The effect of macauba meal inclusion in the ruminal protozoa population of dairy cows

abmvz Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 0102-0935 1678-4162 Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária ABSTRACT The effects of meal macaúba (MM) inclusion on the concentration and profile of the ciliate protozoa of the bovine rumen were evaluated. Eight Holstein cows were used during second lactation, with average 480 kg of body weight, arranged in two 4x4 Latin squares simultaneously and fed four diets with different concentrations of the MM (0, 100, 200 and 300 g kg-1). For identification and quantification of protozoa, samples of ruminal fluid from each animal with 1 ml were diluted in 9mL of 10% formaldehyde. After consecutive decimal dilutions in saline solution, protozoa were assessed in a Sedgewick chamber. The identification was carried out under the optical light microscope using a 40x objective to characterize at least 100 individuals per sample. The concentrations of small (P<0.01), medium (P=0.05), large (P= 0.01), and the total number (P<0.01) of protozoa decreased linearly with the increasing MM inclusion. Morphological characteristics typical of 16 genera of ciliates were found, being the Entodinium spp. and Eodinium spp. the most frequent in the rumen fluid of animals evaluated. The profile of the population of ciliated protozoa suffer minor changes with the addition of MM, with a change in the percentage share of Charonina spp. (P = 0.03) and Polyplastron spp. (P <0.01). The use of the MM in the cattle diet promotes reduction in the concentration and change in the profile of the population of rumen ciliates protozoa. INTRODUÇÃO A macaúba (Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. Ex Mart.) é uma espécie nativa das florestas tropicais e se destaca por ser uma palmeira oleaginosa altamente produtiva e adaptada a regiões semiáridas (Braga, 1976). O fruto da macaúba tem despertado grande interesse socioeconômico por se tratar de uma importante fonte de óleo vegetal, podendo ser utilizado para a produção de biodiesel, de cosméticos e de alimentos (Coimbra e Jorge, 2012). Durante o processo de extração do óleo por prensagem hidráulica, são geradas grandes quantidades de biomassa residual, podendo representar mais de 500g kg-1 do total do fruto processado. Essa biomassa residual é denominada torta de macaúba (TM), a qual apresenta altas concentrações de carboidratos fibrosos e de lipídeos, sendo indicada como alternativa econômica na alimentação de ruminantes (Azevedo et al., 2012; Azevedo et al., 2013a), podendo ou não provocar alterações nos padrões de consumo (Azevedo et al., 2013b; Azevedo et al., 2013c). Os protozoários ocorrem em número de, aproximadamente, 106 células por mililitro de conteúdo ruminal e são, na maioria, ciliados. Os ciliados dividem-se em dois grandes grupos: os holotrichas, que possuem cílios por todo o corpo, e os entodiniomorfos, que somente possuem cílios em regiões discretas, geralmente adjacentes ao citóstoma. Os holotrichas podem engolfar grânulos de amido, os quais são degradados mais lentamente que a degradação efetuada por bactérias ruminais, o que pode contribuir para evitar queda brusca do pH em animais alimentados com dietas ricas em concentrado. Já os entodiniomorfos são capazes de aderirem-se às fibras e possuem atividade celulolítica e hemicelulolítica (Williams e Coleman, 1985). Os protozoários ciliados do rúmen têm crescimento estimulado ou inibido por fatores dietéticos (Williams, 1986). A suplementação lipídica em excesso na