Análise de diferentes primers utilizados na PCR visando ao diagnóstico da tuberculose no Estado do Amazonas

Resumos

BACKGROUND: Various primers are being tested for the detection of Mycobacterium tuberculosis DNA. The accuracy of the polymerase chain reaction (PCR) depends on the target sequence used and whether the test will be performed in culture or in clinical specimens. OBJECTIVES: To identify DNA sequences, specifically those commonly reported as targets for diagnosis of tuberculosis (TB), in clinical samples of M. tuberculosis strains. METHOD: Eighty-one clinical samples from suspected TB patients were initially processed and submitted to bacilloscopy (smear) and culture, and PCR was performed with specific primers for the following targets: IS6110, 65 kDa, 38 kDa and MPB64. RESULTS: Smear and culture results were negative in 24 samples, as was the PCR. The 19 samples testing smear positive, as well as the isolated strains, were 100% positive on PCR, with the exception of the 89.4% result from PCR with MPB64 primers. In the 38 smear negative and culture positive samples, PCR results were inconsistent. The primers specific for amplifying the 123 bp IS6110 fragment gave the highest positivity (92.1%), diagnostic agreement (0.9143), co-positivity (94.7%) and co-negativity (100%). CONCLUSION: The IS6110, 38 kDa, MPB64 and 65 kDa sequences were found in the genome of all M. tuberculosis strains isolated in patients from the state of Amazonas. The protocol for processing the clinical samples prior to PCR analysis and the specific primers used to amplify the 123bp IS6110 fragment showed a greater efficiency in diagnosing pulmonary (paucibacillary) tuberculosis in comparison to published data.

Primers; Diagnosis; Mycobacterium tuberculosis

ARTIGO ORIGINAL

Análise de diferentes primers utilizados na PCR visando ao diagnóstico da tuberculose no Estado do Amazonas ^*

Mauricio Morishi Ogusku; Julia Ignez Salem

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: Há diferentes primers sendo testados para a detecção do DNA do Mycobacterium tuberculosis. A acuidade da reação em cadeia da polimerase (PCR) depende da existência da seqüência alvo no bacilo e de os testes serem realizados em cepas isoladas ou em amostras clínicas.

OBJETIVO: Verificar a presença das seqüências de DNA alvo mais relatadas na literatura para o diagnóstico da tuberculose em amostras clínicas usando como controle positivo as respectivas cepas de M. tuberculosis isoladas.

MÉTODO: Oitenta e uma amostras clínicas de pacientes com suspeita de tuberculose foram submetidas à baciloscopia e cultivo. A técnica de PCR foi realizada nas amostras clínicas e cepas isoladas com primers específicos para os seguintes alvos: IS6110, 65 kDa, 38 kDa e MPB64.

RESULTADOS: Em 24 amostras com baciloscopia e cultivo negativos, a PCR também foi negativa com todos os primers testados. Em 19 amostras com baciloscopia positiva e nas cepas isoladas obteve-se 100% de resultados positivos nas PCR, exceto nas PCR em amostras clínicas com os primers para a seqüência MPB64 (89,4%). Em 38 amostras com baciloscopia negativa e cultivo positivo, as PCR tiveram resultados variáveis, sendo que os primers específicos que amplificam o fragmento de 123 pb da seqüência IS6110 foram os que forneceram os maiores percentuais de positividade (92,1%), concordância diagnóstica (0,9143), co-positividade (94,7%) e co-negatividade (100%).

CONCLUSÃO: As seqüências IS6110, 38 kDa, MPB64 e 65 kDa foram encontradas no genoma de todas as cepas de M. tuberculosis isoladas desses pacientes do Estado do Amazonas. O protocolo utilizado no processamento das amostras clínicas e os primers específicos utilizados para amplificação do fragmento de 123 pb da seqüência IS6110 demonstraram maior eficiência no diagnóstico da tuberculose pulmonar (paucibacilar) em comparação com a literatura.

Descritores:Primers/PCR. Diagnóstico/Tuberculose. Mycobacterium tuberculosis.

