Influência do selante de fibrina na cicatrização das pregas vocais de suínos

Resumos

Fibrin sealants or fibrin glue are products made from human plasma proteins, which mimic the final pathway of the coagulation cascade. Its application to stimulate the healing process has been a topic of debate in the literature. The use of fibrin sealants in phonosurgery has been empirical; there have been no studies that investigate the action of fibrin sealant in Reinke's space. AIM: To evaluate the effect of fibrin glue in healing of the vocal folds of pigs after surgical manipulation. MATERIALS AND METHODS: This was a prospective and experimental study. Six animals had both vocal folds incised. Sealant was applied in one of them; the other served as a control. After three months, the animals were sacrificed and a collagen count was carried out. RESULTS: The side on which glue was applied had an average of 27.8% against 20.4% of the side without glue. CONCLUSION: The collagen concentration in the samples where the fibrin sealant was applied was significantly higher compared to samples without glue. Thus, the presence of a fibrin sealant stimulates fibrogenesis in this tissue.

fibrin tissue adhesive; vocal cords; wound healing

ORIGINAL ARTICLE

Influência do selante de fibrina na cicatrização das pregas vocais de suínos

Karla Palma Portes^I; André de Campos Duprat^II; Carmen Lucia Penteado Lancellotti^III; Leonardo Silva^IV; Flávia Coelho de Souza^V

^ITítulo de Especialista em Otorrinolaringologia pela ABORL-CCF (Mestranda da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo)

^IIDoutor em Otorrinolaringologia (Professor Instrutor da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo)

^IIIDoutora em Patologia (Professora Titular da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo)

^IVDoutor em Otorrinolaringologia (Professor Instrutor da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo)

^VMestre em Medicina Veterinária (Doutoranda da Santa Casa de São Paulo)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Os selantes de fibrina ou cola de fibrina são produtos originários de proteínas do plasma humano que mimetizam a via final da rede de coagulação. Sua aplicação para estimular a cicatrização tem sido motivo de discussão na literatura mundial. O uso do selante de fibrina em fonocirurgia tem sido realizado de modo empírico. Não há trabalhos que investiguem a ação do selante de fibrina no espaço de Reinke.

OBJETIVOS: Avaliar a interferência do uso da cola de fibrina no processo de cicatrização gerado pela manipulação cirúrgica em pregas vocais de suínos.

MATERIAIS E MÉTODOS: Estudo prospectivo e experimental. Seis animais tiveram ambas as pregas vocais incisadas e em apenas uma delas foi aplicado o selante, sendo que a outra serviu de controle. Após 3 meses, os animais foram sacrificados e a contagem de colágenos realizada.

RESULTADOS: O lado com aplicação de cola teve média de 27,8% contra 20,4% do lado sem aplicação de cola.

CONCLUSÃO: A concentração de colágeno nas amostras onde o selante de fibrina foi aplicado é significativamente maior do que nas amostras onde não houve a aplicação. Portanto, a presença do selante de fibrina estimula a fibrogênese neste tecido.

Palavras-chave: adesivo tecidual de fibrina, cicatrização de feridas, pregas vocais.

INTRODUÇÃO

Os selantes de fibrina, ou cola de fibrina, são produtos originários de proteínas do plasma humano que mimetizam a via final da rede de coagulação. Nesses produtos, o fibrinogênio é proteolicamente clivado e convertido em polímeros de fibrina pela ação da trombina. O Fator XIII, quando ativado pela trombina na presença deíons de cálcio, reage com os polímeros de fibrina, resultando um coágulo estável e insolúvel^1,2.

A cola de fibrina foi aprovada pelo FDA, nos Estados Unidos, para uso em cirurgias por suas propriedades hemostáticas, mas vem sendo utilizada em diferentes procedimentos cirúrgicos como selador de cavidades, estimulador do processo de reparação tecidual, além de veículo de liberação lenta de drogas ou de agentes de crescimento^3-8.