dieta de ruminantes pode comprometer o crescimento microbiano ruminal (Palmquist e Jenkins, 1980; Byers e Schelling, 1989), sendo as bactérias Gram-positivas, metanogênicas e os protozoários os mais sensíveis (Doreau e Ferlay, 1995). Dado o teor elevado de lipídeos na torta de macaúba, objetivou-se com esta pesquisa avaliar o efeito do fornecimento do coproduto sobre a concentração e o perfil da população de protozoários ciliados do rúmen de vacas leiteiras. MATERIAL E MÉTODOS Os procedimentos adotados com os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (Protocolo: 87/2008). Foram utilizadas oito vacas Holandesas com 480±26kg de peso corporal, com média de produção de 21,4±3,8kg por dia, na segunda lactação, idade média de 4,1±0,2anos e com 45 dias de lactação. Os animais foram alojados em baias cobertas e individuais, com seis metros quadrados, piso de terra batida, bebedouros automáticos, comedouros e saleiros individuais. As unidades experimentais foram distribuídas em dois quadrados latinos 4x4, balanceados para efeito residual, sendo quatro diferentes níveis de inclusão da TM (0, 100, 200 e 300g kg-1) na dieta total e quatro períodos experimentais. Os períodos experimentais foram de 21 dias cada, sendo os primeiros 14 dias de adaptação dos animais à dieta e os últimos sete dias para realização das coletas de dados. As dietas experimentais foram formuladas de acordo com as recomendações do NRC (2001) para produção estimada de 25kg de leite, com níveis crescentes de inclusão da TM na matéria seca (MS; Tab. 1). O volumoso e o concentrado foram misturados nos cochos e fornecidos aos animais duas vezes ao dia, em duas porções iguais, uma pela manhã (sete horas) e outra à tarde (17h), ajustados de forma a manter as sobras em 200g kg-1 do oferecido. As amostras dos alimentos fornecidos foram coletadas diariamente, sendo identificadas e acondicionadas em freezer para posteriores análises laboratoriais. Todas as amostras foram pré-secas em estufa ventilada a 55°C e, posteriormente, moídas em moinho com peneira de um milímetro. Logo após, foram acondicionadas em frascos identificados, para posterior análise. Tabela 1.Ingredientes e composição química das dietas (g kg-1 de matéria seca) e da torta de macaúba (TM) Concentrações (g kg-1) da TM na dieta TM 0 100 200 300 Ingredientes Silagem de milho 500,0 500,0 500,0 500,0 - Caroço de algodão 100,0 100,0 100,0 100,0 - Milho moído 339,8 242,4 143,0 53,5 - Farelo de soja 74,3 72,2 72,6 64,3 - Torta de macaúba 1 0,0 100,0 200,0 300,0 - Ureia + SA (1%) 6,7 8,5 10,1 13,0 - Calcário calcítico 6,0 5,0 3,9 2,8 - Fosfato bicálcico 2,1 2,8 3,6 4,4 - Premix mineral-vitamínico 4,5 4,5 4,5 4,5 - Composição química Matéria seca 565,0 563,4 563,0 568,8 878,7 Cinza 139,7 119,4 118,2 117,1 50,1 Proteína bruta 147,6 147,6 147,8 147,9 66,4 Extrato de etéreo 47,8 64,0 80,0 95,8 197,3 Fibra em detergente neutro 430,9 479,8 538,2 547,3 720,3 Carboidratos não fibrosos 234,0 189,2 115,8 91,9 - 1 Composição de ácidos graxos da TM (por kg de ácidos graxos): 3,2g C12:0; 2,6g C14:0; 205,2g C16:0; 39,5g C16:1 cis-9; 15,0g C18:0; 490,9g C18:1 cis-9; 51,1g C18:1 cis-11, 14,3g C18:1 cis-12; 5,8g C18:1 cis-13; 154,0g C18:2 cis-9 cis-12; 8,8 g C18:3 n-3; 5,9g outros ácidos graxos; 228,0g ácidos graxos saturados; 768,3g ácidos graxos insaturados; 602,9g ácidos graxos monoinsaturados; 165,4g ácidos graxos poli-insaturados. As amostras foram analisadas de acordo com a Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1997) para MS (método 934,01), cinzas (método 942,05), proteína bruta (PB, método 