Efeito de diferentes diluidores sobre a viabilidade espermática pós-descongelação de sêmen eqüino

Effect of differents freezing extenders on post thaw equine spermatozoa viability

MEDICINA VETERINÁRIA

Efeito de diferentes diluidores sobre a viabilidade espermática pós-descongelação de sêmen eqüino

Effect of differents freezing extenders on post thaw equine spermatozoa viability

P.P.N. Snoeck^I; M. Henry^II; M.I.V. Melo^III

^IUniversidade Estadual de Santa Cruz Rod. Ilhéus-Itabuna, km 16, 45.650-000 – Ilhéus, BA

^IIEscola de Veterinária – UFMG – Belo Horizonte, MG

^IIIPontifícia Universidade Católica – Belo Horizonte, MG

RESUMO

Estudou-se o efeito de diferentes concentrações de gema de ovo, açúcares e tampões nos diluidores sobre a viabilidade espermática pós-descongelação de sêmen eqüino. Os diluidores foram: D1 = 10% de gema de ovo e acréscimo de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; D2= 10% de gema de ovo e redução de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; D3= 20% de gema de ovo e acréscimo de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; D4= 20% de gema de ovo e redução de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; D5= 20% de gema de ovo e composição de lactose e glicose-EDTA segundo Martin et al. (1979). Cinco ejaculados de seis garanhões foram utilizados para testar os diluidores contendo diferentes agentes crioprotetores: 3,5% de etilenoglicol e 5% de acetamida. Após diluição final nos diferentes diluidores, o sêmen foi submetido a diferentes protocolos de congelação: com e sem resfriamento prévio. Após descongelação em banho-maria a 75ºC, avaliaram-se a motilidade, o vigor, e a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas. A redução na concentração de gema de ovo de 20% para 10%, nos diluidores contendo a mesma concentração de açúcares e tampões, não alterou a capacidade crioprotetora dos diluidores com etilenoglicol ou acetamida. O aumento na concentração de açúcares e tampões no diluidor lactose-EDTA-gema de ovo não acrescentou efeito crioprotetor ao etilenoglicol e acetamida. Diluidores com maior osmolaridade tenderam a preservar melhor o sêmen eqüino congelado com etilenoglicol ou acetamida. Os melhores resultados de viabilidade espermática, pós-descongelação, foram para o sêmen congelado nos diluidores D1, D3 e D5 (P<0,05).

Palavras-chave: eqüino, sêmen, criopreservação, diluidor

ABSTRACT

The effect of different egg yolk, sugars and buffering systems concentrations in the freezability of differents equine semen extenders was studied. Extenders were: D1=10% of egg yolk added of more 50% over the lactose and glicose-EDTA levels found in D5; D2=10% of egg yolk and reduction of 50% over the lactose and glucose-EDTA levels in D5; D3=20% of egg yolk added of more 50% over the lactose and glucose-EDTA levels in D5; D4=20% of egg yolk and reduction of 50% over the lactose and glucose-EDTA levels in D5; D5=20% of egg yolk and lactose and glucose-EDTA according to Martin et al. (1979). Five ejaculates of six stallions were used to test extenders using alternatively two differents cryoprotectants agents: 3.5% ethylene glycol and 5% acetamide. After the final dilution, the semen was submitted to differents freezing rates. Straws were thawed at 75º C during 7 seconds, followed by immersion at 37ºC during 5 seconds. After thawing motility, vigour, structural and functional integrity of the membrane of the spermatozoa were evaluated. The reduction in the egg yolk concentration from 20% to 10%, in extenders with the same concentration of sugars and buffering systems, did not modify the crioprotectant capacity of the extender with ethylene glycol or acetamide. The increase in the concentration of sugars and buffering systems in the lactose-EDTA-egg yolk extender did not add crioprotectant effect to ethylene glycol and acetamide. Extenders with high osmolarity had tended to better preserve the frozen equine semen with ethylene glycol or acetamide. Better results of spermatic viability, after thawing, were obtained when semen was diluted in D1, D3 and D5 extender (P<0.05).

Keywords: equine, semen, cryopreservation, extender

INTRODUÇÃO

A composição dos diluidores de congelação de sêmen pode afetar os resultados do processo de criopreservação. A proteção das células durante a fase de desidratação que ocorre durante a congelação e a estabilização da bicamada lipídica, como o impedimento da fusão de partículas intramembranosas, depende das substâncias que compõem o diluidor (Crowe et al., 1987).

