Identificação de espécies de Candida e susceptibilidade antifúngica in vitro: estudo de 100 pacientes com candidíases superficiais

Resumos

BACKGROUND: Yeasts of the genus Candida create colonization, superficial infections and systemic infections in immunodeficient individuals. The presentations of the disease lead to the necessity of using various diagnostic methods and treatments. OBJECTIVES: To differentiate among the Candida species, correlate them with the anatomical region involved and evaluate in vitro susceptibility to ketoconazole, fluconazole, itraconazole and amphotericin B. METHODS: An evaluation of 100 cases of immunocompetent patients with cutaneous or mucous candidiasis attended at the Santa Casa de Sao Paulo Hospital from May 1999 to July 2001. This study attempted to correlate the site of the involvement and the Candida species, isolated using the CHROMagar Candida® technique. The species were evaluated using the Etest® antifungal susceptibility to ketoconazole, fluconazole, itraconazole and amphotericin B. RESULTS: C. albicans was isolated in 76% of the material, C. krusei in 19% and C. tropicalis in 1%. It was not possible to establish a significant correlation between the involved area and the species isolated. Most of the samples proved to be susceptible to the antifungals tested. CONCLUSIONS: C. albicans was the most commonly observed species. The majority of samples presented susceptibility to the tested antifungals.

Candida albicans; Candida tropicalis; Candidiasis, Cutaneous; Itraconazole

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Identificação de espécies de Candida e susceptibilidade antifúngica in vitro: estudo de 100 pacientes com candidíases superficiais^*

Elisete I. Crocco^I; Lycia M. J. Mimica^II; Laura H. Muramatu^III; Cristina Garcia^IV; Valéria M. Souza^V; Ligia R. B. Ruiz^VI; Clarisse Zaitz^VII

^IMédica em especialização em Dermatologia pela Clínica de Dermatologia — Departamento de Medicina — Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^IIProfessora assistente do Serviço de Microbiologia — Departamento de Patologia — Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^IIIBiomédica da Clínica de Dermatologia — Departamento de Medicina — Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^IVBiomédica do Serviço de Microbiologia — Departamento de Patologia — Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^VMédica assistente do setor de doenças infecciosas da Clínica de Dermatologia - Departamento de Medicina - Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^VIMédica voluntária do setor de doenças infecciosas da Clínica de Dermatologia — Departamento de Medicina — Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^VIIProfessora adjunta responsável pelo setor de doenças infecciosas da Clínica de Dermatologia — Departamento de Medicina — Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTO: Leveduras do gênero Candida determinam colonização, infecções superficiais e infecções sistêmicas em imunodeprimidos. As várias apresentações da doença levam à necessidade de utilizar diferentes métodos diagnósticos e tratamentos.

OBJETIVOS: Diferenciar as espécies de Candida e correlacioná-las com as regiões anatômicas. Avaliar a susceptibilidade a cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B.

MÉTODOS: Foram avaliados 100 pacientes imunocompetentes com candidíase cutânea ou mucosa atendidos na Santa Casa de S. Paulo entre maio de 1999 e julho de 2001. Correlacionou-se a região acometida e a espécie de Candida, isolada através técnica CHROMagar Candida^®. Avaliou-se a susceptibilidade das espécies a cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B, através do Etest^®.

RESULTADOS:C. albicans foi isolada em 76,0% dos materiais, C. krusei em 19% e C. tropicalis em 1%. Não houve correlação significante entre a região acometida e as espécies. A maioria das amostras mostrou susceptibilidade aos antifúngicos.

CONCLUSÃO:C. albicans foi a espécie mais observada. A maioria das amostras de Candida mostrou-se susceptível aos antifúngicos.

Descritores:Candida albicans; Candida tropicalis; Candidíase cutânea; Itraconazol.