954,01) e extrato etéreo (EE, método 920,39). Fibra em detergente neutro (FDNa, Van Soest et al., 1991) foi analisada no ANKOM200 Fiber Analyzer (ANKOM Technology Corporation, Fairport, Nova York, EUA). Sulfito de sódio e alfa-amilase foram usados na determinação de FDNa. O teor de carboidratos não fibrosos foi calculado como: CFN = 100 - (% FDNa +% EE +% PB +% de cinzas), de acordo com o NRC (2001). A composição de ácidos graxos da TM foi determinada de acordo com Machmu Èller e Kreuzer (1999). Realizou-se extração com clorofórmio-metanol (2:1, v/v) e metilação dos lipídeos, sendo posteriormente determinados e quantificados os ácidos graxos em cromatógrafo de gás HP 5890A (Hewlett-Packard, Avondale, Pensilvânia, EUA), equipado com um Supelcowax 10-coluna (coluna capilar de sílica fundida, 30m x 0,32mm). Ao final de cada período experimental, os animais foram submetidos a jejum de sólidos por 12 horas, sendo, em seguida, imobilizados em brete de contenção para coletar amostra do líquido ruminal. Após a contenção, foi realizada a tricotomia e a assepsia, com solução de polivinilpirrolidona-iodo diluído a 1%, em uma área de aproximadamente cinco centímetros quadrados, localizada na parte ventral do abdômen esquerdo, abaixo da fossa paralombar e cranialmente à articulação do joelho (Dirksen, 1993). Puncionou-se aproximadamente 15mL de líquido ruminal, com o auxílio de cateter (SolidorR, 14.2, Bio Med Health Care Products, Haryana, Índia) acoplado a uma seringa estéril. As amostras foram armazenadas em tubos de ensaio e transportadas em caixas isotérmicas, a 4ºC, para o laboratório. Os tubos de ensaio foram homogeneizados em vórtex, durante um minuto, e alíquotas de 1000μL foram transferidas para tubos contendo 9,0mL de formaldeído a 10%, para a conservação dos protozoários. Posteriormente, foram realizadas diluições decimais sucessivas em solução salina, para a determinação do número de protozoários em câmaras de Sedgewick (S52 glass, Pyser-SGI, Edenbridge, Kent, Reino Unido). As concentrações de protozoários pequenos (até 40 x 60µm), médios (até 100 x 150µm) e grandes (maior que 100 x 150µm) por mililitros de líquido ruminal foram determinadas após a visualização em microscópio óptico, utilizando-se a objetiva de 10x (Dirksen, 1993). A identificação dos protozoários foi realizada em lâminas e lamínulas, com adição de uma gota da amostra em solução de 10-3 e uma gota de solução de lugol. A leitura e a identificação foram realizadas sob a luz da microscopia óptica, utilizando-se a objetiva de 40x para caracterizar o mínimo de 100 indivíduos por amostra. Os gêneros de protozoários foram classificados segundo as características morfológicas descritas por Dehority (1993). Os resultados foram analisados de acordo com o procedimento GLM do SAS (versão 9.0; SAS Institute Inc., Cary, Carolina do Norte, EUA), em dois quadrados latinos 4x4, para testar o efeito da inclusão da TM sobre a concentração e o perfil da população de protozoários ciliados do rúmen. Os dados de concentração de protozoários foram analisados após transformação logarítmica (log10), e, em seguida, análise de regressão foi realizada para todas as variáveis obtidas no estudo. Valores de probabilidade inferiores ou iguais a 0,05 foram considerados significativos. RESULTADOS E DISCUSSÃO As concentrações de protozoários pequenos (P<0,01), médios (P=0,05) e grandes (P=0,01) e o número total de protozoários (P<0,01) decresceram linearmente com o aumento dos níveis de inclusão da TM nas dietas (Tab. 2). Os menores números de protozoários ciliados no líquido