Alguns diluidores são mais utilizados para o processo de congelação de sêmen eqüino, dentre eles estão o diluidor Naumienkov e Romankova (Tischner, 1979); o INRA 82, com várias concentrações de gema de ovo e glicerol (Palmer, 1984); o diluidor proposto por Martin et al. (1979), formulado com lactose-EDTA-gema de ovo e o diluidor Kenney, acrescido de gema de ovo e glicerol (Burns, 1992; Burns e Reasner, 1995). A maioria dos diluidores possui em sua formulação açúcares, eletrólitos, gema de ovo; em concentração variável de 1,6 a 20%, e glicerol, variando entre 2,5 e 5%. Os diluidores como o INRA 82 e o Kenney, além dos componentes anteriormente citados, possuem leite na sua composição.

Outros meios de congelação incluem o meio Gent, à base de açúcares, leite, tampões, 5% de gema de ovo e 5% de glicerol; o meio MP–50, constituído de gema de ovo, leite desnatado, Dulbeccos Basal Medium Eagle (BME) e uma associação de glicerol e dimetilformamida (Gomes et al., 2002; Papa et al., 2002); o meio glicina gema de ovo (Papa et al., 1993); e o meio BME–adaptado, formulado a partir de uma associação de meios: Merk-gema (33%), Kenney (31,7%) e Dulbeccos Basal Medium Eagle (31,7%) (Neves Neto et al., 1999). Considerando esses dados, fica evidente, na literatura consultada, que uma grande diversidade de diluidores de congelação tem sido testada para o sêmen eqüino. Essa variabilidade de composição é indicativa de que ainda não foi encontrado um diluidor que preserve a viabilidade espermática pós-descongelação para a maioria dos garanhões. Uma das causas que leva à existência dessa diversidade de meios diluidores deve estar ligada ao fato de existir uma variabilidade na sensibilidade espermática à congelação/ descongelação entre garanhões e/ou entre ejaculados de um mesmo garanhão (Samper et al., 1991).

Foi objetivo deste experimento testar a eficácia de crioprotetores intracelulares alternativos e o efeito da osmolaridade utilizando-se diferentes meios de congelação à base de lactose-EDTA-gema de ovo, sobre a viabilidade espermática pós-descongelação de sêmen eqüino.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados seis garanhões, sendo cinco da raça Mangalarga Marchador e um Bretão, com idades variando entre três e 15 anos. Previamente ao processamento do sêmen, os garanhões foram submetidos a uma colheita de sêmen (vagina artificial) diária, por sete dias consecutivos, para equilibrar as reservas extragonadais. Cinco ejaculados de cada garanhão foram submetidos à congelação, mantendo-se um intervalo entre colheitas, de três dias.

Imediatamente após a colheita, foram avaliados a motilidade total e progressiva e vigor espermáticos (Manual..., 1998) e realizado o teste hiposmótico (HO), para avaliar a integridade funcional da membrana plasmática (Melo e Henry, 1999). Após análise, somente ejaculados que apresentaram motilidade espermática progressiva mínima de 50% foram submetidos à congelação. Na seqüência, o sêmen foi diluído 1:2 no diluidor de centrifugação glicose-EDTA proposto por Martin et al. (1979), sendo centrifugado a 400xg por 10 minutos. Após a centrifugação, foi mantido de 10% a 20% de plasma seminal, e a ressuspensão dos espermatozóides nos meios de congelação foi ajustada de forma a obter 100 milhões de espermatozóides/ml.

As amostras foram, então, submetidas a duas curvas de congelação. A primeira foi denominada de curva rápida com resfriamento prévio lento; para isso, as amostras foram resfriadas (-0,13ºC/min) em geladeira doméstica por duas horas e meia até a temperatura de 5ºC; depois, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5ml e submetido à congelação, em caixa de isopor, 3cm acima da fase líquida do nitrogênio, durante 10 minutos; durante o envase, o sêmen permaneceu em sacos plásticos estéreis submersos em água a 5ºC, no intuito de evitar grandes variações de temperatura. A segunda curva de congelação foi denominada de curva rápida sem resfriamento; nesse caso, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5ml, imediatamente após a diluição final, e congelado como descrito anteriormente. As amostras foram, por conseguinte, armazenadas em botijão até a descongelação e avaliação.

