Produção e caracterização de protease fibrinolítica de Streptomyces parvulus DPUA 1573

Production and characterization of fibrinolytic protease from Streptomyces parvulus DPUA 1573

RESUMO

As proteases fibrinolíticas são capazes de degradar coágulos de fibrina formados dentro dos vasos sanguíneos, evitando a trombose intravascular. Em animais, a tromboflebite, que acomete frequentemente os equinos, ocasiona, em seus casos graves, a obstrução jugular e também um edema de laringe, derivando a obstrução das vias aéreas, o que possibilita um edema cerebral, ocorrendo o óbito do animal. Devido ao fato de o tratamento ser de custo elevado, faz-se necessária a investigação de outras fontesde proteases fibrinolíticas com custos menores e com menos efeitos colaterais. Diante disso, este estudo tem como objetivo produzir e caracterizar proteases fibrinolíticas obtidas de Streptomyces parvulus DPUA 1573. Para produção da enzima, foi utilizado um planejamento fatorial 2⁴ avaliando a concentração da farinha de soja (0,5, 1,0 e 1,5%) e da glicose (0, 0,5 e 1,0g/L), temperatura (28, 32 e 37ºC) e agitação (150, 200 e 250rpm) sobre a biomassa e a atividade fibrinolítica. Pode-se verificar que a protease fibrinolítica apresentou atividade máxima (835U/mL) nas condições de concentração de 1,5% de soja, 1g/L de glicose, 28°C e 150rpm com 48 horas de fermentação. A protease fibrinolítica obtida teve temperatura e pH ótimos de 55°C e pH 9,0, respectivamente. A atividade enzimática foi inibida pelo EDTA, pelo íon Fe²⁺ e pelo SDS, o que indicou a enzima ser uma metaloprotease. A linhagem Streptomyces parvulus DPUA 1573 foi capaz de produzir protease fibrinolítica, possuindo características bioquímicas favoráveis à aplicação na medicina veterinária e possivelmente humana.

Palavras-chave:
Streptomyces parvulus; proteases fibrinolíticas; fermentação submersa

ABSTRACT

Fibrinolytic proteases are able to degrade fibrin clot formed in the blood vessel, avoiding intravascular thrombosis. In animals, thrombophlebitis often affects horses, and in severe cases causes obstruction of the jugular and laryngeal edema leading to airway obstruction allowing cerebral edema resulting in the death of the animal. Since treatment is costly, the investigation of other sources of fibrinolytic proteases at lower cost and with fewer side effects is needed. Thus, this study aims to produce and characterize fibrinolytic proteases from Streptomyces parvulus DPUA 1573. For enzyme production, a factorial design was performed to evaluate 24 soybean flour concentration (0.5, 1.0 and 1.5%) and glucose (0, 0.5 and 1.0g/L), temperature (28, 32 and 37°C) and agitation (150, 200 and 250rpm) on biomass and fibrinolytic activity. Fibrinolytic protease showed maximum activity (835 U/mL) under these conditions: 1.5% soybean flour, 1g/L glucose, 28°C, and 150rpm 48 hours of fermentation. The optimal temperature was 55°C and optimal pH was 9.0. Fibrinolytic protease activity was inhibited by EDTA, the ion Fe2+, and by SDS, which indicated that the enzyme is a metallo-protease. The strain Streptomyces parvulus DPUA 1573 was able to produce fibrinolytic protease with biochemical characteristics favorable for application in veterinary and human medicine.

Keywords:
Streptomyces parvulus; fibrinolytic protease; submerged fermentation

INTRODUÇÃO

As proteases são importantes, pois atuam no metabolismo e na regulação metabólica, podendo ser encontradas em diferentes organismos, e seu mecanismo envolve a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas (Castro et al., 2011). Entre as proteases, destacam-se as com potencial fibrinolítico, que são enzimas com capacidade de degradar a fibrina, proteína de maior componente dos coágulos sanguíneos. A formação do coágulo de fibrina é normalmente regulada pelo sistema biológico. Entretanto, quando a fibrina não é hidrolisada, ocorre a trombose, bem como outros distúrbios cardiovasculares (Choi et al., 2011; Nascimento et al., 2016).