ruminal de animais alimentados com TM podem estar associados à menor ingestão de CNF e ao maior consumo de EE (Azevedo et al., 2014), uma vez que a carência de carboidratos solúveis resulta em diminuição significativa na quantidade de protozoários e a suplementação lipídica em excesso causa efeitos deletérios sobre o crescimento microbiano ruminal (Palmquist e Jenkins, 1980; Byers e Schelling, 1989). Tabela 2 Concentrações (x104/mL de líquido ruminal) de protozoários ciliados no líquido ruminal de vacas leiteiras alimentadas com diferentes níveis de inclusão de torta de macaúba (TM) Concentrações (g kg-1) da TM na dieta EPM Valor de P 0 100 200 300 Linear Quadrático Protozoários 1 Pequeno 20,92 11,31 4,59 3,09 1,350 <0,01 0,75 Médio 1,78 0,88 0,19 0,23 0,045 0,05 0,86 Grande 1,17 0,40 0,09 0,07 0,035 0,01 0,79 Total 23,87 12,59 4,87 3,39 1,750 <0,01 0,67 1 Pequeno (até 40 x 60µm), médio (até 100 x 150µm) e grande (maior do que 100 x 150µm). Essa diminuição na concentração de protozoários pode estar associada, ainda, à elevada concentração de ácidos graxos insaturados e à concentração considerável de ácidos graxos láurico (C12:0) e mirístico (C14:0) na TM (Tab. 1). Nesse sentido, pesquisas realizadas in vitro e in vivo demonstraram que os protozoários são sensíveis aos ácidos graxos insaturados oleico (C18:1 cis-9), linoleico (C18:2 cis-9 cis-12) e α-linolênico (C18:3 n-3) (Machmüller et al., 1998; Hristov et al., 2004) e aos ácidos graxos saturados láurico e mirístico (Dohme et al., 1999; Faciola et al., 2013), sendo os dois últimos os que apresentam maior efeito tóxico sobre os protozoários ciliados do rúmen (Machmüller et al., 1998). Os protozoários grandes foram os que apresentaram maior sensibilidade à atividade antiprotozoária da TM. O consumo de 100, 200 e 300g kg-1 da TM diminuiu a concentração de protozoários grandes em 66, 92, 92,4 e 95,9% (isto é, em relação à dieta sem TM), respectivamente. Já as concentrações de protozoários pequenos e médios foram reduzidas, respectivamente, em 46, 78 e 50,6%; 78,1 e 89,4% e 85,23 e 87,1%, quando comparadas às concentrações de protozoários de animais mantidos com a dieta sem TM. Esses resultados evidenciam que a TM, quando adicionados à dieta, proporciona um potente efeito antiprotozoário. Foram encontrados gêneros de protozoários das subclasses Holotricha (Buetschilia, Isotricha e Dasytricha) e Entodiniomorpha (Charonina, Entodinium, Diplodinium, Eodinium, Eremoplastron, Eudiplodinium, Diploplastron, Polyplastron, Ostracodinium, Elytroplastron, Enoploplastron, Ophyroscolex e Epidinium), com predominância dos entodiniomorfos, que corresponderam em mais de 70% da fauna, nos quatro níveis testados (Tab. 3). Nesse contexto, observou-se que, nos animais mantidos com a dieta sem TM, houve predominância dos gêneros Eodinium e Entodinium, que corresponderam a 33,8 e a 33,3% dos protozoários ciliados identificados, respectivamente. Já nos animais mantidos com as dietas contendo 100 e 200gkg-1 do coproduto, o gênero de maior predominância foi o Entodinium, correspondendo, respectivamente, a 35,4 e a 30,0% dos protozoários identificados. Com a inclusão de 300g kg-1 da TM, os gêneros mais frequentes passaram a ser novamente o Eodinium e o Entodinium, correspondendo, respectivamente, a 28,0 e a 25,4% dos ciliados encontrados. Tabela 3 Participação percentual dos gêneros de protozoários ciliados no líquido ruminal de vacas leiteiras alimentadas com diferentes níveis de inclusão de torta de macaúba (TM) Concentrações (g kg-1) da TM na dieta EPM Valor de P 0 100 200 300 Linear