O tratamento com isoflavonas mimetiza a ação do estradiol no acúmulo de gordura em ratas ovariectomizadas

Treatment with isoflavones replaces estradiol effect on the tissue fat accumulation from ovariectomized rats

ARTIGO ORIGINAL

O tratamento com isoflavonas mimetiza a ação do estradiol no acúmulo de gordura em ratas ovariectomizadas

Treatment with isoflavones replaces estradiol effect on the tissue fat accumulation from ovariectomized rats

Rosana Torrezan^I; Rodrigo M. Gomes^II; Maria L. Ferrarese^III; Fernando Ben-Hur de Melo^I; Aparecida M. D. Ramos^I; Paulo C. F. Mathias^II; Dionizia X. Scomparin^II

^IDepartamento de Ciências Morfofisiológicas do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá (UEM)

^IIDepartamento de Biologia Celular e Genética do Centro de Ciências Biológicas da UEM

^IIIDepartamento de Bioquímica do Centro de Ciências Biológicas da UEM, Maringá, PR, Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: As isoflavonas (ISO) presentes na soja são consideradas fitoestrógenos. A administração de fitoestrógenos tem efeito benéfico nos distúrbios da pós-menopausa que são caracterizados pela suspensão da função ovariana com declínio da secreção de estrogênio e conseqüentes desajustes histomorfológicos e metabólicos. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da suplementação com ISO sobre a espessura do endométrio uterino, o acúmulo de gordura tecidual, o colesterol HDL e a glicose plasmática de ratas ovariectomizadas (OVX).

MÉTODOS: Ratas Wistar com 60 dias de vida sofreram cirurgia bilateral para retirada dos ovários. Após o período de 8 dias de recuperação foram divididas em três grupos: falso operada (GC), OVX não-tratadas com ISO (GI) e as OVX suplementadas com ISO (GII). Foram retirados e pesados o útero, as gorduras uterinas e retroperitoneais. Também foram coletadas amostras de sangue para dosagem da concentração de HDL e glicose.

RESULTADOS: A OVX promoveu atrofia do endométrio, diminuição do peso do útero e diminuição do HDL. O tratamento com ISO promoveu diminuição dos estoques de gorduras uterina e retroperitoneal, aumento de HDL e redução da glicemia, porém não teve efeito uterotrófico.

CONCLUSÕES: Os dados do presente estudo mostram que o tratamento com ISO promove redução da adiposidade, o que pode estar relacionado à redução da lipogênese e ao aumento da lipólise.

Descritores: Isoflavonas; Fitoestrógenos; Ovariectomia; Menopausa; Adiposidade

ABSTRACT

OBJECTIVE: Isoflavones (ISO) present in soybean are named phytoestrogens because they show estrogen effect. The use of isoflavones has beneficial effect in disturbance of post-menopause, which is characterized by ovarian function suppression. Decreasing of estrogen secretion and consequent morphologic and metabolic disarrangements are observed in female hormonal decline. The aim of present work was to investigate the effect of ISO on the fat accretion of uterin endometric tissue, and HDL and glucose blood concentration from ovariectomized rats (OVX).

METHODS: Female Wistar rats with 60 days-old were submitted a surgery to remove bilaterally the ovarium. After 8-day recovery period the animals were distributed into three groups: sham operate (GC); OVX ISO untreated (GI) and OVX supplemented with ISO (G II). Total uterus mass, uterus fat and retroperitoneal fat pad, were removed, washed and weighted. Samples of uterus were histological processed to measure endometrium thickness. Blood samples were also collected to analyze the concentration of HDL and glucose. The OVX caused endometric atrophy, decrease of uterus weight and HDL reduction. The treatment with ISO provoked decrease of uterin and retroperitoneal fat pad. HDL increase and glycemia reduction were also observed. However, there was no uterotrophic effect.

CONCLUSIONS: ISO treatment causes decrease in tissue fat accretion from ovariectomized rats.