Os distúrbios cardiovasculares também são relevantes na medicina veterinária. Os equinos são afetados por processos trombolíticos, entre estes se destacam a trombose aortoilíaca e a tromboflebite (Oyamada et al., 2007; Sobreira et al., 2008; Escodro et al., 2010). A tromboflebite é ocasionada pelo uso prolongado de cateteres venosos ou de injeções intravenosas que causam lesão mecânica ou química na parede do vaso, resultando em oclusão completa da veia. Para o tratamento dessa doença, a medicina veterinária utiliza antitrombóticos, antiagregantes plaquetários e anti-inflamatórios. No entanto, há uma carência em medicamentos mais acessíveis, com baixo custo, e também de tratamentos mais eficazes (Barbosa et al., 2009). Em humanos, o tratamento é realizado com agentes trombolíticos, tais como t-PA (ativador plasminogênio tecidual) e uroquinase (Cicha, 2015). Considerando-se a necessidade de buscar novos agentes fibrinolíticos seguros e de baixo custo e de evitar cirurgia no caso dos equinos, estudos estão sendo realizados sobre novas proteases fibrinolíticas.

As bactérias são utilizadas biotecnologicamente, destacando as actinobactérias do gênero Streptomyces, devido a sua capacidade de produzir enzimas extracelulares, como proteases fibrinolíticas (Silva et al., 2016) e biocompostos com variadas atividades biológicas, como antibacterianos e antiparasitários (Demir et al., 2015; Balachandran et al., 2016). Este trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar proteases fibrinolíticas obtidas de Streptomyces parvulus DPUA 1573.

MATERIAL E MÉTODOS

A linhagem de Streptomyces parvulus DPUA 1573 foi isolada de líquens da Região Amazônica e pertence à coleção de culturas DPUA (Departamento de Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas), gentilmente cedida pela prof.ª Maria Francisca Simas Teixeira. O micro-organismo isolado foi mantido no meio ISP-2 (Pridham et al., 1957), com glicerol 10%, a -20°C.

Para a produção de protease fibrinolítica, foi utilizado o meio MS-2 (Porto et al., 1996), pH 7 autoclavado a 121°C/1atm, por 20 minutos. Foram utilizados Erlenmeyers (125mL) contendo 50mL de meio de cultura, sendo o inóculo correspondente a 10⁸UFC/mL. O crescimento celular, a curva de pH, a determinação da atividade fibrinolítica e a atividade proteásica foram determinados a cada 24 horas até 120 horas de fermentação. Para determinar a melhor condição para produção da protease fibrinolítica, utilizou-se um planejamento fatorial 2⁴, conforme a Tab. 1, considerando-se como variáveis independentes a concentração da fonte de nitrogênio (soja), a concentração da fonte de carbono (glicose), a temperatura e a agitação. Consideraram-se como variáveis respostas os valores da biomassa e a atividade fibrinolítica. As condições estudadas, bem como possíveis interações, foram analisadas estatisticamente com o auxílio do programa Statistica 8.0 (Statistica, 2008) com nível de significância de 95%.

Tabela 1
Níveis das variáveis do planejamento fatorial 2⁴ para produção de protease fibrinolítica por Streptomyces parvulus DPUA 1573

Variáveis	Níveis
	Menor (-1)	Central (0)	Maior (+1)
Concentração do filtrado de soja (%)	0,5	1	1,5
Concentração de glicose (g/L)	0	0,5	1
Agitação (rpm)	150	200	250
Temperatura (°C)	28	32	37

A determinação da atividade proteásica foi realizada pelo método de Ginther (1979), e a atividade fibrinolítica foi realizada de acordo com Wang et al. (2011). Na caracterização enzimática, foram avaliados o efeito e a estabilidade do pH e da temperatura, os íons metálicos, surfactantes e os inibidores sobre a atividade proteásica. Para estudo do efeito ao pH, o extrato enzimático foi incubado a diferentes tampões: citrato-fosfato (pH 4,0 a 6,0), fosfato de sódio (pH 6,0 e 7,0), Tris-HCl (pH 7,0, 8,0 e 9,0), carbonato-bicarbonato (pH 9,0 e 10,0) a 37°C por uma hora. O efeito da temperatura foi determinado pela incubação do extrato enzimático em temperaturas variando entre 10°C e 100ºC, por um período de uma hora. Para a estabilidade à temperatura, a incubação ocorreu durante três horas, sendo sua atividade enzimática determinada a cada 30 minutos. Em relação ao efeito dos íons e de inibidores, estes foram escolhidos e realizados de acordo com Nascimento et al. (2016).

