Proteinograma sérico de bovinos da raça Curraleir

Serum protein concentration in Curraleiro bovine breed

MEDICINA VETERINÁRIA

Proteinograma sérico de bovinos da raça Curraleiro

Serum protein concentration in Curraleiro bovine breed

R.S. Juliano^I; M.C.S. Fioravanti^II; J.J. Fagliari^III; P.C. Silva^III; L.A.F. Silva^II

^ICPAP - Embrapa Pantanal. Caixa Postal 109. 79320-900 - Corumbá, MS

^IIEscola de Veterinária - UFG - Goiânia, GO

^IIIFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Jaboticabal, SP

RESUMO

Estudou-se o perfil eletroforético das proteínas séricas de bovinos sadios da raça Curraleiro por meio da técnica de eletroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio. Utilizaram-se amostras de soro sanguíneo de 228 bovinos da raça Curraleiro, 51 machos e 177 fêmeas, com idades entre sete meses e 12 anos, pertencentes a dois rebanhos localizados nos Estados de Goiás e Tocantins. Foram quantificadas proteína total e concentração plasmática de fibrinogênio. Verificaram-se variações nas concentrações das diferentes frações proteicas. Foram detectadas 26 proteínas e identificadas 10 delas. A ceruloplasmina esteve ausente em 78,1% dos indivíduos, e a α-antitripsina não foi detectada em nenhum animal. Proteína total, globulina, IgA, IgG e fibrinogênio aumentaram com a idade e houve correlação positiva entre os níveis séricos de haptoglobina e α1-glicoproteína ácida.

Palavras-chave: bovino, raça nativa, SDS-PAGE, proteína, fibrinogênio

ABSTRACT

The eletrophoretic serum protein profile in healthy Curraleiro bovine breed was studied by dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. A total of 228 serum samples from Curraleiro cattle, being 51 males and 177 females were analyzed. They were from seven month to 12-year-old and were raised in two farms of Goiás and Tocantins states. Total protein and plasma fibrinogen quantification were performed. It was possible to verify variation in proteins fractions concentration. Twenty-six proteins were detected and ten of them were identified. Ceruloplasmin was absente in 78,10% of animals and α-antitrypsin was not detected. The total protein, globulin, IgA, IgG, and fibrinogen increased with age and there was a positive correlaction between haptoglobin and α1-acid glycoprotein.

Keywords: cattle, native breed, SDS-PAGE, protein, fibrinogen

INTRODUÇÃO

O fracionamento eletroforético representa um dos mais confiáveis métodos de identificação de proteínas sanguíneas. Gordon (1995) relatou que a técnica de eletroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é relativamente simples e de baixo custo, possibilitando a visualização de baixas concentrações séricas e a quantificação de várias proteínas com boa acurácia. O emprego da técnica SDS-PAGE em medicina veterinária pode ser útil na avaliação da cinética das imunoglobulinas e de proteínas de fase aguda.

As imunoglobulinas representam a imunidade humoral dos animais, e sua quantificação pode ser especialmente importante na avaliação da imunidade colostral conferida aos bezerros nas primeiras 48 horas de vida (Fagliari et al., 2006).

O monitoramento da concentração das proteínas de fase aguda representa uma ferramenta importante no diagnóstico precoce, na avaliação do grau de severidade e acompanhamento da recuperação de enfermidades inflamatórias e infecciosas e na detecção de diferentes condições de estresse, com a finalidade de priorizar o bem-estar animal (Petersen et al., 2004). Entretanto, a padronização dos métodos e dos valores de corte é uma necessidade, ainda não totalmente estabelecida (Skinner, 2001; Ramirez et al., 2002).

A raça Curraleiro (Bos taurus ibericus) é um importante patrimônio genético trazido pelos portugueses ainda no período colonial, que sofreu seleção natural de aproximadamente 500 anos. No entanto, essa população está sob risco de extinção e faz-se necessária a ampliação do conhecimento sobre suas características fisiológicas como forma de estabelecer métodos para a elaboração de estratégias de manejo, acompanhamento e conservação da raça.