INTRODUÇÃO

A candidíase expressa a variedade de relações que ocorrem entre hospedeiro e microbiota autóctone, isto é, do comensalismo à doença sistêmica fatal.¹ Leveduras do gênero Candida são responsáveis pela colonização, por infecções fúngicas superficiais em imunocompetentes e por infecções sistêmicas em imunodeprimidos. A variedade de apresentações da doença leva à necessidade de utilização de diferentes métodos diagnósticos e esquemas terapêuticos.

Candida albicans é o patógeno mais comum nas candidíases cutâneas e da orofaringe, porém as espécies não albicans têm aumentado em número e em importância nas candidíases vaginal e sistêmica.²

A variabilidade de comportamento das diferentes espécies de Candida criou a necessidade de desenvolvimento de métodos rápidos e fáceis para sua identificação. O Chromagar Candida^® mostrou-se método sensível além de específico para identificação presuntiva das espécies mais comumente isoladas de leveduras do gênero Candida.^3,4,5

Muitas das espécies não albicans mais comumente isoladas são menos susceptíveis aos derivados azólicos, dificultando o tratamento dessas infecções. Embora a susceptibilidade das leveduras do gênero Candida aos antifúngicos disponíveis seja variável e previsível, nem sempre uma determinada amostra isolada segue o padrão geral. Essa é uma das razões da crescente importância dos testes de susceptibilidade. O esforço para a padronização desses testes culminou na elaboração da metodologia M27-A do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).^2,6

Etest^®, utilizado para aferir in vitro a susceptibilidade aos antifúngicos, é método comparável ao M27-A do NCCLS, porém mais simples e de fácil incorporação à rotina laboratorial.^4,7,8,9

MATERIAL E MÉTODOS

Foram avaliados 100 pacientes com infecções cutâneas ou mucosas causadas por leveduras do gênero Candida, atendidos no Ambulatório da Clínica de Dermatologia ou internados nas Enfermarias de Medicina da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, no período de maio de 1999 a julho de 2001.

Foram incluídos pacientes de ambos os sexos, de qualquer raça e de todas as faixas etárias que tiveram leveduras do gênero Candida recuperadas de suas lesões. Não foram incluídos pacientes com qualquer tipo de imunodepressão ou com infecções mistas ao exame direto. Os pacientes incluídos no estudo foram agrupados conforme as regiões acometidas pelas lesões.

Firmou-se o diagnóstico de candidíase mediante exame direto clarificado com hidróxido de potassa a 20% em solução aquosa de DMSO, por visualização de leveduras e/ou pelo menos dois crescimentos, ou seja, duas semeaduras do mesmo material, em culturas realizadas em meio de ágar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol.^1,10

Para a identificação das espécies de levedura do gênero Candida isoladas utilizaram-se placas com meio cromogênico — Chromagar Candida^®, (Probac do Brasil^®, São Paulo). Após semeadura da cepa nesse meio há alteração da coloração da colônia dependendo da espécie de Candida isolada. Após 48 horas de incubação a 30-37ºC, é possível a identificação de: Candida albicans, que se torna esverdeada, Candida krusei, rósea, Candida tropicalis, azul-acinzentada, e as demais espécies, róseo-esbranquiçadas (Figura 1).¹⁰

As espécies isoladas foram agrupadas, procurando-se correlacioná-las com a região acometida. Para avaliar a susceptibilidade in vitro das espécies isoladas foi utilizado o Etest^® (AB Biodisk, Solna, Suécia^®), método com gradiente predefinido de concentração para cetoconazol, itraconazol, fluconazol e anfotericina B, determinando a concentração inibitória mínima (MIC) em µg/ml para cada antifúngico. Nesse método as colônias são semeadas em RPMI^® (Probac do Brasil^®, São Paulo), um meio composto por meio RPMI 1640, Mops, e 2% de ágar glicose (Figura 2).¹¹ As placas ficam incubadas em estufa de câmara úmida a 35ºC por 48 horas após a semeadura, quando a leitura é realizada, avaliando o ponto de intersecção entre o halo formado e a fita do Etest^®. Segundo os critérios do NCCLS,⁶ o perfil de sensibilidade da espécie ao antifúngico deve ser classificado como sensível, intermediário e resistente, de acordo com a tabela 1.