Os surfactantes testados foram SDS (dodecilsulfato de sódio - C₁₂H₂₅SO₄Na), Triton X - 100 (C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n), Tween 20 (monopalmitato de polioxietileno sorbitano - C₅₈H₁₁₄O₂₆) e Tween 80 (monopalmitato de polioxietileno sorbitano - C₆₄H₁₂₄O₂₆), estudados nas seguintes concentrações: 0,5%; 1,0%, 1,5% e 2,0%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O crescimento da linhagem Streptomyces parvulus DPUA 1573 (Fig. 1) não apresentou fase lag, uma vez que a concentração do inóculo facilitou sua adaptação ao meio de produção. A fase logarítmica ocorreu 48h de fermentação, a fase estacionária em que o crescimento é desacelerado (96h), devido à diminuição de nutrientes no meio. A fase de declínio foi observada a partir de 120h, todos esses fenômenos foram semelhantes ao estudo de Narayana e Vijayalakshmi (2008), no qual descreve-se a produção da enzima amilase pelo Streptomyces albidoflavus com a produção máxima de biomassa com 96 horas.

Figura 1
Curvas de pH(▲) e crescimento do micro-organismo(■) Streptomyces parvulus DPUA 1573 no meio MS-2.

Durante o processo de fermentação, o pH variou de 7,0 (0h) para 9,0 (120h). Essa alteração pode ser resultante da formação de amônia no meio fermentativo, possivelmente pela desaminação das proteínas existentes na fonte de nitrogênio (farinha de soja). Silva et al. (2016), ao estudarem a produção de protease fibrinolítica por Streptomyces sp. DPUA 1576 utilizando o mesmo meio de produção, observaram que o aumento do pH favorece a produção enzimática.

No presente estudo, verificaram-se 48h como o melhor tempo de produção da enzima. Esse curto tempo se torna atrativo para a indústria pelos custos menores na produção da enzima de interesse. O contrário foi visto por Silva et al. (2016), os quais, ao estudarem o tempo de produção da protease fibrinolítica por Streptomyces sp. DPUA 1576, observaram que, a partir de 72h, foram obtidos maiores valores em atividade fibrinolítica.

Os valores de atividade fibrinolítica no planejamento fatorial variaram de 625,0 a 835,0 U/mL (Tab. 2). A condição que apresentou maior valor em atividade fibrinolítica (835,0 U/mL) com 48 horas de fermentação foi com 1,5% de farina de soja, 1g/L de glicose, 28ºC e 150rpm. Esses resultados de atividade fibrinolítica foram superiores aos apresentados por Streptomyces venezuelae (16U/mL) (Bhavani et al., 2012).

Tabela 2
Resultados de atividade fibrinolítica obtidos no planejamento fatorial 2⁴ com 48 horas de fermentação produzidas pelo Streptomyces parvulus DPUA 1573.

Ensaios	Soja (%)	Glicose (g/L)	Temperatura (°C)	Agitação (rpm)	Atividade fibrinolítica (U/mL)
1	0,5	0	28	150	632,5
2	1,5	0	28	150	655,0
3	0,5	1	28	150	752,5
4	1,5	1	28	150	835,0
5	0,5	0	37	150	822,5
6	1,5	0	37	150	662,5
7	0,5	1	37	150	667,5
8	1,5	1	37	150	702,5
9	0,5	0	28	250	677,5
10	1,5	0	28	250	732,5
11	0,5	1	28	250	625,0
12	1,5	1	28	250	772,5
13	0,5	0	37	250	692,5
14	1,5	0	37	250	685,0
15	0,5	1	37	250	727,5
16	1,5	1	37	250	747,5
17 C	1,0	0,5	32	200	680,0
18 C	1,0	0,5	32	200	672,5
19 C	1,0	0,5	32	200	697,5
20 C	1,0	0,5	32	200	655,0

A variável independente que isoladamente teve significância foi a concentração de glicose, a qual influenciou positivamente a produção da protease fibrinolítica (Fig. 2A). Sanchez e Demain (2002) afirmaram que as fontes de carbono, como a glicose, são comumente utilizadas para favorecer o crescimento do micro-organismo, melhorando, assim, a produção de enzimas e metabólitos secundários. Por outro lado, Silva et al. (2015), ao estudarem a produção de protease fibrinolítica por Streptomyces sp. DPUA 1576, descreveram que apenas a fonte de nitrogênio (soja) foi significativa.

Figura 2
A - Gráfico de Pareto na produção de protease fibrinolítica por Streptomyces parvulus DPUA 1573. B - Representação gráfica tridimensional da relação entre a concentração de soja e de glicose na produção de protease fibrinolítica por Streptomyces parvulus DPUA 1573 no tempo de 48h.