Quadrático Gêneros de protozoários Buetschilia 2,3 1,6 0,6 1,9 0,39 0,59 0,28 Isotricha 5,7 8,8 8,0 18,8 2,19 0,06 0,39 Dasytricha 0,7 6,1 0,3 0,1 0,96 0,42 0,17 Charonina 1,0 1,4 6,0 0,4 0,74 0,67 0,03 Entodinium 33,3 35,4 30,0 25,4 2,77 0,27 0,61 Diplodinium 7,1 7,1 10,7 1,8 1,74 0,48 0,25 Eodinium 33,8 21,6 15,5 28,0 3,22 0,47 0,07 Eremoplastron 7,0 5,2 4,5 3,2 1,30 0,21 0,94 Eudiplodinium 3,8 9,0 12,0 13,2 2,46 0,18 0,71 Diploplastron 3,7 2,0 9,5 3,5 0,87 0,42 0,29 Polyplastron 0,0 0,1 0,3 1,3 0,17 0,01 0,07 Ostracodinium 0,1 0,1 2,0 0,8 0,51 0,37 0,61 Elytroplastron 0,6 0,2 0,3 0,1 0,30 0,06 0,21 Enoploplastron 0,0 0,1 0,1 0,0 0,02 0,99 0,34 Ophyroscolex 0,1 0,1 0,1 0,1 0,03 0,92 0,90 Epidinium 0,8 1,2 0,1 1,4 0,34 0,79 0,53 Total identificado1 997 1106 899 908 - - - 1 Número total de protozoários identificados por grupo de tratamento. A predominância do gênero Entodinium está de acordo com as observações dos autores que investigaram as populações de protozoários no rúmen de bovinos alimentados com dietas contendo óleo de soja, associado ou não à monensina (Martinele et al., 2008), de ovinos criados na caatinga (Matos et al., 2008), de bovinos e bubalinos alimentados com dietas suplementadas com monensina ou própolis (Risponli et al., 2009) e em caprinos submetidos à dieta com casca de soja, em substituição ao milho (Carvalho et al., 2011). Essa predominância pode ser justificada por esse gênero apresentar várias espécies de ampla distribuição e ocorrência entre vários ruminantes domésticos e selvagens (Ogimoto e Imai, 1981). A proporção do gênero Charonina apresentou comportamento quadrático (P = 0,03) com o aumento da inclusão da TM nas dietas, o que pode estar associado ao mesmo comportamento quadrático da ingestão de FDN pelos animais (Azevedo et al., 2014), uma vez que ambos apresentaram valores máximos em 200g kg-1 do coproduto na dieta. Essa observação é similar à de Rufino et al. (2011), os quais, ao avaliarem o líquido ruminal de caprinos alimentados com diferentes níveis de inclusão da TM, em substituição ao caroço de algodão, verificaram a predominância do gênero Charonina no líquido ruminal de animais alimentados com dieta contendo 100g kg-1 da TM na matéria seca total. Aumentos nos níveis de inclusão da TM resultaram em aumento linear (P<0,01) na participação percentual do Polyplastron spp., o que pode estar associado também ao consumo de FDN (Azevedo et al., 2014), uma vez que os entodiniomorfos são capazes de aderir-se às fibras, engolfam material particulado e possuem enzimas que digerem a celulose e a hemicelulose (Williams e Coleman, 1985). Dessa forma, Charonina spp. e Polyplastron spp. poderiam ter utilizado os carboidratos fibrosos como fonte de energia para o crescimento. Esse aumento na participação percentual do gênero Polyplastron pode estar associado, ainda, à maior tolerância desse gênero aos efeitos antiprotozoários da TM. A atividade antiprotozoária da TM na dieta poderia ter efeito positivo na eficiência de utilização da energia da dieta, uma vez que os protozoários podem ser responsáveis por até 37% de metanogênese (Finlay et al., 1994), e, portanto, uma redução dos ciliados pode resultar em menor perda de energia a partir do rúmen. Além disso, pesquisadores têm relatado que a supressão de protozoários está intimamente relacionada com a redução da concentração de amônia no rúmen e o aumento da eficácia da síntese de proteína microbiana (Faciola et al., 2013; Fiorentini et al., 2013). Entre as implicações dos efeitos da adição da TM nas dietas desses animais, poderia ocorrer