Para a análise estatística da estimativa da freqüência das diferentes espécies de leveduras do gênero Candida no grupo estudado, foi utilizado o cálculo de porcentagens com os respectivos limites de confiança. Para correlacionar as variantes clínicas/regiões acometidas com a espécie de Candida isolada foi utilizado o teste bimodal de Fisher. Realizou-se estudo descritivo para demonstrar a susceptibilidade in vitro dessas espécies aos antifúngicos cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B.

O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética médica da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.

RESULTADOS

Dos 100 pacientes avaliados apenas seis estavam internados. A amostra era constituída em sua maior parte por mulheres, da raça branca e com idade entre 41 e 60 anos. As características demográficas do grupo estudado encontram-se na tabela 2.

Os resultados relativos à identificação das espécies de levedura do gênero Candida por meio do Chromagar Candida® podem ser observados na tabela 3.

Não foi possível estabelecer correlação significante entre as regiões acometidas e as espécies isoladas através do teste bimodal de Fisher. Os resultados encontrados podem ser visualizados na tabela 4.

A tabela 5 mostra o acometimento cutâneo pelas diferentes espécies de leveduras do gênero Candida, evidenciando nítida predominância de acometimento das unhas das mãos.

A tabela 6 mostra o comportamento das espécies de Candida albicans isoladas das lesões dos pacientes estudados. A maioria delas mostrou-se susceptível aos antifúngicos testados.

A tabela 7 mostra o comportamento das espécies de Candida krusei isoladas das lesões dos pacientes estudados. As espécies de Candida krusei mostraram-se mais susceptíveis (94,7%) à anfotericina B do que aos demais antifúngicos.

DISCUSSÃO

A maioria dos pacientes avaliados foi atendida na Clínica de Dermatologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. A clientela da Clínica é constituída predominantemente por mulheres. As características demográficas do grupo estudado podem estar, em parte, relacionadas com o perfil dos pacientes que freqüentam a Clínica.

Leveduras do gênero Candida são comumente encontradas nas unhas. Candida albicans é o patógeno mais comum. Candida tropicalis, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida guilliermondii são encontradas com menor freqüência.¹² As leveduras do gênero Candida podem comportar-se como patógeno primário, invadindo a unha normal principalmente em pacientes com candidíase mucocutânea crônica e pacientes aidéticos. Já em pacientes imunocompetentes, freqüentemente são patógenos secundários, invadindo a unha previamente alterada por trauma, hiper-hidratação ou irritação por contacto com substâncias químicas. Esses casos apresentam-se clinicamente como onicólise ou paroníquia. Podem também atuar como patógenos secundários em unhas acometidas por psoríase e líquen plano e por outras dermatoses.¹²

O acometimento das unhas em 60% dos pacientes estudados é esperado tanto pelo fato de as leveduras do gênero Candida em unhas de pacientes imunocompetentes serem secundárias ao trauma, hiper-hidratação (exposição continuada à água) ou irritação por contacto com substâncias químicas (produtos de limpeza), que são mais comuns em mulheres, como pelo perfil do grupo estudado: predominantemente feminino.

É sabido que Candida albicans é o patógeno mais comum nas candidíases cutâneas e de orofaringe.² No entanto, são raras as publicações em grupos de imunocompetentes que estudam a freqüência das espécies de Candida, sua correlação com as regiões acometidas e a susceptibilidade dessas espécies aos antifúngicos. Em pacientes imunodeprimidos, principalmente em grupo de aidéticos, esses estudos são muito comuns.

