Isolamento de Lactobacillusacidophilus a partir de fezes de bezerros

Isolation of Lactobacillusacidophilus from calves feces

Isolamento de Lactobacillusacidophilus a partir de fezes de bezerros¹

Isolation of Lactobacillusacidophilus from calves feces

Antônio Hamilton Chaves^I; José Fernando Coelho da Silva^II; Adão José Rezende Pinheiro^III; Oriel Fajardo de Campos^IV; Sebastião de Campos Valadares Filho^II

^I Professor da Escola Agrotécnica Federal de Uberaba, Uberaba-MG

^II Professor do DZO, UFV, Viçosa, MG, Bolsista do CNPq

^III Professor do DTA, UFV, Viçosa, MG, Bolsista do CNPq

^IV Pesquisador da EMBRAPA/CNPGL, Coronel Pacheco, MG

RESUMO

Este experimento foi realizado para isolar, caracterizar e identificar estirpes de Lactobacillusacidophilus, a partir de fezes de bezerros com 1 - 3 dias de idade, coletadas diretamente no reto. Os seguintes testes para caracterização dos isolados foram feitos: morfologia celular, teste de gram, catalase, produção de gás a partir da glicose, crescimento a 15 e 45ºC, redução do "Litmus milk", crescimento no meio com 4 e 8% de cloreto de sódio, hidrólise de arginina, redução do nitrato e fermentação de diferentes "carboidratos". De um total de 526 "isolados" iniciais, 12 (2,28%) estirpes de Lactobacillusacidophlilus foram identificadas.

Palavras-chave: bezerro, Lactobacillus acidophilus, probiótico

ABSTRACT

This work was carried out to isolate, characterize and identify Lactobacillusacidophilus strain from calves feces with 1- 3 days of age, collected directly from the rectum. The following tests for the characterization of the isolates were done: cellular morphology, gran test, catalase, gas production from glucose, growth at 15 and 45ºC, Litmus milk reduction, growth in culture medium with 4 and 8% sodium chloride, arginine hydrolysis, nitrate reduction and fermentation of several "carbohydrates". From a total of 526 initial isolates, 12 (2.28%) strain of Lactobacillusacidophillus were identified.

Key Words: calves, Lactobacillus acidophilus, probitics

Introdução

Acompanhando o avanço das técnicas de criação de animais domésticos, os probióticos estão sendo cada vez mais usados em todo o mundo, particularmente no Japão, onde estão presentes na maioria das rações. O crescimento da inquietação pública, quanto ao uso de antibióticos nas rações para animais e a seus possíveis problemas, toxicidade, alergias e principalmente como possíveis causadores do desenvolvimento da resistência de estirpes patogênicas, tem estimulado o interesse pelos probióticos como terapia alternativa.

Diversos microrganismos são usados como probióticos, sendo as bactérias lactobacilos e streptococos e os fungos, incluindo a levedura, Saccharomycescerevisiae e o Aspergillusoryzae, as mais usadas. Entre os lactobacilos, um dos mais indicados para o preparo de probióticos é o Lactobacillusacidophilus.

O uso terapêutico dos lactobacilos na prevenção ou cura de diversas desordens gastrintestinais é conhecido há muitos anos: leites fermentados como o iogurte, Koumiss e Kefir, foram usados na Europa muito antes de se falar em bactéria. Hoje se sabe que o Lactobacillusacidophilus produz, além de ácidos orgânicos e peróxido de hidrogênio, substâncias tipo antibióticos (bacteriocinas), que inibem o crescimento de várias bactérias, incluindo a Escherichia coli e Salmonella sp. - principais causadoras de desordens gastrintestinais em bezerros.

No presente trabalho, procurou-se isolar, caracterizar e identificar estirpes de Lactobacillusacidophilus, a partir de fezes de bezerros com 1 a 3 dias de idade, que possam ser usadas como probiótico.

Material e Métodos

O presente trabalho foi realizado nos laboratórios do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa (UFV). As amostras fecais foram coletadas em 10 fazendas das regiões de Coronel Pacheco e Viçosa, MG.

