Vigilância da leishmaniose cutânea em amostras clínicas: distribuição da Leishmania guyanensis no estado do Amapá, 2018^*

Vigilancia de la leishmaniasis cutánea en muestras clínicas: distribución de la Leishmania guyanensis en el estado de Amapá, Brasil, 2018

Resumo

Objetivo:  investigar as espécies de Leishmania em uma série de casos de leishmaniose cutânea (LC) autóctones do estado do Amapá, Amazônia brasileira.

Métodos:  estudo descritivo realizado em centro de referência para o diagnóstico da LC no Amapá, de janeiro a outubro/2018; foram recrutados indivíduos com LC atendidos de janeiro a maio/2018; obtiveram-se dados clínicos e biópsias de pele; do DNA extraído (fenol-clorofórmio), amplificou-se a região gênica hsp70-234 (PCR) para sequenciamento nucleotídico (Applied Biosystems: ABI3500XL).

Resultados:  entrevistados, examinados e diagnosticados 38 indivíduos, predominaram homens (28/38; idade média=32,5±11,3); lesões (ulceradas: 37/38), medindo 0,4-10mm (34/38) e ≥11mm (4/38), eram múltiplas em 20/38 indivíduos; diagnóstico de L. braziliensis (1), L. naiffi (1), L. infantum (1), L. (Viannia) sp. (1), L. amazonensis (2) e L. guyanensis (32); indivíduos infectados com L. guyanensis (32/38) viviam em 9/10 municípios considerados na casuística, e destes, 17/32 apresentavam múltiplas lesões.

Conclusão:  predominância de Leishmania guyanensis, frequentemente associada a múltiplas lesões.

Palavras-chave: Leishmaniose Cutânea; Leishmania guyanensis; Epidemiologia Molecular; Ecossistema Amazônico; Epidemiologia Descritiva

Resumen

Objetivo:  investigar las especies de Leishmania en una serie de casos de leishmaniasis cutánea (LC) autóctonas del estado de Amapá, Amazonía brasileña.

Métodos:  estudio descriptivo realizado en un centro de referencia para el diagnostico de la LC en Amapá, en enero-octubre/2018; fueron seleccionados individuos con LC asistidos en enero-mayo/2018; se obtuvieron datos clínicos y biopsias de piel; del ADN extraído (fenol-cloroformo), se amplificó la región génica hsp70-234 (PCR) para secuenciación nucleótida (Applied Biosystems: ABI3500XL).

Resultados:  fueron entrevistados, examinados y diagnosticados 38 individuos; predominaron hombres (28/38; edad promedio=32,5±11,3); lesiones (principalmente úlceras: 37/38) midiendo 0,4-10mm (34/38) y ≥11mm (4/38) eran múltiples en 20/38 individuos; diagnóstico de L. braziliensis (1), L. naiffi (1), L. infantum (1), L. (Viannia) sp. (1), L. amazonensis (2) y L. guyanensis (32); los individuos infectados con L. guyanensis (32/38) vivían en 9/10 municipios considerados en la casuística, y de estos, 17/32 presentaban múltiples lesiones 17/32.

Conclusión:   predominio de Leishmania guyanensis, frecuentemente asociada a múltiples lesiones.

Palabras clave: Leishmaniasis Cutánea; Leishmania guyanensis; Epidemiología Molecular; Ecosistema Amazónico; Epidemiología Descriptiva

Abstract

Objective:  to investigate Leishmania species in a series of autochthonous cutaneous leishmaniasis (CL) cases in Amapá State, Brazilian Amazon.

Methods:  this was a descriptive ecological study carried out from January-October/2018 at a reference center for CL diagnosis in Amapá; individuals with CL receiving care from January-May/2018 were recruited; clinical data and skin biopsies were obtained; from extracted DNA (phenol-chloroform) we amplified the hsp70-234 gene region (PCR) for nucleotide sequencing (Applied Biosystems: ABI3500XL).

Results:  38 individuals were interviewed, examined and diagnosed; men predominated (28/38; mean age=32.5±11.3); lesions (most ulcers: 37/38) measuring 0,4-10mm (34/38) and ≥11mm (4/38) were multiple in 20/38 individuals; diagnosis of L. braziliensis (1), L. naiffi (1), L. infantum (1), L. (Viannia) sp. (1), L. amazonensis (2) and L. guyanensis (32); individuals infected with L. guyanensis (32/38) lived in 9/10 municipalities represented in the sample, and 17/32 of these had multiple lesions.