Estudo brasileiro multicêntrico isolou Candida albicans em 91% das amostras de orofaringe de pacientes aidéticos. As espécies não albicans isoladas em freqüência decrescente foram: C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei.¹³

Para o isolamento das espécies de leveduras do gênero Candida optou-se pela utilização do Chromagar Candida^® por tratar-se de método susceptível e específico. Candida albicans foi isolada em 76%, Candida krusei em 19%, e Candida tropicalis em 1% dos pacientes avaliados, totalizando 96% dos isolamentos. Todas as demais espécies corresponderam a apenas 4% dos isolamentos. A predominância do isolamento de Candida albicans é o que se observa na literatura tanto em pacientes imunocompetentes com em imunodeprimidos.^2,13,14 A freqüência de isolamento e a prevalência das espécies não albicans isoladas nos diferentes estudos são variáveis.^13,14

Não foi possível estabelecer correlação significante entre as regiões acometidas e as principais espécies isoladas. Também não foram encontrados na literatura trabalhos que correlacionem as espécies isoladas e região acometida.

O National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing desenvolveu e padronizou uma metodologia com diluição em caldo para determinação da susceptibilidade de leveduras.⁶ Tanto a macrodiluição em caldo como o método da microdiluição foram publicados no documento do NCCLS M27-A, e atualizados em 2002 (M27-A2).

As espécies albicans, tropicalis e parapsilosis das leveduras do gênero Candida são susceptíveis aos antifúngicos anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo padrão geral de susceptibilidade (método M27-A NCCLS).² Pelo mesmo método, Candida lusitaniae é susceptível ao itraconazol e ao fluconazol, e pode variar a susceptibilidade ou ser resistente à anfotericina B, e, ainda, muitas das espécies isoladas de Candida krusei e Candida glabrata são resistentes a esses antifúngicos.²

O método do Etest^® foi avaliado e demonstrou ser uma alternativa aceitável aos métodos de referência.^4,7,8,9 Neste estudo, utilizando-se o Etest^®, a maioria das espécies de Candida albicans isoladas das lesões dos pacientes estudados mostrou-se susceptível aos antifúngicos testados. Estes resultados são concordantes com os encontrados na literatura relativos à avaliação de pacientes imunocompetentes.² São relatados casos de resistência da Candida albicans aos derivados azólicos em pacientes infectados pelo VIH (vírus da imunodeficiência humana) e em pacientes com candidíase invasiva.²

Em relação ao comportamento das espécies de Candida krusei isoladas das lesões dos pacientes estudados pelo Etest^®, observou-se maior susceptibilidade à anfotericina B do que aos demais antifúngicos. É conhecida a resistência intrínseca da Candida krusei ao fluconazol em especial e aos derivados azólicos em geral.^2,15

Em estudo de candidíase de orofaringe de pacientes aidéticos, o ranking de susceptibilidade aos derivados azólicos das espécies de leveduras do gênero Candida, de acordo com o método de microdiluição segundo o NCCLS, foi: Candida albicans > C. tropicalis > C. glabrata > C. krusei.¹³

CONCLUSÃO

Concluindo, no grupo de pacientes imunocompetentes predominantemente ambulatoriais com candidíases superficiais causadas por leveduras do gênero Candida estudados no período de maio de 1999 a julho de 2001 observou-se:

- 60% de acometimento nas unhas, onde a levedura se comportou provavelmente como patógeno secundário;

- isolamento de Candida albicans em 76%, de Candida krusei em 19%, e de Candida tropicalis em 1% das amostras;

- não foi possível estabelecer correlação entre as regiões acometidas e as espécies isoladas;

- susceptibilidade da maioria das espécies isoladas aos antifúngicos testados pelo Etest^®

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Fundação do Amparo à Pesquisa de São Paulo — Fapesp e à Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo pelo apoio.

Recebido em 27.01.2004

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 30.10.2004

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*

Trabalho realizado no Hospital Central da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo – Projeto financiado pela Fapesp. Processo 99/06792-7 – Outubro de 1999 a setembro de 2001.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Mar 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Recebido
  27 Jan 2004
• Aceito
  30 Out 2004