O objetivo deste trabalho foi estabelecer o proteinograma sérico e a concentração de fibrinogênio plasmático da raça Curraleiro, em diferentes faixas etárias.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram examinadas amostras de soro sanguíneo de 228 bovinos da raça Curraleiro, 51 machos e 177 fêmeas, com idade variando entre sete meses e 12 anos, pertencentes a dois rebanhos localizados nos Estados de Goiás e Tocantins. Todos os animais foram submetidos a exames semiotécnicos e considerados clinicamente hígidos.

A concentração sérica de proteína total foi determinada pelo método do biureto, utilizando-se conjunto de reagentes comercial¹ e leitura da amostra em espectrofotômetro². Para o fracionamento das proteínas séricas, utilizou-se a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE, proposta por Weber e Osborn (1969). A leitura das frações proteicas foi realizada em videodensitômetro³. As proteínas foram identificadas comparando-se sua mobilidade eletroforética com a de marcador com pesos moleculares de 28.000 dáltons (D), 45.000 D, 66.000 D, 97.400 D, 116.000 D e 205.000 D e das proteínas purificadas⁴ albumina, transferrina, ceruloplasmina, α₁-antitripsina, haptoglobina, imunoglobulina A (IgA) e imunoglobulina G (IgG) de cadeias leve e pesada.

Foi realizada a quantificação de fibrinogênio, pela técnica de precipitação no tubo de microematócrito a 56ºC, segundo Jain (1993).

Os resultados foram analisados pelo software GraphPad Prism 5 for Windows⁵, comparando-se as médias entre grupos pelos testes não paramétricos Kruskall-Wallis ou Mann-Whitmann. Utilizou-se a correlação de Spearman e foram considerados três níveis de correlação para a interpretação dos resultados obtidos: fraco (de 0% a 30% de probabilidade); médio (de 31% a 70% de probabilidade) e alto (a partir de 70% de probabilidade), conforme descrito por Sampaio (1998).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um total de 26 proteínas foi verificado no traçado densitométrico obtido em SDS-PAGE, dez delas identificadas nominalmente (Tab. 1). Muitas frações proteicas estiveram ausentes em alguns animais, principalmente a ceruloplasmina, uma proteína de fase aguda (PFA). A α₁-antitripsina, outra PFA, não foi detectada em nenhum animal, mas não foi estabelecido um padrão de comportamento em relação à ausência das proteínas na população, como foi realizado por Fagliari et al. (2006), no qual foram identificados três grupos distintos de proteinogramas em bezerros. Entretanto, deve-se levar em consideração que os animais utilizados eram provenientes de diferentes propriedades e grupos genéticos, portanto uma variação qualitativa e quantitativa do perfil proteico era esperada.

A concentração de proteína total (PT) e de globulinas (G) apresentou média e desvio-padrão dentro de valores citados por Barini (2007) para animais da raça Curraleiro, mas o teor de albumina (A) obtido foi maior do que o encontrado pela autora. Souza (1997) descreveu concentrações de PT para a raça Holandesa (7,57±0,09g/dL) próximas às obtidas neste trabalho. Comparando com resultados citados por Souza et al. (2004), os valores de A foram maiores do que os relatados para raça Jersey (3,24±0,28g/dL) e Holandesa (3,08±0,25g/dL), entretanto a dosagem de G foi maior que a da raça Jersey (3,13±0,81g/dL) em animais mais velhos, mas semelhante à da Holandesa (3,73±0,99g/dL). Jordan et al. (2006) verificaram valores mais elevados de PT (8,9±1,4g/dL) e G (5,5±1,3g/dL) e mais baixos de A (3,1±0,4g/dL), em animais da raça Toro de Lidia, enquanto Grünwaldt et al. (2005) obtiveram valores maiores de A (4,20±0,58g/dL) e menores de G (3,30±0,13g/dL) em vacas da raça Criollo Argentino.

As concentrações de PT e G no soro sanguíneo aumentaram (P<0,05) com a idade, enquanto o teor de A manteve-se constante nas diferentes faixas etárias (Tab. 2). Barini (2007) observou comportamento semelhante em animais dessa mesma raça.