Conclusion:  presence of Leishmania guyanensis predominated and was frequently associated with multiple lesions.

Keywords: Leishmaniasis, Cutaneous; Leishmania guyanensis; Molecular Epidemiology; Amazonian Ecosystem; Epidemiology, Descriptive

Introdução

As leishmanioses, doenças tropicais negligenciadas, são causadas por protozoários do gênero Leishmania e apresentam duas formas clínicas principais: leishmaniose tegumentar (LT), cutânea e/ou mucosa; e leishmaniose visceral (LV).¹

De 2007 a 2015, foram registrados 6.801 casos de leishmaniose cutânea (LC) no estado do Amapá.² A LC pode evoluir para formas graves, embora não fatais. Contudo, entre 2017 e 2018, a Superintendência de Vigilância em Saúde do Amapá registrou três óbitos de pacientes com LC em tratamento com o medicamento Glucantime^®3 e 19 casos de LV canina.⁴ Ainda em 2018, confirmou-se o primeiro caso de LV humana autóctone no estado: indivíduo ribeirinho, com 82 anos de idade, infectado no município de Mazagão, ido a óbito por complicações de cirrose hepática.⁴

A vigilância da LV, causada pelo agente etiológico Leishmania infantum, favorece o diagnóstico e o tratamento precoces, reduzindo o risco de morte. Entretanto, o óbito em portador de LC é incomum e, normalmente, decorre de comorbidades agravadas pela toxicidade do Glucantime^®.⁵ Entre os agentes da LC, Leishmania braziliensis e, principalmente, Leishmania guyanensis, exibem resistência ao Glucantime^®, cujo uso prolongado eleva o risco de eventos adversos.⁶ A L. guyanensis ocorre no Norte do Brasil,^1,7,8 mas sua frequência e distribuição no Amapá são desconhecidas.

O objetivo desse estudo foi investigar as espécies de Leishmania em uma série de casos autóctones de leishmaniose cutânea no Amapá, em 2018.

Métodos

Realizou-se estudo descritivo em série de casos de LC. O Amapá possui 670 mil habitantes, distribuídos em 16 municípios.⁹ Banhado pelo oceano Atlântico, o estado faz fronteira com o Suriname e a Guiana Francesa ao norte, e com o estado do Pará ao sul. Em 2018, o coeficiente de detecção da LC no Amapá foi de 68,7/100 mil habitantes, com casos autóctones em 14 dos 16 municípios do estado.³ Insetos flebotomíneos, potenciais vetores de LC, são abundantes nessa sub-região amazônica,^8,10,11 endêmica para LC.^2,3

Para a coleta de dados, foram recrutados indivíduos atendidos no Centro de Referência em Doenças Tropicais do Amapá no período de janeiro a maio de 2018. Foram critérios de inclusão no estudo: homens e mulheres maiores de 12 anos de idade, com lesão primária sugestiva de LC há pelo menos duas semanas. Aqueles com contraindicação médica para anestesia e/ou biópsia ou com outro diagnóstico laboratorial foram excluídos.

As espécies de Leishmania identificadas na pesquisa foram avaliadas em relação às seguintes variáveis:

• a) sociodemográficas

• - sexo;

• - município de infecção;

• - idade média; e

• - faixas etárias;

• b) clínicas

• - número de casos;

• - tipo de lesão (úlcera; verrucosa);

• - diâmetro da lesão;

• - localização das lesões no corpo; e

• - manifestações clínicas predominantes (crosta, infecção secundária, lesões-satélites etc.).

A mensuração das variáveis e o diagnóstico de Leishmania basearam-se em critérios de vigilância das leishmanioses definidos na publicação de manual técnico pelo Ministério da Saúde,¹ e em técnicas moleculares.^12,13

Para confirmar a infecção, usou-se o exsudato da lesão, obtido por raspagem, para esfregaço em lâmina, corado pelo Giemsa, na pesquisa microscópica de amastigotas.¹ A caracterização de Leishmania realizou-se com DNA extraído da pele (fenol-clorofórmio). Para a coleta de pele, procedeu-se a biópsia em lesão com anestesia local (lidocaína a 2%). Manteve-se a amostra em frasco contendo 0,5mL de NET (NaCl 0,15mM; EDTA 50mM; Tris-HCl 0,1M/pH 7,5). Para assegurar a qualidade das amostras de pele/DNA extraído, manteve-se controle diário de temperatura (2-8^oC) em geladeira. Realizou-se a reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction [PCR]) e posterior sequenciamento do alvo de 234 pares de base, região gênica codificadora da proteína 70 de choque térmico no DNA de Leishmania (hsp70-234).¹²