As amostras de fezes foram obtidas de 16 bezerros com 1 a 3 dias de idade. Após massagem retal, a evacuação foi colhida em recipientes esterilizados, mantidas em caixas de isopor com gelo e água, conduzidas ao laboratório e, em seguida, preparadas e diluídas na razão de 1:9 (25 gramas de fezes em 225 mL de solução tampão fosfato, pH 7,2).

As amostras devidamente diluídas foram plaqueadas "pour plate" (10^-5 a 10^-8) em duplicata no meio agar, seletivo para lactobacilos, desenvolvido por Rogosa - ROGOSA SL - (KANDLER e WEISS, 1986), sendo incubadas a 37ºC por 48 horas, em condições de microaerofilia, obtida com uma vela na jarra de incubação devidamente fechada (PELCZAR et al., 1981).

Após contagem total, com auxílio de um contador de colônias, as placas contendo colônias bem definidas foram selecionadas para realização do isolamento. Várias colônias foram isoladas e transferidas para tubos contendo o meio de cultura DE MAN, ROGOSA e SHARPE (MRS), desenvolvido por DE MAN et al. (1960), enriquecido com 0,15% de sais biliares (GILLILAND e SPECK, 1977). Procurou-se isolar colônias tipo X ou rugosa, pois as estirpes que formam estas colônias são de comprovado valor terapêutico (Prescott e Dunn, 1940, citados por SANTOS, 1984).

Após 48 horas de incubação a 37ºC, as culturas com crescimento evidenciado foram plaqueadas por estrias no agar Rogosa SL e incubadas, novamente, sob baixo teor de oxigênio, a 37ºC durante 48 horas, para posterior reisolamento. Nesta etapa, várias colônias (uma ou duas de cada placa) foram transferidas para tubos contendo leite desnatado reconstituído (LDR) com 12% de extrato seco desengordurado (ESD) esterilizado, sendo incubadas a 37ºC até coagulação. As culturas que coagularam o LDR foram reativadas no caldo MRS (DE MAN et al. 1960), a 37ºC durante 24 horas, sendo, posteriormente, submetidas ao teste de gram e às análises morfológicas. As culturas "impuras" foram novamente plaqueadas em estrias para novo reisolamento. As culturas puras, bastonetes gram-positivos, foram congeladas a -15ºC. Um tubo de cada isolado foi mantido em atividade, para continuidade aos testes necessários à caracterização e identificação.

Além da coloração de gram (PELCZAR et al., 1981), as culturas foram submetidas aos testes de catalase, produção de gás a partir da glicose, capacidade em coagular o leite a 15 e 45ºC, redução do "Litmus milk", crescimento em 4 e 8% de cloreto de sódio, hidrólise da arginina, redução do nitrato e fermentação de diferentes "carboidratos".

Para o teste da catalase, seguiu-se metodologia de SPECK (1984), sendo as culturas semeadas por meio de estrias no agar MRS inclinado. Após incubação, a 37ºC por 48 horas, realizou-se o teste adicionando sobre as colônias, 1 mL de peróxido de hidrogênio a 3,5%, observando-se a formação de bolhas, que caracterizam resultado positivo.

Para a avaliação da produção de gás a partir da glicose, as culturas foram inoculadas no caldo MRS modificado (contendo 5% de glicose e isento de extrato de carne) e incubadas a 37ºC por 48 horas, em tubos contendo em seu interior um tubo de Durhan, para verificar a produção de gás (COLLINS e HARTLEIN, 1982).

Na determinação da capacidade dos isolados em coagular o leite a 15 e 45ºC, estes foram previamente ativados em LDR (10% ESD), inoculados (1%) em tubos contendo 8 mL de LDR (10% ESD) esterilizado a 121ºC por 15 minutos e incubados a 15ºC por 30 dias e a 45ºC por 72 horas. O teste foi considerado positivo quando ocorreu coagulação do leite nos períodos indicados (KANDLER e WEISS, 1986).

