que pode ter sido responsável por não terem sido observadas alterações nos parâmetros relativos ao estado nutricional.

Apesar de não ter sido constatada diferença significante entre os grupos nos parâmetros indicativos do estado nutricional, os animais do grupo DESM apresentaram aumento do peso corporal e do ganho de peso em relação aos animais do grupo AMAM. Uma vez que o consumo de ração não diferiu entre os grupos, a diferença observada na massa corporal entre os animais amamentados e os animais desmamados precocemente pode ser atribuída à presença de fatores não nutricionais presentes no leite materno, a exemplo da leptina e do EGF, bem como a diferenças na resposta endócrina à alimentação (insulinemia pós-prandial)^15-25. Nesse contexto, Attig et al.²⁴ observaram que o tratamento com um antagonista da leptina entre o 2º e o 13º dia de vida resultou em um aumento significante do peso e da gordura corporal em ratos adultos. Aliado a isso, outro estudo demonstrou que a administração oral de doses fisiológicas de leptina durante o período de lactação (1º ao 20º dia de vida) preveniu o ganho de peso e a obesidade em ratos na idade adulta, mesmo quando esses animais foram submetidos à dieta hiperlipídica²⁵.

O aumento da quantidade absoluta de massa magra, de lipídeos, de cinzas e de proteínas no grupo DESM, em relação ao grupo AMAM ocorreu como consequência do aumento da massa corporal, uma vez que não foi observada diferença significante nas quantidades relativas de massa magra, de lipídeos, de cinzas e de proteínas. Desse modo, é possível inferir que o desmame precoce alterou o ganho de peso, porém não teve influência sobre a composição corporal dos animais. Ademais, o presente estudo foi realizado em camundongos adultos jovens e, portanto, faz-se necessário investigar se o efeito do desmame precoce sobre a massa corporal persiste em fases mais avançadas da idade adulta^21-25.

Uma vez que os resultados deste estudo indicam que, em camundongos, o desmame precoce resulta em aumento do peso corporal, o que é decorrente de um aumento não apenas da massa gorda, como também da massa magra, é possível que estes resultados reproduzam-se em seres humanos. Dessa forma, sugere-se que modelos antropométricos que avaliam separadamente massa gorda e massa magra sejam mais adequados para esclarecer o papel do aleitamento materno na redução do risco de sobrepeso e de obesidade. Além disso, destaca-se a necessidade de estudos que investiguem se os efeitos do desmame precoce sobre a massa corporal persistem na idade adulta.

CONCLUÇÃO

O desmame precoce, associado à ingestão de ração elaborada para roedores em crescimento, acarreta em aumento do ganho de peso de camundongos, porém não tem influência sobre sua composição corporal. Estes resultados indicam a necessidade de estudos futuros em humanos, que avaliem o efeito do desmame precoce sobre a composição corporal por meio da utilização de modelos antropométricos que diferenciem a massa gorda e a massa magra.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (processo 03/01606-8) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil.

COLABORADORES

M.M. ROGERO e M.C. BORGES participarm da concepção, do delineamento, da análise dos dados e da interpretação dos resultados deste estudo. I.S.O. PIRES participou da análise dos dados deste estudo. J. TIRAPEGUI participou da interpretação dos resultados deste estudo.

Recebido em: 3/6/2008

Versão final reapresentada em: 2/3/2009

Aprovado em: 16/6/2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Maio 2010
• Data do Fascículo
  Fev 2010

Histórico

• Recebido
  03 Jun 2008
• Aceito
  16 Jun 2009