Hidroxiapatita sintética como substituto ósseo em defeito experimental provocado no terço proximal da tíbia em cão: aspectos à microscopia eletrônica de transmissão

Sinthetic hydroxyapatite as bone substitute in the experimentally caused defect on the dog tibia proximal third: electronic transmission microscopy aspects

Hidroxiapatita sintética como substituto ósseo em defeito experimental provocado no terço proximal da tíbia em cão: aspectos à microscopia eletrônica de transmissão

[Sinthetic hydroxyapatite as bone substitute in the experimentally caused defect on the dog tibia proximal third:

electronic transmission microscopy aspects]

A.P.B. Borges¹, C.M.F. Rezende², M.F.B. Ribeiro³, E.G. Melo², P.I. Nóbrega Neto⁴

1Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa

Av. P.H. Rolfs s/n.

36571-000 – Viçosa, MG

²Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais

³Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais

⁴Escola de Veterinária da Universidade da Paraíba – Patos.

Recebido para publicação, após modificações, em 25 de setembro de 2000.

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Com o objetivo de estudar a hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo, foram utilizados oito cães adultos, sem raça definida, clinicamente sadios. Após protocolo anestésico e cirúrgico habituais, foi provocado um defeito ósseo na diáfise proximal das tíbias esquerda e direita, sendo implantada a HAP-91 apenas na tíbia direita. Os animais, dois de cada vez, foram sacrificados aos 8, 30, 60 e 120 dias após a cirurgia, quando foram obtidas amostras do local da lesão, que foram fixadas, lavadas, polimerizadas, cortadas e submetidas a dupla coloração em solução aquosa de acetato de uranila a 1% e em solução de citrato de chumbo. Essas secções foram avaliadas e fotografadas ao microscópio eletrônico de transmissão. Os componentes tissulares na tíbia tratada e na controle foram similares. A absorção da HAP-91 caracterizou-se pela presença de células multinucleadas na interface entre HAP-91 e osso, morfologicamente consideradas como osteoclastos. Ainda, encontraram-se grânulos de HAP-91 no interior de células morfologicamente caracterizadas como macrófagos. A absorção celular de grânulos de HAP-91, concomitante com a formação adjacente de osso novo, sugere que a osteointegração da HAP-91 seja análoga ao processo normal de reabsorção-aposição óssea.

Palavras-chave: Cão, hidroxiapatita sintética, substituto ósseo

ABSTRACT

With the objective of studying the synthetic hydroxyapatite (HAP-91) as a bone substitute, eight healthy mongrel adult dogs were used. Following the habitual anesthetic and surgical protocol, a bone defect was provoked in the proximal diafisis of the left and right tibias, being implanted the graft of HAP-91 just in the right tibia. The animals, two at each time, were sacrificed at the 8^th, 30^th, 60^th and 120^th days after the surgery, when lesion samples were obtained for histopathology, submitted to the double coloration in 1% uranil acetate solution and in lead citrate solution. These sections were examined and photographed in an electronic transmission microscope. The bone tissue components were identified both in the control and treated tibia. The absorption of HAP-91 was characterized by the presence of multinuclear cells in the interface between the hydroxyapatite and the bone, morphologically considered as osteoclasts. In addition, the concomitant presence of HAP-91, with the adjacent formation of new bone was found, which suggests that the osteointegration of HAP-91 is similar to the bone reabsorption apposition normal process.

