Viabilidade de Tritrichomonas foetus após congelamento com diferentes crioprotetores

Viability of Tritrichomonas foetus after freezing with diferents cryoprotectors

NOTA DE PESQUISA

Viabilidade de Tritrichomonas foetus após congelamento com diferentes crioprotetores

Viability of Tritrichomonas foetus after freezing with diferents cryoprotectors

Nelson Éder Martins^I; Francisco Carlos F. Lobato^I; Felipe M. Salvarani^I; Rodrigo Otávio S. Silva^I; Geraldo Márcio da Costa^II; Catarina G.R.D. Lima^I; Prhiscylla S. Pires^I; Ronnie A. de Assis^III

^IEscola de Veterinária. Universidade Federal de Minas Gerais, Caixa Postal 567, Av.AntônioCarlos, 6.627, CampusPampulha, Belo Horizonte, MG 31270-901, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Campus Universitário, Caixa Postal 37. CEP.: 37.200-000 Lavras, MG

^IIISetor de Clostridioses, Lanagro-MG, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Pedro Leopoldo, MG

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade de um isolado de Tritrichomonas foetus criopreservada com glicerol e dimetilsulfóxido (DMSO) a -196ºC. Isolados do protozoário foram descongeladas dois dias após o congelamento e 6, 12, 18 e 26 meses, para avaliação de sua viabilidade. Em todos os tempos analisados, o congelamento foi viável em 60% e 90% das amostras congeladas com glicerol a 10% e DMSO a 12%, respectivamente.

Palavras-chave: Tricomoníase, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO).

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the viabilitity of Tritrichomonas foetus cryopreservated with glycerol and dimethilsulphosyde (DMSO) at –196ºC. Samples of the protozoa were thaw two days and 6, 12, 18, and 26 months after freezing to be evaluated. In the time analyzed, the freezing was viable in 60% and 90% of freeze samples with glycerol at 10% and DMSO at 12%, respectively.

Key words: Trichomoniasis, glycerol, dimethilsulphosyde (DMSO).

A tricomonose é uma doença sexualmente transmissível dos bovinos causada por um protozoário flagelado denominado Tritrichomonas foetus, cujo habitat é o trato genital. A transmissão ocorre do macho para a fêmea através da monta ou pelo uso de sêmen contaminado (BONDURANT, 2005). A patologia tem como principais manifestações clínicas a repetição de cios a intervalos irregulares e o aborto, com maior freqüência até os cinco meses de gestação (SCHWEBKE; BURGESS, 2004).

Apesar de laborioso, por requerer dois a três repiques semanais, T. foetus pode ser mantido com certa facilidade em culturas contaminadas e/ou axênicas, mas não pode ser estocado sob refrigeração (4-8ºC) ou liofilizado, pois tende a morrer em um curto período de tempo (RAE; CREWS, 2006).

Técnicas de preservação pelo congelamento têm sido usadas com sucesso em diferentes espécies para manutenção de organismos vivos. Agentes crioprotetores tais como glicerol e dimetilsulfóxido (DMSO), os quais protegem células eucariotas contra os efeitos deletérios do congelamento e descongelamento, têm sido usadas para criopreservação de amostras de T. foetus (DIAMOND, 1957; LEVINE et al., 1962; LEVINE; ANDERSEN, 1966; KULDA; HONIGBERG, 1969; CAMPERO, 1989).

Com o intuito de manter isolados de T. foetus viáveis por um maior período de tempo no laboratório, este trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade de um isolado de T. foetus após processo de criopreservação com glicerol e dimetilsulfóxido (DMSO) a -196ºC.

Foi utilizada uma amostra de T. foetus isolada de um touro da raça Nelore do município de Divinópolis, Minas Gerais, obtida por meio de lavado prepucial com solução fisiológica estéril a 0,85% acrescido do meio de Rieck modificado (GUIDA, 1960). Uma alíquota de 100mL do lavado prepucial foi repicada em caldo TYI-S-33 (DIAMOND et al., 1978) e incubada a 37ºC em aerobiose por 48 horas. Em seguida, a amostra foi examinada em microscópio óptico e apresentou-se positiva para T. foetus, porém contaminada com leveduras e bactérias, tornando-se necessário a realização da axenização.

Inicialmente a amostra foi repicada em dois tubos com caldo TYI-S-33, acrescido de 250 mg/ml de Procin e 333 UI de nistatina e incubada a 37ºC em aerobiose por 48 horas. Para assegurar ausência de fungos e/ou bactérias, as culturas foram subcultivadas cinco vezes, mantendo a mesma concentração das drogas utilizadas anteriormente. Em seguida, a amostra foi também repicada em caldo Tioglicolato (Dignolab, Barcelona, Espanha) e incubada a 37ºC em aerobiose por 48 horas para teste de esterilidade.