Sua aplicação para estimular a cicatrização tem sido motivo de discussão na literatura mundial. Clark⁹ afirma que o uso do selante de fibrina para evitar aderências ou tecido fibrótico é contraditório, já que o fibrinogênio estimula a produção de colágeno. Entretanto, a maioria dos estudos clínicos experimentais sobre a aplicação do selante de fibrina em diversos tecidos mostra bons resultados, com diminuição da formação de fibrose e aderência dos tecidos de diferentes tipos de campos cirúrgicos quando utilizada a cola de fibrina, em comparação com o grupo controle¹⁰.

O uso do selante de fibrina na cirurgia laríngea foi descrito pela primeira vez por Bouchayer & Cornut¹¹ ,em 1992. Geralmente, o selante é utilizado para fixar flaps de mucosa¹², como base para a colocação de enxertos no espaço de Reinke¹³ e, sobretudo, após o advento do laser de CO₂, para cobrir o leito cirúrgico cruento, prevenindo a formação de granulomas¹⁴.

O uso do selante de fibrina em fonocirurgia tem sido realizado de modo empírico. Não há trabalhos que investiguem a ação do selante de fibrina no espaço de Reinke e sua ação direta sobre a fibrogênese durante seu processo cicatricial. O principal objetivo deste estudo é avaliar a interferência do uso da cola de fibrina no processo de cicatrização gerado pela manipulação cirúrgica em pregas vocais de suínos

MATERIAIS E MÉTODO

A pesquisa foi iniciada após aprovação de Comitêde Ética (protocolo 2/08). Neste estudo, foram utilizados seis suínos (mini pigs). Os animais foram monitorizados e submetidos à intubação orotraqueal. Após a anestesia, foram posicionados em decúbito dorsal, em proclive¹⁵. Utilizamos um laringoscópio de suspensão para visualização da laringe, especialmente desenvolvido por Pontes et al. para a realização do procedimento em suínos (Figuras. 1 e 2)¹⁶.

Utilizamos microscópio cirúrgico com binocular reta, com lente de 400 mm para observação da glote e a realização do procedimento cirúrgico. Foi realizada uma incisão e descolamento da mucosa de ambas as pregas vocais (Figura 3). O descolamento foi cuidadoso, de modo a não lesar o músculo tireoaritenoídeo. A seguir, foi aplicado no interior da bolsa confeccionada de uma das pregas vocais, aproximadamente 0,5ml do selante de fibrina, sendo a mucosa acomodada a seguir. A outra prega vocal teve apenas a mucosa acomodada sem o uso do selante, para cicatrização por segunda intenção. A escolha da prega vocal que receberia o selante foi aleatória. O selante comercial utilizado neste estudo foi o Tissucol^®, do laboratório Baxter, que contém 70-110mg/ml de fibrinogênio, 10-50U/ml de Fator XIII humano, 500UI/ml de trombina humana, 3000 KIU de aprotinina bovina. As embalagens contêm seringas e agulhas para reconstituição do produto e um dispositivo para aplicação - Duploject.

Os frascos disponíveis no Kit foram aquecidos na temperatura constante de 37ºC em cuba térmica, até o momento da realização do procedimento. O Tissucol liofílizado é reconstituído com a solução de aprotinina. A trombina liofilizada é reconstituída com a solução de cloreto de cálcio. Usa-se a trombina de 500U quando se deseja uma solidificação rápida (<20 segundos), e a trombina de 4U quando se deseja uma coagulação mais lenta (40-60 segundos). Optamos pelo uso da trombina de solidificação rápida. Os dois componentes foram aplicados simultaneamente, sempre em quantidades iguais, utilizando o Duploject^®

Os animais permaneceram em pocilgas durante um período de três meses após o procedimento cirúrgico, quando foram sacrificados. Para o sacrifício, os animais receberam:Dormonid 1 mg/ml) na dose de 0,1 mg/Kg por via intramuscular e propofol de 6 mg/kg por via intravenosa (IV). A seguir, os animais receberam injeção intracardíaca de cloreto de potássio¹⁵.