A descongelação das amostras foi realizada em banho-maria a 75ºC, por sete segundos, seguida de imersão em banho-maria a 37ºC, por cinco segundos. Após descongelação, avaliou-se a motilidade progressiva, o vigor, a morfologia espermática, a integridade estrutural das membranas plasmática e acrossomal por meio de sondas fluorescentes (Harrison e Vickers, 1990, modificado por Zúccari, 1998), e a integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozóides por meio do teste HO (Melo e Henry, 1999).

Neste experimento, foram testados cinco diluidores à base de lactose-EDTA-gema de ovo com diferentes concentrações de crioprotetores intracelulares, gema de ovo, açúcares e tampões. Para tanto, considerou-se como controle o meio de congelação D5 constituído de lactose-EDTA-gema de ovo descrito por Martin et al. (1979). O D1 foi preparado com 10% de gema de ovo e acréscimo de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; o D2 apresentou 10% de gema de ovo e redução de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; o D3 foi formulado com 20% de gema de ovo e acréscimo de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5; e o D4 com 20% de gema de ovo e redução de 50% de lactose e glicose-EDTA em relação ao D5. Em cada meio diluidor base, o glicerol foi substituído por 3,5% de etilenoglicol ou 5% de acetamida sempre associada a 0,5% de metilcelulose e 0,165g/100ml de trealose (Tab.1).

A osmolaridade¹ e o pH² dos meios de congelação estão na Tab 2.

O delineamento experimental foi de parcelas subdivididas. Os diluidores foram considerados as parcelas, e o fatorial (dois crioprotetores x duas curvas de congelação) foi considerado a subparcela. O garanhão foi considerado como bloco, e os diferentes ejaculados de um mesmo garanhão foram selecionados ao acaso para serem congelados em diluidores distintos, para que todos os tratamentos (diluidor x crioprotetor intracelular x curva de congelação) fossem testados. O efeito dos fatores composição do meio diluidor, crioprotetor e curva de congelação foi avaliado via análise de variância. As médias obtidas para os diferentes parâmetros (motilidade, integridade estrutural das membranas plasmática e acrossomal e integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozóides) foram comparadas pelo teste Duncan. As variáveis que apresentaram valores percentuais com grande amplitude de variação foram transformadas para ângulo, correspondendo a arco-seno ÖX/100. A variável vigor, que não apresentou distribuição normal foi comparada pelo teste de Kruskal – Wallis (Sampaio, 1998). Na análise, foi utilizado o programa estatístico SAEG (Sistema..., 1997).

RESULTADOS

Os resultados de motilidade espermática progressiva e vigor para cada tratamento estão nas Tab. 3 e 4, respectivamente. Em comparações feitas entre crioprotetores em cada diluidor (D1-D5), observou-se que o crioprotetor acetamida preservou melhor a motilidade do que o etilenoglicol nos diluidores D1 e D3, independente da curva de congelação utilizada. Esse crioprotetor também preservou melhor o vigor, quando comparado à amostra congelada com resfriamento prévio em geladeira no diluidor D3, contendo etilenoglicol (P<0,05). Nos diluidores D2 e D4, não foi observada qualquer diferença entre os crioprotetores e as curvas utilizadas (P>0,05). No D5, a motilidade pós-descongelação superior foi no diluidor com o crioprotetor acetamida, quando utilizado o resfriamento lento antes da congelação (P<0,05). O vigor espermático pós-descongelação foi a única característica que apresentou diferença entre os diluidores (D1-D5) em comparação feita independente do crioprotetor intracelular e da curva de congelação. O mesmo foi menor nas amostras submetidas à congelação em meio diluidor D2 comparado aos meios D1, D3 e D5 (P<0,05).