Keywords: Isoflavones; Phytoestrogens; Ovariectomy; Menopause; Adiposity

INTRODUÇÃO

As isoflavonas (ISO) presentes na soja e seus derivados são denominados de fitoestrógenos por apresentarem semelhanças estrutural e funcional ao estradiol (1). Quando a soja e os seus produtos são consumidos, as ISO são hidrofilizadas no intestino delgado pela β-glicosidase intestinal. Esses fitoestrógenos são absorvidos ou fermentados pela microflora intestinal, e dão origem a seus metabólitos; daidzeína, gliciteína e genisteína, a qual é a mais abundante na soja e também a que apresenta maior ação estrogênica.

Uma parte das ISO absorvidas é transportada para o fígado, onde são removidas da circulação sanguínea por meio da veia porta, retornando ao intestino pela via biliar, podendo ser excretadas pelas fezes. Uma porcentagem, porém, chega até a circulação periférica, alcançando os tecidos (2).

Os fitoestrógenos se ligam aos receptores α e β do estrógeno e desencadeiam as mesmas ações do estrógeno nos tecidos-alvo (3). Embora o efeito estrogênico desses fitoestrógenos seja muito fraco (4) eles podem exercer efeito agonístico e/ou antagonístico sobre os β-estrogênios endógenos, por competirem pelos mesmos receptores. O efeito biológico das ISO varia de acordo com a fase biológica da mulher. Na pré-menopausa, quando a concentração de hormônios circulantes é alta, o resultado é a fraca ação estrogênica ou antiestrogênica. Na pós-menopausa, quando a concentração do estrogênio endógeno diminui, em média 60%, os receptores ficam mais disponíveis, favorecendo a ação estrogênica das ISO, que acabam compensando a deficiência do hormônio humano. Assim, além de proporcionarem melhora dos sintomas da menopausa, elas mantêm ação estrogênica positiva no metabolismo ósseo, no sistema nervoso central e no sistema cardiovascular (5-9).

Os estudos sobre a ação das ISO no útero de ratas ovariectomizadas (OVX) são bastante controversos. Geralmente feitos com a genisteína, a ISO de maior concentração na soja e seus derivados (10). A genisteína tem maior afinidade pelos receptores β-estrogênicos comparada com as outras ISO (11,12).

Vários estudos mostram que os fitoestrógenos, causam crescimento uterino, em animais intactos e OVX (12,13). Também foi observado que as ISO estimulam o crescimento de tumores responsivos ao estrogênio (14). A genisteína suplementada em ratas OVX (750 mg/kg de peso corporal) apresenta efeito estrogênico no útero, na glândula mamária e no eixo hipotálamo-hipofisário, por diminuir a secreção de prolactina (15).

A menopausa é caracterizada pela suspensão irreversível da função ovariana, com declínio da secreção estrogênica. A falta desse hormônio leva a alterações no perfil lipídico, em particular, aumento das lipoproteínas de baixa densidade (LDL), redução das lipoproteínas de alta densidade (HDL) e aumento na deposição de gordura (16). Assim, a administração de fitoestrógenos tem efeito benéfico no perfil lipídico e no metabolismo hepático, na diminuição da deposição de tecido adiposo branco e na proteção contra doenças cardiovasculares na pós-menopausa (2,17-20).

O tecido adiposo é responsivo ao estrogênio e expressa os receptores α e β para este hormônio em humanos e roedores (21-24). O receptor α para o estrogênio é o responsável pela modulação da lipogênese, no tecido adiposo (25), diminuindo a atividade da lipoproteína lipase (LPL), enzima que regula a captação de lipídios pelos adipócitos, sendo assim, a estimulação do receptor α provoca a redução do acúmulo de gordura (26). A administração de genisteína aumenta a expressão dos receptores para estrogênio, principalmente os do tipo α (15,27), o que reduz o aumento do tecido adiposo e do peso corporal de ratas OVX, mimetizando a ação do estradiol (28,29).