Após a morte, a laringe dos animais foi removida. A laringe foi ressecada e conservada em formol a 10%. Depois, foi dividida em duas hemilaringes para o estudo histológico. Finalmente, foram preparadas lâminas histológicas de ambas as pregas vocais e a coloração utilizada foi o Pricosirius Red¹⁷. A seguir, as lâminas foram avaliadas no microscópio óptico à procura de anomalias, como corpo estranho ou resquícios do selante de fibrina. A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico, acoplado a câmera de vídeo e analisadas pelo programa Pro-image-plus 4.5(paraWindows) em computador com processador Pentium IV^®.

A medida da fibroplasia foi aferida em micrômetros quadrados (µm²). Determinamos, com movimentos do mouse, uma área da mucosa a ser estudada em três locais distintos. O colágeno, corado em vermelho pelo Pricosirius, teve sua cor automaticamente selecionada pelo programa Pro-image-plus 4.5, realizando-se a quantificação e a somatória da área em µm². Após desfeita a randomização, os dados foram transportados para o programa Excel Windows^® e colocados em forma de tabela para análise estatística. Na análise estatística, foram utilizados os softwares: SPSS V16, Minitab 15 e Excel Office 2007.

RESULTADOS

O Pricosirius corou as camadas de colágeno em vermelho, facilitando a contagem da concentração do mesmo pelo programa de computador (Figuras 4 e 5). Não foram encontrados vestígios do selante em nenhuma das amostras. A contagem da concentração de colágeno presente nas amostras foi realizada por uma câmera acoplada ao microscópio óptico. Cada animal possuía duas lâminas coradas em pricossirius red, sendo uma correspondente ao lado direito e outra, ao lado esquerdo. Foram escolhidos três campos a serem fotografados em cada lâmina.

Foi definido para este trabalho um nível de significância de 0,05 (5%). Lembramos, também, que todos os intervalos de confiança construídos ao longo do trabalho, foram construídos com 95% de confiança estatística. Utilizamos o teste de Wilcoxon para a análise estatística de dados pareados, já que cada indivíduo serviu de pesquisa e controle de si mesmo. Logo no início, detectamos que as medidas do lado esquerdo do porco 77 e o lado direito do porco 79 são valores considerados outliers (valores extremamente altos). Por isso, fizemos as análises em duas etapas. Chamamos de Completa, quando trabalhamos com toda a amostra, e de Simulação, quando trabalhamos com a amostra sem os porcos de número 77 e 79, excluindo-os da amostra. Na Tabela 1, aplicamos o teste de Wilcoxon e utilizamos as descritivas de posição para avaliar a concentração do colágeno nasáreas estudadas. Na análise da amostra completa, a diferença foi considerada estatisticamente significante, na qual o lado com aplicação de cola teve média de 27,8% contra 20,4% do lado sem aplicação de cola. (Gráfico 1).

DISCUSSÃO

Em uma análise inicial das lâminas, não foram encontrados resquícios do selante de fibrina em nenhuma das amostras. Isto indica que, em uma fase tardia da cicatrização, o selante de fibrina foi totalmente reabsorvido. Uma das maiores vantagens no uso do selante de fibrina é a estabilidade do coágulo na área selada, determinada pela ação de agentes antifibrinolíticos existentes na cola, evitando, assim, deslocamentos na área selada e sua propriedade de reabsorção total pelo organismo, evitando o retardo da cicatrização¹⁸. A aprotinina, antifibrinolítico de origem bovina presente em várias apresentações comerciais,é a responsável pela estabilidade do coágulo e por sua permanência prolongada no sítio cirúrgico¹⁹. A concentração de aprotinina considerada ideal é a de 3000KIU/ml¹⁸.