No teste de redução do "Litmus milk" , os isolados foram inoculados (1%) no meio comercial "Litmus milk" (BBL), previamente esterilizado, e incubados a 37ºC por 48 horas. A redução do indicador foi confirmada pela mudança da coloração do meio de lilás para incolor (SKERMAN, 1959).

A capacidade de crescimento dos isolados a 4 e 8% de cloreto de sódio foi definida com o emprego de caldo MRS, adicionado destas concentrações de cloreto de sódio. Os isolados foram inoculados (1%) e incubados a 37ºC por 48 horas. Após esse período, a capacidade de crescimento foi avaliada comparando-se visualmente a turbidez dos meios inoculados com o controle, que continha inóculo e apenas 0,5% de cloreto de sódio (DAVIS, 1955).

Para o teste de hidrólise da arginina, as culturas previamente ativadas foram inoculadas no caldo descarboxilase base contendo 0,002% de púrpura de bromocresol como indicador, 0,5% de hidrocloreto de arginina e pH ajustado a 6,8 com solução diluída de hidróxido de sódio ou ácido lático (MIKOLAJCIK, 1964; COWAN e STEEL, 1965). Óleo mineral foi adicionado aos tubos, proporcionando ambiente anaeróbico necessário à reação. Utilizaram-se, como controle, tubos sem adição de arginina. Os isolados foram inoculados (1%) e incubados a 37ºC por 48 horas. Coloração violeta (após ocorrência da amarela) indicava resultados positivos e a amarela, resultados negativos (BIER,1985).

No teste de redução do nitrato, utilizou-se o caldo nitrato (Bacto) contendo 0,1% de nitrato de potássio. Adicionou-se, a este meio, caldo MRS na proporção de 1:1. O caldo nitrato não possuía todos os componentes requeridos para o crescimento dos lactobacilos. O pH foi ajustado a 6,8 com solução diluída de hidróxido de sódio ou ácido lático. As culturas foram inoculadas a 1% e incubadas a 37ºC por 48 horas em condições de microerofilia. A redução do nitrato foi definida com o aparecimento de coloração vermelha ou marrom, após adição do reativo de Griess-iIosva, conforme COLLINS (1969). A presença de nitrato residual no meio incolor foi indicada pelo aparecimento da cor vermelha, após adição de zinco em pó (NORRIS e RIBBONS, 1971).

O teste de fermentação de diferentes "carboidratos" foi realizado em duas etapas:

A - Na primeira etapa, empregou-se o caldo MRS modificado, omitindo-se o extrato de carne e a glicose e adicionando-se 0,002% de púrpura de bromocresol como indicador. Empregou-se 1% de cada "carboidrato" teste (arabinose, celobiose, esculina, frutose, galactose, glicose, manitol, maltose, manose, sacarose, salicina, sorbitol e xilose). Os "carboidratos" e o meio foram esterilizados isoladamente. As culturas foram incubadas a 37ºC por até sete dias. O aparecimento da cor amarela após incubação indicava resultados positivos (DAVIS, 1955; KANDLER e WEISS, 1986).

B - Em uma segunda etapa, os isolados que apresentaram características, até então próprias do Lactobacillusacidophilus, foram submetidos ao "Rapid CH (carbohydrates) strips" (teste API, sistema API de identificação bioquímica ou API 50 CH). Neste teste, os isolados foram avaliados quanto às suas capacidades de fermentação de 49 "carboidratos" ou substâncias diferentes.

Resultados e Discussão

Nas amostras plaqueadas "pour plate" em duplicata, no meio agar rogosa SL, e incubadas sob baixo teor de oxigênio a 37ºC por 48 horas, a contagem de células viáveis teve como média 4,7 x 10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC) por grama de fezes. GILLILAND et al. (1975), usando o agar seletivo para lactobacilos (LBS) para a contagem de lactobacilos em fezes de humanos, suínos e frangos, encontraram 1,3 x 10⁸; 9,7 x 10⁸; e 7,5 x 10⁸ UFC por gramas de fezes nas respectivas amostras. PAULO (1991), trabalhando com o meio LBS para plaqueamento de fezes suínas, encontrou 1,6 x 10⁹ UFC/grama de fezes; logo, o número de células viáveis encontrado, neste experimento, está muito próximo dos encontrados por esses autores.