A atuação dos isoflavonóides sobre o receptor β-estrogênico, presente no fígado, tem como conseqüência a melhora do perfil lipídico, possibilitado pelo incremento no número de receptores hepáticos de colesterol LDL. Dessa forma, o catabolismo de colesterol é favorecido (30). A estimulação dos receptores β-estrogênicos leva à inibição da lipase hepática, que está envolvida no metabolismo de colesterol HDL, ocasionando seu incremento (31). A isoflavona também estimula a β-oxidação dos ácidos graxos em várias espécies animais, incluindo o homem (32).

Considerando os comentários anteriores, a dieta suplementada com ISO tem sido utilizada no tratamento da síndrome metabólica e da obesidade. Trabalhos revelam efeitos benéficos das ISO sobre a tolerância à glicose na obesidade e no metabolismo hepático. Banz e cols. (33) mostraram que ratos Zucker, geneticamente obesos, após o tratamento com ISO, apresentaram redução do peso corporal e do conteúdo de gordura, reduzindo o risco de lipotoxicidade hepática e, consequentemente, diminuindo o risco de esteatose (34).

Conhecendo os efeitos dos isoflavonóides sobre o crescimento uterino, metabolismo lipídico e tecido adiposo, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da administração de ISO sobre a espessura do endométrio uterino e o acúmulo de gordura em ratas OVX.

MÉTODOS

Animais e tratamento

Ratas virgens com 60 dias de idade foram obtidas do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá e mantidas no Biotério Setorial do Departamento de Ciências Morfofisiológicas por oito dias antes do início dos experimentos, com ração e água à vontade, e sob ciclo fotoperiódico constante de 12 horas de claro e 12 horas de escuro (das 7 às 19), em temperatura de 22 ± 2 ºC. Após a adaptação, o grupo foi submetido à ovariectomia bilateral e outro grupo foi falsamente operado. Após o período de recuperação, as ratas foram divididas em três grupos: grupo-controle falso-operado (GC, n = 6), grupo OVX não-suplementado com ISO (GI, n = 6) e grupo OVX suplementado com ISO (GII, n = 10). Para efetuar a cirurgia de retirada dos ovários, as ratas foram anestesiadas com a mistura ketamina (3,0 mg) e xilazina (0,6 mg) para cada 100 g de peso corporal. A cirurgia foi realizada seguindo procedimentos previamente descritos por Zarrow e cols. (35), respeitando as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea). As ISO, sob a forma de extrato, foram preparadas em suspensão com água, levando-se em consideração o fator de correção, conforme especificação da indústria farmacêutica (Pharma Nostra, Rio de Janeiro, Brasil), visando à administração real de 300 mg/kg de massa corporal/por dia, de suspensão com teor de ISO de 41,56%, dos quais 1,67% é daidzina; 2,05% genistina; 3,31% gliceteina; 3,35% glicetina; 7,93% daidizeina e 23,25% genisteína. As ISO foram administradas por gavagem, durante 21 dias consecutivos. Durante esse período, todos os animais receberam dieta comercial (Nuvital, Curitiba, Brasil), isenta de ISO, e água à vontade. Um grupo de ratas OVX recebeu a gavagem somente com água isenta de ISO. Após o período de suplementação com ISO, todos os animais foram sacrificados, os úteros e suas gorduras foram retirados, lavados com salina e pesados. Os fragmentos dos cornos uterinos foram isolados e processados com formalina e usados posteriormente para emblocamento em parafina. Os cortes foram preparados e corados com hematoxilina e eosina. Usando lente milimetrada foi aferida a espessura do endométrio uterino (36).

As gorduras retroperitoneais foram retiradas, lavadas em solução salina e pesadas. Também foram retiradas amostras de sangue para dosagem de colesterol HDL e da glicemia, no estado alimentado.

Determinação da concentração de colesterol HDL

O colesterol HDL foi determinado pelo método enzimático colorimétrico de colesterol-oxidase (Gold Analisa^®). Neste método, a colesterol-oxidase catalisa a oxidação do colesterol e produz peróxido de hidrogênio. Os resultados foram expressos em mg/dL.