Keywords: Dog, synthetic hydroxyapatite, bone substitute

INTRODUÇÃO

A utilização de técnicas histológicas que evidenciam fatores ultraestruturais permite estudar o processo de formação e reabsorção óssea associado a substitutos ósseos, bem como sua biodegradação. A hidroxiapatita sintética é um material biocompatível, não imunogênico e biodegradável (Nagahara et al., 1992; Overgaard et al., 1997; Borges, 1998). Entretanto, o mecanismo responsável por sua biodegradação ainda não está claro. Gomi et al. (1993) mostraram a presença de células multinucleadas na interface hidroxiapatita e osso depois da implantação, que podem ser caracterizadas morfologicamente como osteoclastos, responsáveis pela biodegradação da hidroxiapatita. Hemmerle et al. (1997) encontraram cristais de hidroxiapatita separados e espalhados em citoplasma de células com fatores ultraestruturais semelhantes a macrófagos. Borges (1998) encontrou osteoclastos ativos sobre a HAP-91 e alguns grânulos do produto no interior de macrófagos.

Donath (1990) relacionou o nível de reabsorção da hidroxiapatita com a sua sinterização. Nagahara et al. (1992) relataram que a hidroxiapatita sintetizada a 950^oC, quando implantada em fêmur de ratos, foi reabsorvida lentamente com notável separação do material e substituição por células mesenquimais com fatores ultraestruturais semelhantes a células osteogenitoras. Li et al. (1995) e Edwards et al. (1997) observaram que a reabsorção celular de grânulos de hidroxiapatita ocorre concomitantemente com a formação adjacente de osso novo.

Apesar de a hidroxiapatita não induzir neoformação óssea, normalmente utiliza-se o termo osteogênese (Nagahara et al., 1992). A reação de células osteogênicas com hidroxiapatita in vivo (Edwards et al., 1997; Borges, 1998) e in vitro (Bagambisa & Schilli, 1990) mostrou que a sua superfície é osteocondutiva. O resultado dessa atividade foi a deposição de tecido ósseo diretamente sobre a superfície da hidroxiapatita implantada, sem nenhuma evidência de encapsulação ou tecido de granulação (Bagambisa & Schilli, 1990). Entretanto, mesmo não sendo osteoindutora, a hidroxiapatita estimula a síntese de colágeno (Zambonin & Grano, 1995). Davies & Baldan (1997) mostraram que a neoformação óssea na interface osso-hidroxiapatita é morfologicamente comparável aos locais normais de remodelação óssea.

As fibras colágenas na matriz óssea podem ser orientadas paralela ou perpendicularmente à superfície da hidroxiapatita, de acordo com o tipo de tecido presente na interface osso- implante (Edwards et al., 1997). Para Louise et al. (1992), as fibras colágenas intimamente associadas com a superfície da hidroxiapatita ou localizadas em áreas de deposição de osteóide são orientadas de maneira perpendicular a esses grânulos. Em contraste, o tecido conjuntivo que rodeia a cápsula fibrosa apresenta camadas estratificadas de fibras colágenas e fibroblastos arranjados paralelamente à superfície do grânulo.

A presença de uma camada eletrodensa na ultraestrutura, na interfase osso-implante, observada algumas vezes, pode ser uma lâmina limitante de matriz óssea orgânica não mineralizada (Lange et al., 1990) ou pode ser uma reação patológica causada pela implantação do substituto in vivo (Oguchi et al., 1995). Entretanto, Daculsi et al. (1990) relataram que essa camada eletrodensa foi observada somente em secções descalcificadas e sugeriram a possibilidade de artefato, talvez representando restos de proteínas absorvidas na superfície do implante. Yamamoto et al. (1997) revelaram a presença de mineralização nessa camada eletrodensa. Ainda, o processamento histológico, especialmente a desidratação, induz contração das estruturas biológicas. Como não ocorre contração do implante, as forças atuam entre a interfase osso-implante podendo levar até a fratura, dependendo do tamanho da força de contração (Denissen & Groot, 1990).

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo na correção de defeito da diáfise proximal da tíbia de cães, por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET). O estudo baseou-se na caracterização dos tipos de células que participam do processo de osteointegração do material.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados oito cães adultos, entre dois e quatro anos de idade, sem raça definida, seis machos e duas fêmeas, clinicamente sadios, com média de peso de 12kg, oriundos do serviço de controle de Zoonoses da Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte. A HAP-91 (JHS - Laboratório Químico Ltda.) usada neste experimento foi produzida segundo Andrade et al. (1997), e para seu uso foi acondicionada em frascos de vidro, em quantidades predeterminadas, colocadas em autoclave a 120-130ºC, sob 1,5 pressão atmosférica, durante 30 minutos.