Várias colônias foram isoladas e transferidas para tubos contendo caldo MRS enriquecido com 0,15% de sais biliares. GILLILAND e SPECK (1977) testaram concentrações de 0,05; 0,10; e 0,15% de "Oxgall" (sais biliares) em meio seletivo para lactobacilos resistentes a sais biliares. Das culturas examinadas, o Lactobacillusbulgaricus e o Lactobacilluslactis foram os mais sensíveis, não crescendo em meio contendo 0,15% de sais biliares. Todas as estirpes de Lactobacillusacidophilus cresceram bem nas diferentes concentrações de sais biliares. Resultados similares foram observados com Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum. Existe relação positiva entre a resistência a sais biliares e a capacidade do microrganismo em colonizar o trato intestinal.

Após 48 horas de incubação a 37ºC, as culturas com crescimento evidenciado foram plaqueadas por estrias no meio Rogosa SL e incubadas, também, sob baixo teor de oxigênio, a 37ºC por 48 horas, para posterior reisolamento. Novamente, várias colônias foram transferidas para tubos contendo LDR-12% ESD esterilizado, sendo incubadas a 37ºC até coagulação. O Lactobacillusacidophilus oxida a lactose do leite, até ácido lático, reduzindo o pH e coagulando o leite (KANDLER e WEISS, 1986). Descartando as culturas que não coagularam o leite, obtiveram-se 526 culturas, com média de 32,88 isolados por bezerro.

Dos 526 isolados submetidos ao teste de gram e morfologia celular, 154 (29,3%) apresentaram-se como bastonetes gram-positivos - característica própria do Lactobacillusacidophilus (KANDLER e WEISS, 1986). Ocorreram variações, consideradas normais na morfologia destes isolados, mas CRUICKSHANK (1960) e KANDLER e WEISS (1986) relataram que há variações morfológicas entre estirpes de Lactobacillusacidophilus.

Dos 154 isolados, bastonetes gram-positivos, 152 (98,7%) mostraram-se negativos ao teste da catalase. Bactérias láticas (Lactobacillusacidophilus) são catalase-negativas (ROGOSA, 1974).

Foram submetidos ao teste de produção de gás a partir da glicose 152 isolados, dos quais sete (4,6%) produziram gás, sendo, portanto, positivos ao teste. Segundo KANDLER e WEISS (1986), as estirpes de Lactobacillusacidophilus são homofermentativas e a via principal de fermentação das hexoses é a Embden-Meyerhof, convertendo 1 mol de hexose em 2 moles de ácido lático.

Constatou-se que, entre os 145 isolados, até então bastonetes gram-positivos, catalase-negativos e não produtores de gás a partir da glicose, após submetidos aos testes de coagulação do leite a 15 e 45ºC, redução do "Litmus milk", crescimento em 4 e 8% de cloreto de sódio, hidrólise da arginina, redução do nitrato e fermentação de diferentes "carboidratos", 18 (12,4%) cresceram e coagularam o leite a 15ºC por 30 dias e 31 (21,4%) não cresceram a 45ºC por 72 horas; conseqüentemente, 100 (69%) isolados não cresceram a 15ºC por 30 dias, e sim a 45ºC por 72 horas. Segundo KANDLER e WEISS (1986), com raras exceções, o Lactobacillusacidophilus apresenta bom crescimento a 45ºC. Orla-Jensem (1919), citado por SHARPE (1962), classifica o Lactobacillusacidophilus no grupo das termobactérias, que crescem a 45ºC, e não a 15ºC.

No teste de redução do "Litmus milk", cinco (3,4%) não reduziram o meio, mas o Lactobacillusacidophilus reduz o "Litmus milk". SKERMAN (1959) cita que esta é uma das características apresentadas por microrganismos homofermentativos com temperatura ótima de crescimento igual ou superior a 37ºC.