Quanto à análise da fibroplasia, observamos maior concentração do colágeno nas pregas vocais onde foi aplicada a cola em relação à prega contralateral (controle). A diferença foi estatisticamente significativa (27,8% contra 20,4% do lado sem aplicação de cola). Mesmo entre os animais 76 e 79, que foram considerados outliers, a diferença foi mantida. A razão para que essas amostras fugissem do padrão das demais talvez seja explicada pela diferença de tempo e variações da composição do corante utilizado em épocas diferentes. Importante ressaltar que nenhum dos animais apresentou evidências de infecção durante o período de observação que pudessem influenciar no processo de cicatrização. Ressaltamos, aqui, que este estudo é baseado na comparação entre as pregas vocais do mesmo animal, logo as possíveis diferenças na formulação dos corantes não afetam a análise comparativa.

A literatura apresenta inúmeros estudos que comprovam a eficácia da cicatrização após a aplicação do selante de fibrina. Os trabalhos que descrevem o uso do selante na cirurgia laríngea e principalmente fonocirurgia são relatos de caso. A aplicação do selante é feita de modo empírico, considerando os resultados funcionais no pós-operatório. Não há estudos que descrevam a influência do selante de fibrina no processo cicatricial da lâmina própria sob o ponto de vista histológico ou biomolecular. Nossos resultados foram comparados com estudos realizados em diferentes tecidos e diferentes animais.

Encontramos alguns estudos que descrevem reações inflamatórias mais intensas no sítio cirúrgico, nas primeiras semanas após a aplicação do selante de fibrina, podendo este processo inflamatório persistir até 30 dias após a aplicação, seguida pela formação de um processo de inflamação crônico e por um tecido de granulação rico em fibroblastos. Esse infiltrado persistente rico em fibroblastos sugere que, em longo prazo, poderia haver a formação de um processo cicatricial rico em colágeno e, consequentemente, mais fibrose²⁰. Hanson & Quinn²¹realizaram um ensaio para demonstrar a influência da cola de fibrina sobre a quimiotaxia de neutrófilos durante o processo de cicatrização. Os autores observaram que a concentração de fibrina, variável em vários tipos de selante de fibrina disponíveis comercialmente, tem influência direta sobre a quimiotaxia. Quanto maior a concentração de fibrina, menor a quimiotaxia, sendo que concentrações maiores que 2mg/ml podem bloquear o processo. Os autores ainda consideram que a presença do fator XIII, presente em alguns tipos de selantes disponíveis no mercado, também possam exerce influência direta sobre o processo, permitindo maior quimiotaxia dos neutrófilos, explicando o maior processo inflamatório encontrado na presença da cola de fibrina e, consequentemente, maior fibroplasia num momento mais tardio da cicatrização.

Clark⁹, em um trabalho de revisão de literatura sobre a ação do selante de fibrina na reparação tecidual, discute que o uso do selante como promotor da cicatrização tecidual e na prevenção de adesão abdominal parece ser contraditório, já que um agente que promove reparo de tecido pode aumentar a capacidade de adesão tecidual e não preveni-la. Ainda de acordo com nosso estudo, temos o trabalho de Marx & Mou²². Os autores relataram a presença de um intenso infiltrado inflamatório na derme até o quarto dia do estudo que se normalizou ao redor do sétimo dia de avaliação, quando observaram completa reepitelização, com proeminente fibroplasia, deposição de colágeno e angiogênese ao longo da linha de incisão.

Em contraste, Fabris et al.²³, em 1998, investigaram a influência do selante de fibrina, em alta concentração, no crescimento dos fibroblastos do ligamento periodontal humano. Os fibroblastos do ligamento periodontal foram semeados e cultivados durante 48h e 72h na presença da cola de fibrina. Os resultados mostraram que a cola de fibrina é compatível com o crescimento de fibroblastos e síntese de colágeno, embora os autores tenham observado uma tendência a menor proliferação celular e produção de colágeno na cola quando comparado às culturas controles.