redução na produção de metano, aumento de proteína bacteriana disponível para o animal e melhora da eficiência de utilização da energia das dietas. Futuros estudos são importantes para avaliar a produção de metano entérico com adição de TM na dieta de vacas leiteiras para indicá-la como possível prebiótico. CONCLUSÕES A utilização da torta de macaúba na dieta de bovinos promove redução na concentração de protozoários ciliados no líquido ruminal. A inclusão de 300g kg-1 da torta de macaúba na dieta quase proporciona uma defaunação, indicando que esse coproduto apresenta um potente efeito antiprotozoário. Entretanto, o perfil da população de ciliados é pouco alterado com a inclusão da torta de macaúba. AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (Fapemig), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e PRPq / UFMG. REFERÊNCIAS AZEVEDO, R.A.; BICALHO, F.L.; ARAUJO, L. et alAnálise técnico-econômica de diferentes níveis da torta da torta de macaúba em dietas para vacas leiteiras. Arch. Zootec, v.62, p.1-4, 2013a. AZEVEDO R.A. BICALHO F.L. ARAUJO L. Análise técnico-econômica de diferentes níveis da torta da torta de macaúba em dietas para vacas leiteiras Arch. Zootec 62 1 4 2013 AZEVEDO, R.A.; RUFINO, L.M.A.; DOS SANTOS A.C.R. et al. Desempenho de cordeiros alimentados com inclusão de torta de macaúba na dieta. Pesqui. Agropecu. Bras., v.47, p.1663-1668, 2012. AZEVEDO R.A. RUFINO L.M.A. DOS SANTOS A.C.R. Desempenho de cordeiros alimentados com inclusão de torta de macaúba na dieta Pesqui. Agropecu. Bras 47 1663 1668 2012 AZEVEDO, R.A.; RUFINO, L.M.A.; DOS SANTOS, A.C.R et al. Comportamento ingestivo de cordeiros alimentados com torta de macaúba. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec, v.65, p.490-496, 2013b. AZEVEDO R.A. RUFINO L.M.A. DOS SANTOS A.C.R. Comportamento ingestivo de cordeiros alimentados com torta de macaúba Arq. Bras. Med. Vet. Zootec 65 490 496 2013 AZEVEDO, R.A.; SANTOS A.C.R.; RIBEIRO JÚNIOR, C.S. et al. Comportamento ingestivo de vacas alimentadas com torta de macaúba. Cienc. Rural, v.43, p.1485-1488, 2013c. AZEVEDO R.A. SANTOS A.C.R. RIBEIRO C.S. JÚNIOR Comportamento ingestivo de vacas alimentadas com torta de macaúba Cienc. Rural 43 1485 1488 2013 AZEVEDO, R.A.; SANTOS A.C.R.; RIBEIRO JÚNIOR, C.S. et al. Desempenho de vacas em lactação alimentadas com dietas contendo torta de macaúba. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec, v.66, p.211-218, 2014. AZEVEDO R.A. SANTOS A.C.R. RIBEIRO C.S. JÚNIOR Desempenho de vacas em lactação alimentadas com dietas contendo torta de macaúba Arq. Bras. Med. Vet. Zootec 66 211 218 2014 BRAGA, R. Plantas do nordeste, especialmente do Ceará. Fortaleza, Ceará: Escola Superior de Agricultura de Mossoró, 1976 BRAGA R. Plantas do nordeste, especialmente do Ceará Fortaleza, Ceará Escola Superior de Agricultura de Mossoró 1976 BYERS, F.M.; SCHELLING G.T. Lipids in ruminant nutrition. In: CHURCH, D.C. (ed.). The ruminant animal: digestive physiology and nutritionEnglewood Cliffs, New Jersey: Prentice Hall, 1989. p.293-312. BYERS F.M. SCHELLING G.T. Lipids in ruminant nutrition CHURCH D.C. The ruminant animal: digestive physiology and nutrition Englewood Cliffs, New Jersey Prentice Hall 1989 293 312 CARVALHO, L.F.P.; AMORIM, G.L.; MATOS, D.S. et al. Protozoários do rúmen de caprinos submetidos a dieta com casca de soja. Rev. Bras. Saúde Prod. Anim., v.12, p.244-253, 2011. CARVALHO L.F.P. AMORIM G.L. MATOS D.S. Protozoários do rúmen de caprinos submetidos a dieta com casca de soja Rev. Bras. Saúde Prod. Anim. 12 244 253 2011 COIMBRA, M.C.; JORGE, N. Fatty acids and bioactive compounds of the pulps and kernels of Brazilian palm species, guariroba (Syagrus oleraces), jerivá (Syagrus romanzoffiana) and macaúba (Acrocomia aculeate). J. Sci. Food Agric., v.92, p.679-684, 2012. COIMBRA M.C. JORGE N. Fatty acids and bioactive compounds of the pulps and kernels of Brazilian palm species, guariroba (Syagrus oleraces), jerivá (Syagrus romanzoffiana) and macaúba (Acrocomia aculeate) J. Sci. Food Agric. 