A interação das variáveis independentes, concentração da fonte de carbono (glicose), temperatura e agitação, apresentou um efeito significativo e positivo (Fig. 3A), indicando que as melhores condições de produção da enzima fibrinolítica foram encontradas em 1% de glicose, 28°C e 150rpm (Fig. 3B). O estudo realizado por Bhavani et al. (2012) com a linhagem mutante Streptomyces venezuelae obteve melhor resultado na produção da protease fibrinolítica a 40ºC, apresentando atividade de 16 U/mL, enquanto neste trabalho a temperatura selecionada foi de 28ºC.

Figura 3
A - Temperatura ótima e estabilidade da protease fibrinolítica. B - Curva do pH ótimo da protease obtida por Streptomyces parvulus DPUA 1573 no tempo de 48h.

Na caracterização da protease, a temperatura ótima foi de 55°C (Fig.3A). Entretanto, observa-se que a atividade da enzima se manteve estável, com temperaturas até 40°C, sendo conservadas 100% de sua atividade por um período de três horas. Esses dados são semelhantes aos resultados obtidos por Ju et al.(2012), que estudaram a enzima fibrinolítica produzida pelo Streptomyces sp., a qual se manteve estável também a 30°C.

Em relação ao efeito do pH, a protease em estudo se manteve estável em valores de pH entre 7,0 e 9,0 (Fig. 3B). Adicionalmente, foi observado que no pH 9,0 a atividade proteásica foi máxima, caracterizando o pH ótimo. Simkhada et al. (2010) afirmam que a faixa de pH neutro ou alcalino apresentou melhores resultados para a produção de uma protease fibrinolítica produzida pelo Streptomyces sp. CS684; além disso, as proteases alcalinas obtidas por micro-organismos têm atraído grande atenção das indústrias devido a sua elevada atividade catalítica e ao alto grau de especificidade ao substrato.

Nos ensaios de inibição, ocorreu redução da atividade da protease com presença de EDTA (31,84%) e β-mercaptoetanol (2,02%) (Tab. 3). Os resultados indicaram que a protease estudada pertence à classe das metaloproteases. As proteases fibrinolíticas que pertencem a esta classe exigem metal bivalente para suas atividades, de modo que estas podem ser inibidas por agentes quelantes, como o EDTA (Mander et al., 2011). Nos estudos de caracterização realizados por Ju et al. (2012), o EDTA foi o principal agente inibidor. Mander et al. (2011) também verificaram a ação inibitória do EDTA, classificando a enzima como metaloprotease.

Tabela 3
Efeito de inibidores na atividade de proteases produzida por Streptomyces parvulus DPUA 1573

Inibidores	Atividade proteásica residual (%)
Controle	100,0
EDTA	68,1
PMSF	168,2
Pepstatina A	121,4
β-mercaptoetanol	97,9
Ácido iodoacético	189,5

Diante dos íons estudados, foi observado que o íon Ca²⁺nas concentrações de 10 e 20mM obteve a ativação superior a 22%, porém não sofreu inibição pelo íon K. Entretanto, a atividade proteásica sofreu maior inibição (42,3%) pelo íon Zn²⁺ _, corroborando os resultados obtidos por Simkhada et al. (2010), que também tiveram a mesma inibição para a protease fibrinolítica produzida pelo Streptomyces sp. CS684.

Dos surfactantes avaliados, a atividade da protease foi ativada pelo Tween 80 (11,33%) e principalmente pelo SDS (51,78%), ambos com concentração de 2%. Esses resultados são semelhantes ao do estudo de Wang et al. (2011), pelo qual o SDS teve um efeito estimulador sobre a atividade da enzima fibrinolítica produzida por Bacillus subtilis TKU007, podendo ser justificado pela alteração na conformação da enzima, aumentando, assim, a sua acessibilidade com o substrato.

CONCLUSÕES

A linhagem Streptomyces parvulus DPUA 1573 foi capaz de produzir protease fibrinolítica em todas as condições de fermentação. No entanto, a protease fibrinolítica apresenta atividade máxima (835U/mL) nas condições de concentração de 1,5% de soja, 1g/L de glicose, 28°C e 150rpm com 48 horas de fermentação. A protease produzida pelo Streptomyces parvulus DPUA 1573 é estável na faixa de pH entre 7 e 9, apresentando propriedades interessantes para a indústria farmacêutica, visando a possíveis aplicações na área de medicina veterinária.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Fev 2017

Histórico

• Recebido
  22 Jul 2015
• Aceito
  09 Ago 2016