Quanto ao crescimento em 4 e 8% de cloreto de sódio, 102 (70,3%) cresceram e 96 (66,2%) não cresceram, respectivamente, nas concentrações de 4 e 8% de NaCl. DAVIS (1955) dividiu os lactobacilos em quatro grupos; o Lactobacillusacidophilus pertence ao grupo capaz de crescer em meio com 4, e não 8% de cloreto de sódio.

Todos os isolados testados (145) apresentaram resultados negativos à hidrólise de arginina, que são compatíveis com os obtidos por PAULO (1991), em caracterização de Lactobacillusacidophilus, a partir de fezes de suínos. Segundo KANDLER e WEISS (1986), o Lactobacillus acidophilus não produz amônia a partir da arginina, sendo, portanto, negativo ao teste.

Todos os 145 isolados testados também apresentaram resultados negativos no teste de redução do nitrato. Segundo KANDLER e WEISS (1986), a redução do nitrato por lactobacilos é altamente incomum.

Dos 145 isolados testados, 68 (46,9%) não cresceram a 15ºC, mas a 45ºC; reduziram o "Litmus milk"; não cresceram em presença de 8% de cloreto de sódio; não produziram amônia a partir da arginina; e não reduziram o nitrato. Nos testes com cloreto de sódio (4%), admitem-se resultados variáveis. Estes 68 isolados com características compatíveis com Lactobacillusacidophilus deram continuidade aos testes de caracterização, sendo desta vez submetidos aos testes de fermentação de "carboidratos", conforme Tabela 1.

Vinte e três isolados (33,8%) apresentaram características próprias do Lactobacillusacidophilus com relação à fermentação de "carboidratos" (KANDLER e WEISS, 1986), os quais foram posteriormente submetidos ao teste API. Na Tabela 2 constam os "carboidratos" do teste API e nas Tabelas 3 e 4, as características do Lactobacillusacidophilus.

Dos 23 isolados, 12 (52,2%) mantiveram os resultados compatíveis às características do Lactobacillusacidophilus (LT 154A; LT 156B; LT 158A; LT 350; LT 360; LT 361; LT 482; LT 484; LT 510; LT 516; LT 518; e LT 520).

Alguns isolados não apresentaram os resultados esperados para:

a) Amigdalina: os isolados LT 154A; LT 156B; LT 158A; LT 360; LT 361; LT 482; LT 484; LT 510; LT 516; LT 518; e LT 520 apresentaram resultados variáveis. Os resultados positivos variaram de 1 a 67% (Tabela 4).

b) Arbutina: os isolados LT 154A; LT 156B; LT 361; LT 484; e LT 510 apresentaram resultados positivos e os isolados LT 350; LT 360; LT 516; LT 518; e LT 520, resultados variáveis. Os resultados positivos para o teste API variaram de 1 a 67%.

c) Esculina: todos os isolados apresentaram resultados negativos no teste; contudo, como pode ser observado na Tabela 4, os resultados positivos variaram de 36 a 99% para as estirpes de Lactobacillusacidophilus testados.

d) b-gentiobiose: os isolados LT 158A; LT 360; LT 484; LT 510; e LT 518 apresentaram resultados negativos e os isolados LT 154A; LT 156B; LT 350; LT 361; LT 482; LT 516; e LT 520, resultados variáveis. Os testes positivos variaram de 4 a 99%.

Conclusões

De um total de 526 "isolados" iniciais de fezes de bezerros, obtiveram-se 12 (2,28%) estirpes (LT 154A; LT 156B; LT 158A; LT 350; LT 360; LT 361; LT 482; LT 484; LT 510; LT 516; LT 518; e LT 520) de Lactobacillusacidophlilus.

Recebido em: 04/12/97

Aceito em: 25/03/99

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¹

Parte do trabalho de Tese de Doutorado do primeiro autor, apresentada ao Departamento de Zootecnia da UFV, Viçosa, MG. Parcialmente financiado pela FAPEMIG e EMBRAPA/CNPGL.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Out 2012
• Data do Fascículo
  1999

Histórico

• Aceito
  25 Mar 1999
• Recebido
  04 Dez 1997