Siglas e abreviaturas utilizadas neste trabalho:

BAAR - Bacilos álcool-ácidos resistentes

K - Índice Kappa

Nested-PCR - Protocolo de reamplificação do produto de PCR

PB - Pares de base

PCR - Reação em cadeia da polimerase

RFLP - Restriction fragment length polymorphism

Tb - Tuberculose

Introdução

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica molecular cuja escolha do DNA alvo e definição dos primers dentro da seqüência do DNA são fatores determinantes na sua acuidade. Ela vem sendo utilizada como alternativa de alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico rápido de doenças infecciosas. Entretanto, a sua aplicação na detecção do Mycobacterium tuberculosis tem apresentado resultados variáveis, principalmente em relação à sensibilidade do teste ^(1,2,3). Por essa razão várias seqüências alvo têm sido utilizadas, tais como: IS6110, 65 kDa (GroEL), 38 kDa (PhoS, CIE Ag78 ou Pab) e MPB64 (23 kDa). Dentre essas, a IS6110 é a mais comumente usada por ser uma seqüência repetitiva no genoma do M. tuberculosis. Essa característica propicia um aumento na sensibilidade da PCR, quando comparada com a amplificação de seqüências únicas no DNA ⁽⁴⁾. Entretanto, vale ressaltar que a seqüência IS6110 já foi relatada como ausente em cepa de M. tuberculosis isolada na Índia ⁽⁵⁾, bem como foram detectadas seqüências homólogas em cepas de micobactérias potencialmente patogênicas, tais como M. intracellulare, M. fortuitum, M. kansasii, M. xenopi, M. malmoense e M. chelonae ^(6,7). No Brasil não há relato de cepas de M. tuberculosis sem a IS6110 e no Estado do Amazonas é comum o isolamento de algumas das espécies citadas ^(8,9,10).

Diante desses fatos, a aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose (Tb) no estado do Amazonas induziu aos seguintes questionamentos: as seqüências publicadas na literatura existiriam em cepas de M. tuberculosis existentes no Estado do Amazonas? Quais seriam os primers mais indicados para a aplicação desta técnica em amostras clínicas nesse estado?

Visando a responder a essas questões, foi investigada a presença das seqüências alvo mais divulgadas na literatura em um painel de cepas de M. tuberculosis e nas amostras clínicas de onde foram originalmente isoladas.

Método

Foram analisadas 81 amostras clínicas, encaminhadas ao Laboratório de Micobacteriologia do INPA, oriundas de 81 diferentes pacientes residentes no Estado do Amazonas com suspeita de Tb. Submetidas à baciloscopia para pesquisa de BAAR e ao cultivo para o isolamento do M. tuberculosis, 24 tiveram resultados negativos em ambos os exames, 19 foram positivas em ambos os exames (amostras multibacilares) e 38 foram negativas na baciloscopia com cultivo positivo para o M. tuberculosis (amostras paucibacilares).

As baciloscopias foram realizadas conforme orientações do Ministério da Saúde ⁽¹¹⁾. Para o cultivo, as amostras foram transferidas para tubos cônicos graduados de centrífuga com capacidade de 15 mL, com adição de volume igual de NaOH a 4%, agitadas, e deixadas em repouso por 15 minutos. Foi completado o volume para 12 mL com água destilada estéril, e foram centrifugadas a 3.000 x g e desprezado o sobrenadante. Os sedimentos foram suspensos em 2 mL de água destilada estéril, neutralizados com HCl a 4%, e foram retiradas alíquotas de 0,2 mL para semeadura em 3 tubos contendo meio de Lowenstein-Jensen. O restante da suspensão foi reservado para posterior análise pela PCR e os tubos semeados foram incubados a 37ºC pelo período máximo de 60 dias. As cepas de micobactérias isoladas foram identificadas como M. tuberculosis conforme recomendado por David et al. ⁽¹²⁾.