92 679 684 2012 DEHORITY, B.A. Laboratory manual for classification and morphology of rumen ciliate protozoa Boca Raton, Florida: CRC Press, 1993. DEHORITY B.A. Laboratory manual for classification and morphology of rumen ciliate protozoa Boca Raton, Florida CRC Press 1993 DIRKSEN, G. Sistema digestivo. In: DIRKSEN, G.; GRUNDER, H.D.; STOBER, M. (Eds.). Rosenberger: exame clínico dos bovines. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1993. p.166-169. DIRKSEN G. Sistema digestivo DIRKSEN G. GRUNDER H.D. STOBER M. Rosenberger: exame clínico dos bovines Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1993 166 169 DOHME, F.; MACHMÜLLER, A.; ESTERMANN, B.L. et al The role of the rumen ciliate protozoa for methane suppression caused by coconut oil. L. Appl. Microbiol, v.29, p. 187-192, 1999. DOHME F. MACHMÜLLER A. ESTERMANN B.L. The role of the rumen ciliate protozoa for methane suppression caused by coconut oil L. Appl. Microbiol 29 187 192 1999 DOREAU. M; FERLAY, A. Effect of dietary lipids on nitrogen metabolism in the lumen: a review. Livest. Prod. Sci., v.43, p.97-110, 1995. DOREAU M FERLAY A. Effect of dietary lipids on nitrogen metabolism in the lumen: a review Livest. Prod. Sci. 43 97 110 1995 FACIOLA, A.P.; BRODERICK, G.A.; HRISTOV, A. et al Effects of lauric acid on ruminal protozoal numbers and fermentation pattern and milk production in lactating dairy cows. J. Anim. Sci., v.91, p.363-373, 2013. FACIOLA A.P. BRODERICK G.A. HRISTOV A. Effects of lauric acid on ruminal protozoal numbers and fermentation pattern and milk production in lactating dairy cows J. Anim. Sci. 91 363 373 2013 FINLAY, B.J.; ESTEBAN, G.; CLARKE, K.J. et al Some rumen ciliates have endosymbiotic methanogens. FEMS Microbiol. Lett., v.117, p.157-161, 1994. FINLAY B.J. ESTEBAN G. CLARKE K.J. Some rumen ciliates have endosymbiotic methanogens FEMS Microbiol. Lett. 117 157 161 1994 FIORENTINI, G.; MESSANA, J.D.; DIAN, P.H.M. et al. Digestibility, fermentation and rumen microbiota of crossbred heifers fed diets with different soybean oil availabilities in the rumen. Anim Feed Sci. Technol., v.181, p.26-34, 2013. FIORENTINI G. MESSANA J.D. DIAN P.H.M. Digestibility, fermentation and rumen microbiota of crossbred heifers fed diets with different soybean oil availabilities in the rumen Anim Feed Sci. Technol. 181 26 34 2013 HRISTOV, A.N.; IVAN, M.; MCALLISTER, T.A. In vitro effects of individual fatty acids on protozoal numbers and on fermentation products in ruminal fluid from cattle fed a high-concentrate, barley-based diet. J. Anim. Sci. v.82, p.2693-2704, 2004. HRISTOV A.N. IVAN M. MCALLISTER T.A. In vitro effects of individual fatty acids on protozoal numbers and on fermentation products in ruminal fluid from cattle fed a high-concentrate, barley-based diet J. Anim. Sci. 82 2693 2704 2004 MACHMU ÈLLER, A.; KREUZER, M. Methane suppression by coconut oil and associated effects on nutrient and energy balance in sheep. Can., J. Anim. Sci.v.79, p.65-72, 1999. MACHMU ÈLLER A. KREUZER M. Methane suppression by coconut oil and associated effects on nutrient and energy balance in sheep Can., J. Anim. Sci. 79 65 72 1999 MACHMÜLLER, A.; OSSOWSKI, D.A.; WANNER, M. et al. Potential of various fatty feeds to reduce methane release from rumen fermentation in vitro (Rusitec). Anim. Food Sci. Technol.v.71, p.117-130, 1998. MACHMÜLLER A. OSSOWSKI D.A. WANNER M. Potential of various fatty feeds to reduce methane release from rumen fermentation in vitro (Rusitec) Anim. Food Sci. Technol. 