Na Tab. 5, apresenta-se a porcentagem de espermatozóides com membranas plasmática e acrossomal estruturalmente íntegras, avaliadas por meio das sondas fluorescentes após a descongelação. Os meios diluidores D3 e D5, com utilização de curva de congelação com resfriamento prévio, independente do uso do etilenoglicol ou acetamida como crioprotetores, preservaram melhor a integridade das membranas plasmática e acrossomal dos espermatozóides que os diluidores D2 e D4 (P<0,05). Os diluidores D1, D3 e D5, contendo o crioprotetor etilenoglicol a 3,5% e submetidos a congelação rápida sem resfriamento prévio, preservaram melhor a integridade estrutural das membranas espermáticas que os diluidores D2 e D4 (P<0,05). O diluidor D3 contendo o crioprotetor acetamida 5% preservou melhor a integridade estrutural das membranas dos espermatozóides durante a criopreservação que os diluidores D2 e D4 (P<0,05), após o sêmen ser congelado sem resfriamento prévio. Em cada diluidor (D1-D5), não houve efeito do crioprotetor intracelular e curva de congelação sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal pós-descongelação (P>0,05).

Os resultados do teste hiposmótico são apresentados na Tab. 6. A única diferença observada foi entre os diluidores D2 e D5 contendo 3,5% de etilenoglicol quando congelados sem resfriamento prévio. A porcentagem de espermatozóides reativos ao teste hiposmótico pós-descongelação foi superior no D5 do que no D2 (P<0,05). Em cada diluidor, separadamente, não houve diferença entre os crioprotetores e as curvas de congelação na porcentagem de espermatozóides com integridade funcional da membrana plasmática (P>0,05).

DISCUSSÃO

A motilidade progressiva foi a única característica que variou significativamente entre os crioprotetores intracelulares utilizados. Os melhores resultados foram encontrados nos meios contendo acetamida do que naqueles com etilenoglicol, dependendo do diluidor utilizado. Essas semelhanças na capacidade de crioproteção entre crioprotetores intracelulares em meios de congelação de sêmen eqüino com a mesma composição de açúcares, tampões e gema de ovo e/ou leite também foram encontradas por Graham (2000), Medeiros et al. (2002) e Vidament et al. (2002). Parece que muitos agentes crioprotetores são eficazes durante a congelação de sêmen eqüino, podendo substituir o glicerol sem prejuízo aos espermatozóides durante a criopreservação.

Quanto às características espermáticas, não houve alteração naquelas avaliadas (motilidade, vigor espermático e integridade funcional (HO) da membrana plasmática dos espermatozóides) após a descongelação com a redução da concentração de gema de ovo de 20% para 10%, nos diluidores com menor (D2 e D4) e maior (D1 e D3) concentração de açúcares e tampões, independentemente do crioprotetor intracelular utilizado. Quanto à quantidade de fosfolipídios, a proporção contida em 10% de gema de ovo (1,1%) já está acima da considerada ótima (entre 0,5% e 1,0%) por Pickett e Berndtson (1978). A concentração de gema de ovo nos diluidores de congelação de sêmen eqüino tem variado de 2% (Tischner, 1979; Palmer, 1984; Ecot et al., 2000; Vidament et al., 2001) a 20% (Martin et al., 1979; Braun et al., 1995), e sua substituição por componentes protéicos, como soro eqüino ou soro bovino ou albumina sérica bovina, nos diluidores usados para a congelação de sêmen eqüino, não tem proporcionado melhor efeito crioprotetor aos espermatozóides que a gema de ovo sozinha (Angola e Quintero, 1996) ou associada ao leite (Jasko et al., 1992; Braun et al., 1995; Juliani et al., 2002). Com tais resultados, a redução na porcentagem de espermatozóides estruturalmente íntegros observada em tratamentos contendo 10% de gema parece ser mais resultante da queda da osmolaridade ou composição do meio que o efeito da redução de gema de ovo, haja vista que meios com 10% de gema, mas com osmolaridade acima do diluidor-controle, mostraram-se igualmente eficientes em preservar a integridade estrutural das membranas espermáticas.

Independentemente da quantidade de gema de ovo, do crioprotetor intracelular utilizado, diluidores com maior concentração de açúcares e tampões (D1 e D3) e o diluidor-controle lactose-EDTA-gema de ovo (D5) preservaram melhor (P<0,05) a integridade estrutural das membranas plasmática e acrossomal dos espermatozóides do que os diluidores com uma menor concentração de açúcares e tampões (D2 e D4). Ficou evidente, assim, que, para os crioprotetores intracelulares e curvas de resfriamento utilizadas, a redução das quantidades de açúcares e tampões comprometeu a preservação da viabilidade espermática pós-descongelação. Essa influência foi significativa quando da análise da integridade estrutural da membrana e mostrou uma tendência consistente nos outros parâmetros avaliados. Considerando a preservação da integridade das membranas como um sinal que as demais estruturas presentes na cabeça também seriam preservadas na mesma intensidade, como, por exemplo, o núcleo, que é importante no processo de fertilização, os diluidores que apresentaram menor concentração de crioprotetores extracelulares (D2 e D4) demonstraram pouco potencial para serem utilizados na criopreservação de sêmen eqüino. A queda da viabilidade pode ser conseqüência da queda da osmolaridade do diluidor, resultante da redução nas quantidades dos crioprotetores extracelulares.