Tanto a suspensão das amostras clínicas como as 57 cepas isoladas das respectivas amostras foram analisadas pela PCR visando a identificar as seqüências alvo IS6110, 65 kDa, 38 kDa e MPB64. Para a detecção da região IS6110 foram testados dois pares distintos de primers, um que promove a amplificação de um fragmento de 123 pb ⁽⁴⁾ e outro de 541 pb ⁽¹³⁾. As amplificações das seqüências nucleotídicas dos alvos 65 kDa e 38 kDa consistiram em duas PCRs consecutivas, PCR e protocolo de reamplificação do produto de PCR (Nested-PCR), com uso de dois pares de primers específicos para cada teste. Na PCR para o alvo 65 kDa ⁽¹⁴⁾, o par de primers externos amplificou uma região de 383 pb, enquanto o produto da Nested-PCR, com os primers internos, resultou em um fragmento de 155 pb. Na PCR para o alvo 38 kDa ⁽¹⁵⁾, os produtos amplificados na PCR simples e Nested-PCR forneceram fragmentos de 419 pb e 322 pb, respectivamente. Os primers para a região MPB64 ⁽¹⁶⁾ amplificaram um fragmento de 240 pb.

A extração do DNA dos sedimentos das amostras foi realizada conforme protocolo de Ogusku et al. ⁽¹⁷⁾ e os DNA foram purificados com fenol-clorofórmio e precipitados com etanol absoluto, conforme Davis et al. ⁽¹⁸⁾. Para a extração dos DNA das 57 cepas de M. tuberculosis isoladas das amostras submetidas ao cultivo, utilizou-se protocolo adaptado de Perosio et al. ⁽¹⁹⁾, em que aproximadamente 1 mg de cada cepa foi transferido para um tubo com tampa de rosca contendo pérolas de vidro, submetido à agitação em vórtex para desagregação bacilar e acrescido de água destilada estéril até a obtenção de uma suspensão com turbidez equivalente à escala nº 1 de McFarland. De cada suspensão, utilizou-se uma alíquota de 50 mL para extração do DNA. Em cada alíquota foram adicionados 50 mL de tampão de lise (200 mM de Tris-HCl pH 8,0 e 800 mg/mL de Proteinase K). As alíquotas foram incubadas a 37ºC overnight e posteriormente a 100 ºC por 10 minutos, e centrifugadas a 14.000 x g por 15 segundos. Cinco microlitros do sobrenadante foram utilizados para a realização da PCR com os diferentes primers.

Visando a estabelecer a concentração mínima de bacilos que poderia ser detectada pela PCR com os diferentes primers, verificou-se a sensibilidade intrínseca dos mesmos conforme protocolo de Bollela et al. ⁽²⁰⁾. Para tanto, uma suspensão de M. tuberculosis H37Rv foi preparada com turbidez igual à do tubo 1 da escala de McFarland (equivalente a 3 x 10⁸ bacilos/mL), e diluída a 1:10 em água destilada estéril, sucessivamente, até a concentração de 3 x 10^-1 bacilos/mL. Para a extração do DNA submeteu-se cada diluição a 100ºC por 10 minutos e centrifugação a 13.500 rpm por 10 minutos. Cinco microlitros do sobrenadante foram então utilizados na PCR. A especificidade intrínseca dos primers foi verificada frente aos DNA de Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium avium-intracellulare, Shigella sonnei, Salmonella paratyphi A, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Para extração do DNA dessas espécies, foi utilizado o mesmo protocolo anterior.

A PCR para cada seqüência alvo nos DNA extraídos das amostras clínicas e das cepas foi realizada em um volume de 50 mL contendo 10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 0,01% gelatina; 2 mM MgCl₂; 200 mM dNTP (Sigma); 0,1mM de cada primer; 2U Taq DNA Polimerase (Invitrogen); e 5 mL do DNA extraído (cepa isolada ou amostra clínica ou produto de PCR). As seqüências dos primers para os respectivos DNA alvos e os parâmetros de amplificação estão descritos na Tabela 1 . Os primers foram sintetizados pela Invitrogen e o termociclador utilizado foi o GeneAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems). Para cada sessão de amplificação de DNA, foi incorporado um controle positivo contendo DNA de M. tuberculosis H37Rv e uma reação sem DNA (controle negativo).

Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Posteriormente, o gel de agarose foi corado com brometo de etídeo e os produtos de PCR visualizados em transiluminador de luz ultravioleta Eagle Eye® II (Stratagene).