Seguindo o protocolo anestésico e cirúrgico habitual, foi provocado um defeito cortical em todos os animais, de aproximadamente 1,0 ´ 0,6cm na diáfise proximal medial das tíbias esquerda e direita, implantando-se o enxerto de HAP-91 apenas na tíbia direita. Na tíbia esquerda não foi feito preenchimento do defeito provocado, utilizando-a como controle. Os tecidos incisados foram suturados de maneira convencional.

Dois animais de cada vez foram sacrificados aos 8, 30, 60 e 120 dias de pós-operatório, de onde foram obtidas, por secção transversal, amostras do local do defeito ósseo, de ambas as tíbias, com cerca de 1,0mm³. Os fragmentos colhidos foram fixados em glutaraldeído a 2,5%. Eles permaneceram no fixador durante três horas e, então, foram lavados em solução tampão cacodilato, por três vezes, refixados em solução de tetróxido de ósmio a 2%, em tampão cacodilato, pH 7,2, à temperatura ambiente, por uma hora. As peças foram lavadas duas vezes em tampão cacodilato e submetidas à desidratação em álcool etílico, em concentrações crescentes.

Após desidratação, o material foi infiltrado com uma mistura de acetona e araldite, em partes iguais, durante 12 horas. Finalmente, procedeu-se a inclusão na mistura plena de araldite recém-preparada. O material incluído foi incubado a 40ºC, por uma hora, e posteriormente transferido para estufa a 60ºC, durante 24 horas, para polimerização da resina e conseqüente endurecimento.

Após inclusão, as amostras foram cortadas no ultramicrótomo (Sorvall Porter Blum MT₂D) utilizando-se navalha de diamante. Os cortes semifinos foram corados pelo azul de toluidina com o objetivo de escolher a melhor região para se fazerem os cortes ultrafinos, também com navalha de diamante.

Secções ultrafinas, de 60 a 90nm de espessura, foram colocadas em telas de cobre de 300 "meshs", e submetidas a dupla coloração, utilizando-se solução aquosa de acetato de uranila a 1%, por 30 minutos, e em solução de citrato de chumbo, por cinco minutos, em atmosfera de NaOH. Essas secções foram examinadas e fotografadas em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM 10) operado a 50KV. O material utilizado para documentação foi fotografado com filme (Cronalar HS-7-DuPont (chapa 8,0 ´ 10cm)) especial. Após revelado, as fotografias foram analisadas qualitativamente considerando o padrão de regeneração tecidual com base no tipo de células encontradas na osteointegração da hidroxiapatita sintética.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise das amostras examinadas confirma a biocompatibilidade da HAP-91, citada por Borges (1998). Esta foi avaliada pela ausência de células caracterizadas morfologicamente como linfócitos e células plasmáticas, responsáveis por um fenômeno imunológico ou pela ausência de reação do tipo corpo estranho caracterizada por células gigantes, em todos os períodos de observação.

Nas observações realizadas aos oito dias, notou-se a presença de células caracterizadas morfologicamente como provavelmente precursoras de osteoblastos, tanto nas amostras tratadas como nas amostras usadas como controle, em grau não diferente da regeneração óssea normal.