Faz-se necessário ressaltar que a composição adequada de um diluidor seminal não depende, apenas, de uma adequada concentração de crioprotetores intracelulares e extracelulares, mas da combinação ideal das substâncias que são utilizadas, levando-se em consideração qual a melhor fonte de energia para os espermatozóides, as melhores substâncias não iônicas, o tipo de macromoléculas e a concentração e o tipo ideal de crioprotetor intracelular. Isso porque, segundo Keith (1998), a presença de determinados açúcares, dependendo da concentração dessas substâncias nos diluidores de congelação de sêmen eqüino, influiu negativamente sobre a viabilidade espermática.

Além dos açúcares (glicose e lactose), os diluidores utilizados no presente experimento continham diferentes concentrações de substâncias tampões (citrato de sódio, bicarbonato de sódio e EDTA). Essas substâncias estavam em menor concentração nos piores meios (D2 e D4). De acordo com Bogart e Mayer (1950), existe uma aparente associação entre o grau de ionização dos sais que compõem os diluidores e os efeitos deletérios destes sais sobre os espermatozóides. Dessa maneira, parece que a sobrevivência espermática durante o armazenamento em baixas temperaturas, aparentemente, está inversamente relacionada com o grau de ionização desses sais. Aqueles pesquisadores, ao compararem algumas substâncias tampões, verificaram que o citrato de Na tem o menor índice de ionização, sendo considerado ótimo agente tampão. Segundo Silva et al. (1996), agentes crioprotetores extracelulares como as substâncias tampões podem agir sinergicamente com os crioprotetores intracelulares, propiciando ambiente adequado aos espermatozóides durante a congelação/descongelação. Além disso, a atividade metabólica dos espermatozóides causa aumento na concentração de íons hidrogênio no meio extracelular. Caso não exista nenhum mecanismo de remoção desses íons, ocorre redução do pH do meio onde os espermatozóides se encontram, acarretando diminuição na longevidade e fertilidade dessas células (Smith, 1984, citado por England, 1993).

O EDTA, que está presente no diluidor lactose-gema, sendo um quelante de cálcio (Graham, 1996), reduz a concentração deste íon no ambiente extracelular, o que, provavelmente, pode contribuir para minimizar a entrada de cálcio nos espermatozóides. Durante a criopreservação, as membranas dos espermatozóides sofrem mudanças na fluidez, semelhantes às que ocorrem durante a capacitação natural, tornando-as permeáveis aos íons cálcio que promovem tanto a capacitação como a reação acrossômica. Esses dois eventos limitam a sobrevivência dos espermatozóides por tempo prolongado, porque, nesse estágio, os espermatozóides estão preparados para fertilizar o ovócito e, quando a fertilização não acontece em um curto período de tempo, os espermatozóides não resistem e morrem (Watson, 1995). Pode também ter sido causa da queda na viabilidade espermática pós-descongelação, encontrada nos diluidores D2 e D4, a inadequada proporção de citrato de Na, EDTA e bicarbonato de Na presente nesses meios.

O diluidor com alta concentração de açúcares, tampões e sais e 20% de gema mostrou potencial para proteção da característica integridade estrutural das membranas plasmática e acrossomal. Este achado é encorajador e abre uma janela para estudos complementares de avaliação do efeito da osmolaridade dos diluidores sobre a preservação da viabilidade espermática pós-descongelação.

Recebido em 22 de julho de 2005

Aceito em 30 de novembro de 2006

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1

m OSMETTE TM, Model 5004 – Automatic Osmometer- Natick MA – USA

2

pHmetro DM 20 - Digimed

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Fev 2007

Histórico

• Aceito
  30 Nov 2006
• Recebido
  22 Jul 2005