Os ensaios realizados foram:

• a) Reação em cadeia de polimerase - PCR

• A PCR baseou-se em hsp70-234 de Leishmania, altamente sensível para detecção de DNA do protozoário e discriminação de espécies.¹² Condições do ensaio: Mix 50mL (Taq DNA polimerase 0,03U/µL; MgCl2 1,5mM; tampão KCl buffer Invitrogen^®; dNTPs 0,25mM; iniciadores F- 5’ GGA CGA GAT CGA GCG CAT GGT 3’ e R- 5’ TCC TTC GAC GCC TCC TGG TTG 3’, 0,2pM cada; DNA 3,0µL); desnaturação, anelamento e extensão (1x 94°C/5’; 32x 94°C/0,5’, 61^oC/1’ e 72^oC/1’); e extensão final (72°C/10’). O resultado positivo confirma presença de DNA de Leishmania na lesão, pois significa amplificação do fragmento gênico hsp70-234.¹²

• b) Sequenciamento de DNA

• Este procedimento identifica a sequência de bases nucleotídicas da região gênica hsp70-234, confirmando a distinção entre espécies de Leishmania ao compará-la com sequências bem caracterizadas, disponíveis no GenBank. Para tanto, os produtos da PCR-hsp70-234 foram purificados (illustra ExoProStar; GE Healthcare Life Science) e sequenciados (forward e reverse) no analisador automático de DNA ABI3500XL, com o BigDye ^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Na análise de sequências, utilizou-se o programa BioEdit e o aplicativo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).¹³ Amostras-controle foram DNA de L. braziliensis (MHOM/BR/1975/M2904), L. guyanensis (MHOM/BR/1975/M4147), L. lainsoni (MHOM/BR1881/M6426), L. shawi (MCEB/BR/1984/M8408), L. naiffi (MDAS/BR/1979/M533) e L. amazonensis (IFLA/BR/1968/PH8).

Para tabelas de frequências e cálculos da média e desvio-padrão, utilizou-se o software BioStat 5.0 (disponível em: www.mamiraua.org.br).

O projeto do estudo teve aprovação dos Comitês de Ética da Universidade Federal do Amapá (Certificado de Apresentação para Apreciação Ética [CAAE] n^o 57036716.0.0000.0003, aprovado em 22/08/2016) e do Instituto Evandro Chagas (CAAE n^o 57036716.0.3001.0019, aprovado em 03/10/2016).

Resultados

Foram incluídos 38 indivíduos com LC, sendo 28 homens e 10 mulheres com idades de 13 a 81 anos e média de 34,4 anos (desvio-padrão: 14,2), residentes em dez municípios do Amapá. Destes municípios, Mazagão referiu o maior número de casos (n=13). O agente etiológico mais frequente entre os participantes foi a Leishmania guyanensis (32/38). Aspectos clínico-demográficos e etiologia dos casos de LC são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1
- Aspectos sociodemográficos e etiologia da leishmaniose cutânea em homens e mulheres de uma série de casos da doença no estado do Amapá, 2018

Variáveis	Sexo		Total n=38
	Masculino n=28	Feminino n=10
Faixa etária (em anos)
12|- 20	3	3	6
20|-30	9	1	10
30|-40	9	1	10
40|-50	5	3	8
50|-60	2	1	3
60|-81	-	1	1
Média de idade (desvio-padrão)	32,5 (11,3)	39,9 (19,9)	34,4 (14,2)
Município de infecção
Mazagão	10	3	13
Porto Grande	3	4	7
Serra do Navio	5	-	5
Tartarugalzinho	3	-	3
Laranjal do Jari	3	-	3
Santana	-	2	2
Oiapoque	2	-	2
Ferreira Gomes	1	-	1
Pedra Branca do Amapari	1	-	1
Calçoene	-	1	1
Diagnóstico molecular (espécie Leishmania) a
Leishmania (Viannia) guyanensis	23	9	32
Leishmania (Leishmania) amazonensis	2	-	2
Leishmania (Viannia) braziliensis	1	-	1
Leishmania (Viannia) naiffi	1	-	1
Leishmania (Leishmania) infantum	-	1	1
Leishmania (Viannia) sp	1	-	1

• a) Diagnóstico molecular baseou-se na reação em cadeia de polimerase (PCR) e no sequenciamento da região gênica hsp70-234 de Leishmania.