A amostra previamente axênizada em caldo TYI-S-33, denominada DIV-95, foi misturada separadamente com glicerol a 10% e a DMSO 12% (SCHWEBKE, 2004). Foram utilizados 25 criotubos com glicerol e 25 com DMSO. Os criotubos foram passados da temperatura ambiente até a 4ºC em cinco minutos e de 0ºC a -45ºC em 45 minutos usando vapor de nitrogênio e, finalmente de -45ºC para o nitrogênio líquido a -196ºC. Para avaliação da viabilidade do congelamento dois dias seguinte ao mesmo, foi realizado o descongelamento de cinco tubos de cada crioprotetor, os quais foram examinados ao microscópio óptico para verificação de formas viáveis. Uma alíquota de 100mL foi repicada em caldo TYI-S-33 a 37ºC em aerobiose por 48 horas para observação da presença de crescimento. Por fim, os mesmos parâmetros de avaliação da amostra foram realizados aos 6, 12, 18 e 26 meses após o congelamento.

O efeito do antibiótico e do fungicida foi altamente positivo logo no primeiro tratamento. Nos demais subcultivos para axenização das amostras, nenhum crescimento de fungos e/ ou bactérias foi observado. No teste de esterilidade observou-se ausência de microrganismos contaminantes e crescimento satisfatório de T. foetus.

Na avaliação, realizada dois dias após o descongelamento e aos 6, 12, 18 e 26 meses, foi observado um grande número de formas vivas e com boa movimentação ao exame microscópico, bem como após o cultivo das amostras, o que sugere que o microrganismo continuava viável nos intervalos de tempo testados. O congelamento foi viável em 60% e 90% dos criotubos congelados com glicerol a 10% e DMSO a 12%, respectivamente.

Levine et al (1962) mantiveram organismos viáveis por três meses na presença de glicerol a –28ºC e –95ºC, e observaram que a porcentagem de sobreviventes e a motilidade dos mesmos foi melhor após armazenamento a –95ºC. Levine e Andersen (1966) recuperaram amostras de T. foetus após estocagem por 5,6 anos a -95ºC, verificando a redução da viabilidade dos organismos congelados. Diamond (1957) relatou a recuperação do T. foetus após armazenamento à – 170ºC em vapor de nitrogênio líquido por 1013 dias. Campero (1989) manteve criopreservado a – 196ºC uma amostra durante sete meses e três amostras durante seis meses utilizando DMSO a 10%, recuperando 65 a 85% dos parasitos, respectivamente.

A recuperação das amostras de T. foetus até 26 meses após o congelamento a –196ºC demonstra que longos períodos de estocagem são possíveis a baixas temperaturas, corroborando com estudos anteriores (DIAMOND, 1957; CAMPERO, 1989; MATSUO, 2007). O presente estudo demonstrou ainda que a estocagem em DMSO a 10% é melhor que a em glicerol a 12%, nos períodos de tempos testados. Conforme mencionado anteriormente, a manutenção de amostras axênizadas de T. foetus por meio de cultivo, é um processo laborioso que requer sub-cultivos constantes, em torno de duas a três por semana, além de existir a possibilidade de variação antigênica ou perda da patogenicidade original devido a contínuas passagens em meio de cultura (CAMPERO, 1989).

Recebido em 25 de outubro de 2007

Aceito para publicação em 09 de dezembro de 2008

• BONDURANT, R.H. Venereal diseases of cattle: natural history, diagnosis, and the role of vaccines in their control. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, v. 21, n. 2, p.383-408, 2005.
• CAMPERO, C.M. Use of DMSO for the cryopreservation of Trichomonas foetus in liquid nitrogen. Veterinary Parasitology, v.31, n.3-4, p.339-343, 1989.
• DIAMOND, L.S. The establishment of various trichomonads of animals and man in axenic cultures. Journal of Parasitology, v. 43, n.4, p.488-499, 1957.
• DIAMOND, L.S.; HARLOW, D.R.; CUNNICK, C.C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.72, n.4, p.431-432, 1978.
• GUIDA, H.G.; MEDEIROS, P.M.; PIZELLI, G.N. Conservação do Tritrichomonas foetus no meio de Rieck modificado Rio de Janeiro: DNPA-MA, 1960.7p. (Publicação n.35)
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• MATSUO, J. A simple and rapid method for cryopreservation of Trichomonas vaginalis Parasitology Research, v.101, n. 4, p.907-911, 2007.
• RAE, D.O.; CREWS, J.E. Tritrichomonas foetus. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, v. 22, n.3, p.595-611, 2006.
• SCHWEBKE, J.R.; BURGESS, D. Trichomoniasis. Clinical Microbiology Reviews, v.17, n.4, p.794-803, 2004.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Fev 2012
• Data do Fascículo
  Set 2008

Histórico

• Aceito
  09 Dez 2008
• Recebido
  25 Out 2007