71 117 130 1998 MARTINELE, I.; EIFERT, E.C.; LANA, R.P. et al. Efeito da monensina e do óleo de soja sobre os protozoários ciliados do rúmen e correlação dos protozoários com parâmetros da fermentação ruminal e digestivos. Rev. Bras. Zootec., v.37, p.1129-1136, 2008. MARTINELE I. EIFERT E.C. LANA R.P. Efeito da monensina e do óleo de soja sobre os protozoários ciliados do rúmen e correlação dos protozoários com parâmetros da fermentação ruminal e digestivos Rev. Bras. Zootec. 37 1129 1136 2008 MATOS, D.S.; GUIM, A.; BATISTA, A.M.V. et al. População de protozoários ciliados no rúmen de ovinos criados na caatinga de Pernambuco., Rev. Bras. Saúde Prod. Anim. v.9, p.270-279, 2008. MATOS D.S. GUIM A. BATISTA A.M.V. População de protozoários ciliados no rúmen de ovinos criados na caatinga de Pernambuco Rev. Bras. Saúde Prod. Anim. 9 270 279 2008 NUTRIENT requirements of dairy cattle. 7.ed. Washington: National Academy Press, 2001. NUTRIENT requirements of dairy cattle 7.ed Washington National Academy Press 2001 OFFICIAL methods of analysis. 16.ed. AOAC, Arlington, Virginia: AOAC, 1997. OFFICIAL methods of analysis 16.ed Arlington, Virginia AOAC 1997 OGIMOTO, K.; IMAI, S. Atlhas of rumen microbiology. Tokyo: Japan Scientific Societies Press, 1981. 231p. OGIMOTO K. IMAI S. Atlhas of rumen microbiology Tokyo Japan Scientific Societies Press 1981 231 PALMQUIST, D.L.; JENKINS, T.C. Fat in lactation rations: review. J. Dairy Sci., v.63, p.1-14, 1980. PALMQUIST D.L. JENKINS T.C. Fat in lactation rations: review J. Dairy Sci 63 1 14 1980 RISPOLI, T.B.; RODRIGUES, I.L.; MARTINS NETO, R.G. et al. Protozoários ciliados do rúmen de bovinos e bubalinos alimentados com dietas suplementadas com monensina ou própolis. Pesqui. Agropecu. Bras, v.44, p.92-97, 2009. RISPOLI T.B. RODRIGUES I.L. MARTINS R.G. NETO Protozoários ciliados do rúmen de bovinos e bubalinos alimentados com dietas suplementadas com monensina ou própolis Pesqui. Agropecu. Bras 44 92 97 2009 RUFINO, L.M.A.; BARRETO, S.M.P.; DUARTE, E.R. et al. Efeitos da inclusão de torta de macaúba sobre a população de protozoários ruminais de caprinos. Rev. Bras. Zootec.v.40, p.899-903, 2011. RUFINO L.M.A. BARRETO S.M.P. DUARTE E.R. Efeitos da inclusão de torta de macaúba sobre a população de protozoários ruminais de caprinos Rev. Bras. Zootec. 40 899 903 2011 STATISTICAL Analisys System for windows.Versão 9.1. Cary: SAS Inst. Inc., 2004. STATISTICAL Analisys System for windows.Versão 9.1 Cary SAS Inst. Inc 2004 VAN SOEST, P.J.; ROBERTSON, J.B.; LEWIS, B.A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition.. J. Dairy Sci, v.74, p.3583-3597, 1991. VAN SOEST P.J. ROBERTSON J.B. LEWIS B.A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition J. Dairy Sci 74 3583 3597 1991 WILLIAMS, AG. Rumen holotrich ciliate protozoa. Microbiol. Rev., v.50, p.25-49, 1986. WILLIAMS AG. Rumen holotrich ciliate protozoa Microbiol. Rev. 50 25 49 1986 WILLIAMS, A.G.; COLEMAN, G.S. Hemicellulose-degrading enzymes in rumen ciliate protozoa. Curr. Microbiol. v.12, p.85-90, 1985. WILLIAMS A.G. COLEMAN G.S. Hemicellulose-degrading enzymes in rumen ciliate protozoa Curr. Microbiol. 12 85 90 1985