Aos 60 dias, em algumas amostras provenientes da tíbia tratada, observou-se a presença de células na interface entre hidroxiapatita e osso, morfologicamente caracterizadas como osteoclastos (Fig. 1), o que leva a crer na absorção da HAP-91 (Nagahara et al., 1992; Overgaard et al., 1997), sem evidência de encapsulação ou tecido de granulação, como encontrado por Bagambisa & Schilli (1990) e Gomi et al. (1993). Em outras amostras, observou-se a presença de HAP-91 no interior de células morfologicamente caracterizadas como macrófagos (Fig. 2). Esse quadro foi também encontrado por Hemmerle et al. (1997) e Borges (1998). Portanto, a absorção celular de grânulos de HAP-91 ocorreu por meio de osteoclastos e macrófagos, como citado por Borges (1998). Acredita-se que a grande quantidade de fluido intersticial presente no tecido conjuntivo facilita a absorção da HAP-91 por macrófagos. Mesmo assim, a absorção do produto foi lenta. Isto se baseia na sua presença em amostras processadas aos 120 dias após a implantação do substituto ósseo. Portanto, acredita-se que a absorção lenta tenha sido devida à sinterização a 900° C da HAP-91 (Andrade et al., 1997), como sugerido por Donath (1990), e observado em outros estudos citados na literatura. Nas amostras provenientes das tíbias não tratadas encontraram-se células caracterizadas morfologicamente como osteoclastos, não saindo do padrão da regeneração óssea normal.

Aos 120 dias foram observados dois padrões diferentes da interface hidroxiapatita-osso. Primeiro, a hidroxiapatita pareceu estar em contato direto com o osso (Fig. 3), fato observado na grande maioria das amostras processadas aos 30 e 60 dias. Essa relação de células osteogênicas com a HAP-91, em todas as fases do experimento, caracteriza sua superfície como osteocondutiva. O outro padrão encontrado em algumas partes da interface foi a hidroxiapatita separada do osso por uma camada de material eletrodenso, podendo ser artefato, como sugerido por Daculsi et al. (1990) e Denissen & Groot (1990). Entretanto, as observações de Lange et al. (1990) e Oguchi et al. (1995), segundo as quais a camada eletrodensa na interface hidroxiapatita-osso é devida à presença de tecido conjuntivo, devem ser consideradas, mesmo que Yamamoto et al. (1997) a considere mineralizada. Como as amostras não foram descalcificadas, a presença de macrófagos que participem da biodegradação, encontrada neste experimento, pode ser sugestiva de tecido conjuntivo não mineralizado, em determinadas áreas das amostras.

Em algumas amostras, a partir de 30 dias de observação, as fibras do colágeno, na interface osso-HAP-91, encontravam-se paralelas à superfície da hidroxiapatita. Em outras, as fibras de colágeno na região da interface aderiram-se perpendicular à superfície da hidroxiapatita. No grupo controle, as fibras de colágeno também foram orientadas paralela e perpendicularmente ao tecido cicatricial. Isso sugere que a orientação diferente das fibras de colágeno é possível ocorrer no processo normal de consolidação óssea, como encontrado por Louise et al. (1992), Zambonin & Grano (1995) e Edwards et al. (1997). A afirmação de Zambonin & Grano (1995) de que a hidroxiapatita estimula a síntese de colágeno não pôde ser avaliada neste experimento, uma vez que a presença de colágeno foi qualitativamente semelhante, tanto na tíbia tratada quanto na tíbia controle.

Observou-se, pelas características ultraestruturais morfológicas, reabsorção celular de grânulos de hidroxiapatita concomitante com a formação adjacente de osso novo, como sugerido por Nagahara et al. (1992), Li et al. (1995) e Davies & Baldan (1997). Portanto, acredita-se que esse processo seja análogo ao processo normal de reabsorção-aposição óssea, provavelmente com a mineralização ocorrendo nas fibras colágenas, semelhante ao de ossificação normal.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à JHS – Laboratório Químico Ltda, na pessoa da Professora Sheila M. C. Máximo, a valiosa colaboração científica prestada durante a elaboração deste trabalho e pelo financiamento parcial para a sua execução.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Fev 2001
• Data do Fascículo
  Dez 2000

Histórico

• Recebido
  25 Set 2000