Quanto ao número de lesões, 20 indivíduos apresentaram lesões múltiplas e 18 lesão única. Em 37/38 casos, as lesões foram do tipo úlcera, a maioria com diâmetro de 5 a 6cm, localizadas, predominantemente, em membros superiores (n=9) e inferiores (n=11). As manifestações clínicas predominantes foram crosta, infecção secundária e lesões-satélite. As características das lesões dos indivíduos com LC e os respectivos agentes etiológicos identificados após sequenciamento e análise da região gênica Hsp70-234 de Leishmania são descritos na Tabela 2.

Tabela 2
- Características das lesões observadas em indivíduos com leishmaniose cutânea (n=38) e respectivos agentes etiológicos, identificados após sequenciamento e análise da região gênica hsp70-234 de Leishmania, Amapá, 2018

Variáveis	Espécies de Leishmania
	Leishmania guyanensis	Leishmania amazonensis	Leishmania braziliensis	Leishmania naiffi	Leishmania infantum	Leishmania (Viannia)sp	Total (n)
Número
Única	15	1	1	1	-	-	18
Múltiplas	17	1	-	-	1	1	20
Tipo
Úlcera	32	2	1	1	-	1	37
Verrucosa	-	-	-	-	1	-	1
Diâmetro (em cm)
0,4|-2	5	1	-	1	-	1	8
2|-4	4	-	1	-	-	-	5
4|-6	9	1	-	-	-	-	10
6|-8	5	-	-	-	1	-	6
8|-10	5	-	-	-	-	-	5
10|-	4	-	-	-	-	-	4
Localização
Cabeça/face	-	-	-	1	-	-	1
Tronco	2	-	-	-	-	-	2
Membros superiores	7	1	1	-	-	-	9
Membros inferiores	11	-	-	-	-	-	11
Cabeça e tronco	1	-	-	-	-	-	1
Cabeça, membros superiores e inferiores	2	-	-	-	-	-	2
Cabeça, tronco e membros inferiores	1	-	-	-	-	-	1
Tronco e membros superiores	1	-	-	-	-	-	1
Tronco e membros inferiores	4	-	-	-	-	-	4
Membros superiores e inferiores	3	1	-	-	1	1	6
Manifestações clínicas predominantes (tipos) a
Crosta	16	-	-	1	-	1	18
Infecção secundária	9	-	-	-	-	1	10
Lesões-satélite	5	1	-	-	-	-	6
Linfangite	5	-	-	-	-	-	5
Linfadenopatia	2	-	-	-	-	-	2
Fibrose	1	-	-	-	-	-	1
Cefaleia	1	-	-	-	-	-	1
Erisipela	1	-	-	-	-	-	1

• a) Um ou mais tipos de manifestações associadas ocorreu, eventualmente, no mesmo indivíduo portador de LC.

O presente estudo contém o primeiro relato de L. infantum associada a LC no Amapá: mulher, 35 anos de idade, infectada no município de Porto Grande, com múltiplas lesões cutâneas verrucosas pelo corpo, de tamanhos variados, inclusive em coxas e pernas, sem doença visceral.

Discussão

O agente etiológico mais frequente, entre as cinco espécies identificadas em indivíduos com LC no Amapá, foi a L. guyanensis: 32 dos 38 casos analisados. O marcador hsp70-234 de Leishmania discrimina seis patógenos na Amazônia.^12,14 A especificidade da hsp70-234 não foi previamente avaliada para L. lindenbergi, o sétimo patógeno causador de LC humana na Amazônia.⁸ Certas espécies de Leishmania identificadas neste estudo merecem destaque: (i) Leishmania amazonensis, que além da LC localizada, pode provocar leishmaniose difusa anérgica, raramente curável; e (ii) Leishmania guyanensis e L. braziliensis, as quais induzem lesões cutâneas/mucosas de difícil resolução,^1,15 com alto grau de hipersensibilidade, inclusive surgidas meses ou anos após a cura clínica da lesão primária.¹ Somente um longo acompanhamento médico garantiria eficácia no diagnóstico e tratamento de recidivas.¹⁵ Mesmo na ausência de envolvimento mucoso, conhecer o patógeno permite definir um prognóstico.