Para a análise dos resultados utilizou-se o índice de Kappa na verificação de concordância entre métodos diagnósticos (cultivo e PCR) e entre os diferentes primers. Para a análise de co-positividade e co-negatividade foram utilizadas tabelas 2 X 2.

Resultados

As sensibilidades intrínsecas dos primers testados alcançaram a diluição de 3 x 10⁰, ou seja, 3 bacilos/mL, exceção feita aos primers para MPB64, que apresentaram menor sensibilidade, pois somente tiveram positividade na diluição de 3 x 10² bacilos/mL. As especificidades foram consideradas altas por não ter ocorrido amplificação a partir de DNA de Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium avium-intracellulare, Shigella sonnei, Salmonella paratyphi A, Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

As PCR realizadas nos sedimentos das amostras clínicas negativas nos exames bacteriológicos de baciloscopia e cultivo tiveram também resultados negativos com todos os primers testados. Por outro lado, todas as amostras clínicas positivas nos exames baciloscópicos e as cepas isoladas das mesmas tiveram 100% de resultados positivos na PCR, com exceção das realizadas nas amostras clínicas com os primers para a seqüência MPB64 (89,4%). Os resultados das PCR nas amostras com resultados baciloscópicos negativos para BAAR e nas cepas oriundas das mesmas foram variáveis conforme os primers testados. Os percentuais de positividade obtidos para essas amostras estão demonstrados na Figura 1 .

Os resultados da análise de concordância entre o diagnóstico de Tb proporcionado pelo cultivo e o obtido pela PCR, conforme os diferentes primers estudados, assim como os de co-positividade e co-negatividade, ambos tendo como padrão diagnóstico o isolamento de M. tuberculosis, estão demonstrados na Tabela 2 .

A concordância de diagnósticos de Tb pela PCR com os diferentes primers estudados, assim como os de co-positividade e co-negatividade, ambos tendo como padrão diagnóstico o primer IS6110, por ter sido o que proporcionou maior percentual de positividade, estão demonstrados na Tabela 3 .

Discussão

Os resultados sugerem que as seqüências alvo IS6110, 65 kDa, 38 kDa e MPB64 estão preservadas em todas as cepas analisadas e que os respectivos primers estudados poderiam ser utilizados no diagnóstico de Tb por PCR em amostras clínicas. Nas amostras clínicas multibacilares apenas os primers para a seqüência MPB64 (240 pb) não foram 100% eficazes, amplificando 89,4% delas. Entre as amostras paucibacilares os percentuais de positividade foram variados com os primers estudados, conforme demonstrado na Figura 1.

O percentual de positividade para amplificação do fragmento de 123pb do alvo IS6110, obtido no presente trabalho (92,1%), foi superior aos encontrados por Nolte et al. ⁽²¹⁾, Shawar et al. ⁽²²⁾ e por Montenegro et al. ⁽²⁾, que obtiveram os percentuais de 57,0%, 53,0% e 76,7%, respectivamente. Quando foram utilizados os primers que amplificam um fragmento de 541 pb do alvo IS6110, obteve-se percentual de positividade de 86,8%. Nossos resultados são superiores aos encontrados por Abe et al. ⁽¹³⁾, que obtiveram apenas 50,0% com os referidos primers. Com os primers 65 kDa, após a Nested-PCR (65 kDa - 155 pb), obteve-se percentual de positividade em 76,3%, resultado superior ao de Pierre et al. ⁽¹⁴⁾, que obtiveram apenas 40%. Em relação aos primers para a seqüência 38 kDa, nosso percentual de positividade da Nested-PCR foi de 86,8%, superior aos 38,4% encontrado por Miyazaki et al. ⁽¹⁵⁾. A PCR para MPB64 foi a que apresentou o menor percentual de positividade (60,5%) nas amostras paucibacilares. Nosso resultado foi inferior aos 70,0% obtidos por Martins et al. ⁽²³⁾, após a inclusão da etapa de Nested-PCR. Entretanto, no presente trabalho não se efetuou a referida etapa.