Determinação da glicemia

A determinação dos níveis plasmáticos de glicose foi realizada em alíquotas de plasma, por meio da utilização de método enzimático colorimétrico da glicose-oxidase (Gold Analisa^®). A glicemia foi avaliada em animais alimentados. Os resultados foram expressos em mg/dL.

Analise estatística

Todos os grupos de animais foram estudados em paralelo. A comparação entre os diferentes grupos foi realizada empregando-se ANOVA. Quando as análises indicaram F significativo, as diferenças entre as médias foram testadas utilizando-se o teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer e o nível de significância adotado foi de p < 0,05.

RESULTADOS

Histomorfologia e peso uterino

A avaliação histomorfológica dos úteros (Figura 1) mostra que a OVX resultou redução de 55,01% na espessura do endométrio comparado ao grupo GC (p < 0,05), todavia, o tratamento com ISO não preveniu a atrofia induzida pela OVX (GII). A mesma redução foi observada para o peso dos úteros, 70,77% menor nas ratas OVX comparado às ratas falsamente operadas (Figura 2). A gavagem com água em ratas OVX não causou qualquer alteração comparada ao grupo de ratas OVX que não recebeu o tratamento com ISO (resultados não apresentados).

A retirada dos ovários não promoveu alteração no peso da gordura peri-uterina comparadas ao grupo-controle, todavia, a administração de ISO promoveu redução de 28,74% no peso da gordura peri-uterina das ratas OVX p < 0,01 (Figura 3).

Gordura retroperitoneal

A suplementação com ISO nas ratas OVX promoveu redução de 26,37% nos estoques de gordura retroperitoneal quando comparadas com o grupo GC, e 33,18% quando comparadas ao grupo GI p < 0,05 (Figura 4).

Colesterol HDL

Os resultados sobre concentração plasmática de colesterol HDL mostram que a eliminação da ação do estrogênio, por meio da OVX, causou redução significativa de 66,24% nos níveis de HDL, entretanto, o tratamento com ISO restabeleceu a concentração de HDL no nível dos animais-controle, em que o grupo GII apresentou valor médio 175,83% maior que o grupo GI (Figura 5).

Glicemia

A glicemia no estado alimentado não diferiu entre os grupos não-tratados com ISO, GC e GI, porém os animais que receberam suplementação com ISO do grupo GII, tiveram redução na glicemia de 33,97%, quando comparado aos animais do grupo GC e de 32,54%, quando comparado ao grupo GI (p < 0,05), como indica a Figura 6.

DISCUSSÃO

Os resultados histomorfológicos dos cornos uterinos e de pesos dos úteros do presente estudo deixam claro que o tratamento com ISO não teve ação uterotrófica sobre o endométrio das ratas OVX, considerando que as ISO não preveniram o efeito atrófico, causado pela ausência de estrogênio, em razão da ovariectomia. É importante ressaltar que o mesmo efeito foi obtido quando foram usadas doses de ISO maiores do que as usadas neste estudo(15).

Neste contexto, não obstante o conhecido efeito estrogênico das ISO, os resultados deste estudo e os de outros pesquisadores, indicam que, sobre o endométrio uterino, elas não apresentam qualquer efeito (37,39). Tal fato poderia derivar da não-responsividade das ISO dos receptores estrogênicos, presentes no endométrio. Foram realizados alguns estudos a respeito da afinidade das ISO aos receptores α e β-estrogênicos; a genisteína tem maior afinidade por receptores β-estrogênicos, enquanto o estrogênio interage mais facilmente com os receptores α-estrogênicos (11,12,40). Cotroneo e cols. (41) não constataram efeito da genisteína na dose de 250 mg/kg sobre os receptores α-estrogênicos. O principal receptor estrogênico do útero é o subtipo α, para o qual a genisteína tem baixa afinidade (11,40,27). Estas observações podem explicar a ausência de efeito uterotrófico das ISO, encontrado pelo grupo do presente estudo e por outros pesquisadores em ratas OVX. Reforçando estes achados, alguns estudos têm mostrado que as ISO apresentam ação seletiva, isto é, exibem atividade estrogênica em alguns tecidos e antiestrogênica em outros (42).