Indivíduos com LC por L. braziliensis e L. naiffi tinham úlcera única. A Leishmania braziliensis é amplamente distribuída no Brasil.¹ A infecção por L. naiffi em humanos se limitava aos estados do Amazonas, Acre, Pará, Rondônia e Mato Grosso,¹⁶ sem complicações relatadas, até o presente estudo revelar o primeiro caso de LC por L. naiffi no Amapá.

A L. infantum é filogeneticamente próximo à Leishmania donovani, agente de LV e leishmaniose dérmica pós-calazar no Velho Mundo;¹⁷ a ocorrência de lesões cutâneas por L. infantum em imunocompetentes é incomum nas Américas, sobretudo no Brasil.^14,18

Em africanos com LC, isolou-se L. infantum da pele, com lesão histologicamente distinta da provocada por Leishmania major.¹⁹ Desde 2015, casos de LC por L. infantum são registrados em diferentes estados brasileiros.^14,18 Na África ou nas Américas, as características clínicas da LC variam segundo o agente etiológico.^1,19 Este estudo destaca o pleomorfismo da LC por L. infantum, alertando sobre a necessária atenção ao diagnóstico precoce²⁰ e, nesse sentido, a importância da vigilância para a prevenção também da LV humana no Amapá.

Focos da LC no Amapá são identificados principalmente em áreas de assentamento agrícola, extrativismo vegetal e garimpo,² onde são mais atingidos pela infecção homens em idade produtiva. A maioria dos indivíduos analisados apresentava múltiplas lesões primárias, sugerindo diversas picadas do vetor, um comportamento reconhecido do Nyssomyia umbratilis, agente transmissor da L. guyanensis.^1,8 Nesses casos, tratamentos prolongados com Glucantime^® seriam necessários; entretanto, há expressiva morbidade e inclusive óbitos associados à toxicidade deste quimioterápico.^3,5,21,22

Embora o Glucantime^® seja a primeira opção de fármaco para LC no Brasil, recomenda-se Isotionato de Pentamidina^® onde houver predomínio de L. guyanensis.¹ Os doentes infectados com L. guyanensis provinham de nove dos dez municípios considerados na casuística, sugerindo ampla distribuição da espécie no Amapá, onde a fauna de vetores é exuberante.^8,10,11

A infecção de L. braziliensis e L. guyanensis pelo vírus de RNA de Leishmania subtipo 1, observada no Peru, Bolívia, Guiana Francesa, Suriname e Brasil, explicaria a alta virulência e resistência dessas espécies à droga.²³ O monitoramento de fatores biológicos da LC faz-se necessário, sobretudo nas regiões de fronteiras.

Em relação ao tratamento, em 2017, o Isotionato de Pentamidina^® foi considerado preferencial em relação ao Glucantime^® para tratamento sistêmico da LC em áreas onde predomina a L. guyanensis no Brasil. Na presença de (i) insuficiência renal, cardíaca e hepática, (ii) transplantados renais, cardíacos e hepáticos, (iii) gestantes e pessoas acima de 50 anos de idade, recomenda-se o uso da Anfotericina B^® lipossomal. O Glucantime^® seria primeira opção apenas para uso intralesional nessas áreas.¹ Os resultados encontrados por este trabalho fundamentam as novas orientações terapêuticas para tratamento da LC no Amapá, adotadas a partir de 2018.²⁴

Conclui-se haver predominância de infecção por L. guyanensis no Amapá, frequentemente associada a múltiplas lesões, adicionalmente aos primeiros relatos da presença de Leishmania naiffi e de L. infantum em amostras clínicas de LC no estado do Amapá.

Agradecimentos

À Dra. Inês Celeste Ribeiro Martins, diretora do Centro de Referência em Doenças Tropicais do Amapá (CRDT-AP), e ao Dr. Aldo Aparecido Proietti Júnior, Coordenador do Laboratório Especial de Microbiologia Aplicada da Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), pelo apoio à pesquisa, disponibilidade de espaços e condições necessárias para a realização do trabalho no CRDT/AP e para a adequada estocagem de amostras na UNIFAP.

Referências

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• *
  A pesquisa contou com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amapá (FAPEAP) - Processo no 250.203.039/2016 - e com uma bolsa de doutorado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (FAPESPA) - Processo no 003/2014.

Editado por

• Editora associada: Maryane Oliveira Campos - orcid.org/0000-0002-7481-7465

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Fev 2020
• Data do Fascículo
  2020

Histórico

• Recebido
  09 Fev 2019
• Aceito
  29 Jun 2019