As diferenças entre os percentuais de positividade do presente trabalho e os da literatura poderiam estar relacionadas com pequenas alterações nos protocolos realizados, tais como os processos de descontaminação das amostras e variações na constituição dos tampões de lise. Esses resultados corroboram a afirmação de Butcher et al. ⁽²⁴⁾ de que a positividade da PCR tem grande variação em amostras com baciloscopias negativas e cultivos positivos para M. tuberculosis, à qual adicionamos as variações nos protocolos de realização das PCR.

As concordâncias de diagnóstico e as co-positividades e co-negatividades entre os primers e os cultivos, tendo como padrão o isolamento de M. tuberculosis (Tabela 2 ), demonstram que os primers que amplificaram o fragmento de 123 pb da seqüência IS6110 são os mais indicados no diagnóstico de Tb em amostras clínicas, sejam elas positivas ou negativas na baciloscopia. Apesar de os referidos primers não terem propiciado diagnóstico em três das amostras comprovadamente portadoras de M. tuberculosis (co-positividade de 94,7%), não houve nenhum resultado falso-positivo (co-negatividade de 100%). Vale ressaltar que nenhum dos primers testados apresentou resultados falso-positivos.

Das amostras analisadas pela PCR, em apenas uma os primers específicos para amplificação do fragmento de 123pb do alvo IS6110 não detectaram o DNA de M. tuberculosis, que somente foi detectado pelos primers que amplificam um fragmento de 541 pb do alvo IS6110, e pelos referentes aos alvos 65 kDa e 38 kDa, conforme pode ser visualizado na Tabela 3 , relativa à análise de concordância entre as amplificações de DNA pelos primers. Tratava-se de uma amostra paucibacilar com o menor número de colônias isoladas por amostra, isto é, quatro colônias nos três tubos de Lowenstein-Jensen semeados.

A seqüência IS6110 está freqüentemente presente em múltiplas cópias no genoma do M. tuberculosis. Conseqüentemente, resulta em uma maior sensibilidade da PCR em comparação com amplificações de seqüências de cópias únicas (38 kDa, 65 kDa e MPB64), mesmo quando estas são submetidas a duas reações de PCR consecutivas, como na Nested-PCR. O grande percentual de positividade nas amostras do Amazonas pode indicar que as cepas de M. tuberculosis apresentam uma maior freqüência de cópias dessa seqüência em seu genoma, passível de ser verificado pelo RFLP (restriction fragment length polymorphism). Essa premissa, acrescida das diferenças dos protocolos utilizados na realização da PCR, pode explicar os resultados de positividade superiores aos encontrados na literatura.

Os resultados apresentados indicam que os pares de primers estudados servem para identificar seqüências genômicas do M. tuberculosis a partir de colônias isoladas em meio de cultivo, estratégia indicada por Kontos et al. ⁽²⁵⁾. O protocolo de identificação pela técnica da PCR em 24/48 horas após cultivo torna-se de maior importância quando existe um número insuficiente de colônias, pois, neste caso, os testes de identificação só podem ser realizados após sub-cultivos, o que retarda a identificação da micobactéria por no mínimo mais 21 dias.

Apesar da pequena casuística analisada, conclui-se que existe forte indício de que os primers para IS6110 (123 pb) são os mais indicados, no Estado do Amazonas, para realização da PCR em amostras clínicas e em cepas de M. tuberculosis manipuladas em serviços de saúde que realizam o diagnóstico laboratorial da Tb. Para ratificação desses resultados faz-se necessário que um número maior de amostras e cepas sejam analisadas frente aos primers estudados, e que a técnica seja executada em outras unidades laboratoriais do estado.

Recebido para publicação, em 5/3/04.

Aprovado, após revisão, em 3/6/04.

Órgãos Financiadores: Ministério da Saúde, CAPES/RENOR. Rede Brasileira de Pesquisa em TB (REDE - TB)/Processo 62.0055/01-4-PACDT - Milenio

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*

Trabalho realizado no Laboratório de Micobacteriologia da Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Amazonas.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2004
• Data do Fascículo
  Ago 2004

Histórico

• Recebido
  05 Mar 2004
• Aceito
  03 Jun 2004