Uma importante questão a ser levantada é a possibilidade de reação imunológica dos tecidos de animais estudados em relação à cola. Lembramos que os componentes do selante de fibrina são de origem humana e a aprotinina é de origem bovina. O modo de preparo atual dos selantes diminui muito as chances de reação anafilática (pela aprotinina) em humanos, mas, pelas diferenças filogenéticas das espécies, esta possibilidade não pode ser descartada. Scardino et al.²⁴avaliaram histologicamente a cicatrização epitelial sob influência de dois selantes diferentes, um com produto derivado de plasma humano e outro, derivado plasma bovino. Vinte e quatro cadelas beagle foram avaliadas. Os autores mostraram a presença de um infiltrado inflamatório crônico em ambos os grupos, de intensidade leve a moderada. A resposta inflamatória foi mais persistente no grupo que utilizou o selante de derivados bovinos, provavelmente relacionada à diferença de filogenia entre os produtos comerciais utilizados e o modelo animal escolhido para o trabalho.

Existem muitas discrepâncias na literatura quanto aos estudos que analisam diretamente a influência do selante de fibrina na cicatrização dos tecidos. Por outro lado, os relatos de caso são quase unânimes em concordar com os bons resultados funcionais e estéticos nas diversas áreas onde o selante pode ser aplicado. Cabe, portanto, ao cirurgião cautela e pesar os custos e benefícios do uso do selante na prática diária.

Em nosso estudo, as incisões realizadas nas pregas vocais dos suínos geraram áreas cruentas pequenas, com sangramento insignificante. Nestes casos, o alto custo do selante de fibrina e os resultados que indicam maior deposição de colágeno nos tecidos cicatrizados tornam a aplicação do selante desvantajosa em relação à simples aproximação dos bordos da ferida. Por outro lado, em ocasiões nas quais é necessária a fixação de retalhos ou áreas cruentas extensas e descolamentos amplos, quando a desorganização do tecido de cobertura das pregas vocais é maior, a aproximação dos bordos com a aplicação do selante de fibrina e o estímulo à cicatrização pode ser benéfico. Nosso estudo remete ao assunto de maior preocupação para o fonocirurgião: entender o intrincado processo de cicatrização da lâmina própria e a procura de substâncias que possam amenizar as agressões sofridas por esse delicado tecido durante um procedimento cirúrgico. Dispomos de poucos dados para afirmar que o uso do selante de fibrina é fundamental ou não no processo de regeneração das pregas vocais e sua influência na formação de fibroses e aderências que podem comprometer a funcionalidade vocal do paciente. A literatura carece de estudos sobre a ação da cola na lâmina própria e sabemos que não podemos encarar o seu comportamento como semelhante ao de células epiteliais ou vasculares.

O desenvolvimento da medicina biomolecular e as possibilidades de reproduzir meios de cultura de células humanas in vitro talvez possibilitem entender melhor o comportamento das células humanas na presença do selante de fibrina, sem interferências da filogenética que permeiam os estudos com animais.

CONCLUSÕES

O presente estudo permite as seguintes conclusões:

- Não detectamos a presença do selante de fibrina em nenhuma das amostras avaliadas, confirmando a capacidade de total reabsorção desta substância pelo organismo;

- A concentração de colágeno nas amostras nas quais o selante de fibrina foi aplicado é significativamente maior do que nas amostras onde não houve a aplicação. Portanto, o selante estimula a fibrogênese neste tecido.

Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da BJORL em 29 de março de 2011. cod. 7670

Artigo aceito em 30 de abril de 2011.

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo - Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia.

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Endereço para correspondência:

Rua José Bonifácio, 25, Boa Vista

São Caetano do Sul-SP. CEP: 09572050

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Fev 2012

Histórico

• Recebido
  29 Mar 2011
• Aceito
  30 Abr 2011