Os resultados do presente estudo mostram que o tratamento das ratas OVX com ISO promoveu redução significativa no acúmulo das gorduras peri-uterina e retroperitonial em comparação às ratas operadas e falsas-operadas que não receberam ISO. Esses resultados são semelhantes a dados da literatura, que relacionam o uso de ISO com menor acúmulo de tecido adiposo branco, indicando efeito antilipogênico (43-46).

A administração de estrogênio diminui o número e o tamanho de adipócitos, enquanto sua deficiência resulta aumento deles (47). Neste contexto, vários trabalhos têm sido realizados para investigar os efeitos benéficos dos fitoestrógenos sobre a adiposidade (15, 27-29).

A genisteína tem efeito direto sobre o metabolismo de lipídios no fígado e no tecido adiposo. As ISO, sobretudo a genisteína, aumentam a lipólise em adipócitos isolados de ratos, e diminuem a lipogênese no tecido adiposo branco de ratas OVX (48). A incubação de adipócitos de ratos com genisteína resultou inibição da conversão da glicose em lipídios na ausência ou na presença de insulina, com subseqüente redução da lipogênese (49,50). Outra ação da genisteína é a diminuição da expressão do RNA mensageiro da LPL no tecido adiposo, com conseqüente diminuição na deposição de gordura (44).

Todos os dados referentes à ação antilipogênica das ISO, descritos anteriormente, sugerem mecanismo de redução no acúmulo de gordura no tecido adiposo branco exercido pelo tratamento com ISO.

No presente estudo, ratas Wistar submetidas a OVX constituem modelo animal para os estudos das alterações pós-menopáusicas, como mudanças no perfil lipídico. A análise dos níveis sanguíneos do colesterol HDL mostrou que este foi menor no grupo OVX do que no grupo OVX tratado com ISO e no grupo-controle. Estes resultados indicam que as ISO apresentam efeitos positivos no perfil lipídico de ratas OVX. Esta observação é consistente com os relatos de vários pesquisadores, que também utilizaram como modelo experimental ratas OVX tratadas com ISO (48,51,52).

Não está esclarecido como as ISO agem para restabelecer as alterações lipídicas causadas pela menopausa. Contudo, tem sido proposto que a atuação das ISO, sobre receptores β-estrogênicos presentes no fígado, melhora o perfil lipídico por meio do incremento do número de receptores hepáticos do colesterol LDL, o que favorece o catabolismo de colesterol (17). A estimulação dos receptores β-estrogênicos levaria à inibição da lípase hepática, implicada no metabolismo do colesterol HDL, ocasionando seu incremento (31,48).

Os resultados do presente estudo indicam que as ratas tratadas com ISO apresentaram queda significativa na glicemia durante o estado alimentado. Reforçando os resultados, Lavigne e cols. (53) mostraram que ratos alimentados com soja apresentam menor área sob a curva da glicose e da insulina plasmáticas durante o teste de tolerância à glicose intravenoso. Cheng e cols. (54) relataram que mulheres na pós-menopausa, tratadas com ISO apresentaram diminuição da glicemia de jejum e dos níveis de insulina. No entanto, ainda não são claros os mecanismos pelos quais as ISO causam o efeito hipoglicêmico em ratas OVX.

Em síntese, os resultados do presente estudo mostram que o tratamento com pequena dose de ISO reduz o acúmulo de gordura em ratas OVX e que este efeito pode estar relacionado com a redução da lipogênese e o aumento da lipólise.

Agradecimentos: Fundação Araucária, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro e a Pharma Nostra que, gentilmente, cedeu a mistura de ISO. Não há conflitos de interesse por parte dos autores, dos órgãos financiadores e da empresa colaboradora que possam interferir na publicação dos resultados contidos neste trabalho.

Recebido em 8/2/2008

Aceito em 17/10/2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Fev 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Aceito
  17 Out 2008
• Recebido
  08 Fev 2008