Segundo Jain (1993), o leve decréscimo na concentração de A e um aumento progressivo de G são fisiológicos e estão relacionados à maior produção de imunoglobulinas (Ig), pela exposição antigênica dos indivíduos com o avançar da idade. Isso poderia explicar o aumento significativo (P<0,05) dos níveis de IgA e IgG, a partir dos 25 meses de idade, encontrados nestes animais.

A relação A:G foi semelhante à encontrada por Souza et al. (2004), para as raças Jersey (1,10±0,29g/dL), Holandesa (0,91±0,36). Na raça Criollo Argentino (1,27g/dL), estudada por Grünwaldt et al. (2005), a relação também foi próxima à deste estudo, mas maior que a da raça Toro de Lídia (Jordan et al., 2006), que foi de 0,56g/dL.

Os valores encontrados de fibrinogênio (F) estão dentro da média e desvio padrão encontrados por Borges (2008), que estudou bovinos naturalizados da raça Pantaneira e citou 0,47±0,19g/dL para animais até dois meses de idade, 0,35±0,17g/dL de seis a 12 meses, seguido de elevação constante até o pico máximo de valores em animais com mais de 60 meses (493,65±199,52mg/dL), isto é, houve aumento significativo dessa proteína com o avançar da idade. Da mesma forma, a concentração de F foi menor (P<0,05) até os 12 meses em bovinos da raça Curraleiro. A média da relação PT:F situou-se na faixa de normalidade estabelecida por Jain (1993). Esse autor citou não haver alteração dos níveis plasmáticos de fibrinogênio com a mudança de idade, entretanto alguns fatores, como alteração hidroeletrolítica, vacinação e gestação e parto, podem elevar temporariamente sua concentração.

A literatura cita valores entre 0,08 a 0,8g/dL para concentração de IgA em bovinos (Buttler, 1971). Segundo Kiddy et al. (1971), os níveis de IgA diferem nas semanas pré (0,12±0,008g/dL) e pós parto (0,05±0,01g/dL). Fagliari et al. (2006), ao avaliarem a transferência passiva dessa Ig, encontraram valores entre 0,26 e 0,40g/dL em bezerros da raça Holandesa, 48h após o nascimento. A função da IgA na resposta imunológica dos animais de produção não foi totalmente elucidada, mas seu papel parece estar relacionado a um estímulo inflamatório como uma segunda linha de defesa na eliminação de patógenos que tenham rompido a barreira das superfícies mucosas (Snoeck et al., 2006).

Moll (1971) descreveu níveis séricos de IgG para a raça Holandesa (1,45±0,63g/dL) e Jersey (1,05±0,41g/dL). Os valores obtidos no presente trabalho foram mais altos que os descritos por Fagliari et al. (2006) de 1,96±0,26g/dL, para bezerros recém-nascidos. Feitosa e Birgel (2000) citaram valores próximos no pré-parto (2,46±0,83g/dL) e parto (2,290±0,79g/dL), em vacas da raça Holandesa, entretanto, aos 30 (3,46±0,88g/dL) e 180 dias (3,74±0,79g/dL) após o parto, sua concentração foi maior do que a encontrada para a raça Curraleiro com idade acima de 25 meses.

A concentração de ceruloplasmina (Tab. 3) foi menor que a encontrada por Fagliari et al. (2006) em bezerros recém-nascidos. Essa proteína de fase aguda esteve ausente em 78,1% dos animais amostrados, situação descrita em um grupo de animais por esses autores. Em humanos, existem variantes eletroforéticas dessa proteína, e os mecanismos que interferem na concentração sérica e nas suas funções in vivo na homeostase do ferro e cobre são pouco conhecidos. Em suínos, a deficiência de cobre está associada à diminuição dos níveis de ceruloplasmina, com consequente acúmulo de íons ferro nos tecidos, enquanto em cães essa proteína atua como ferroxidase, responsável pela captação desse elemento, incorporando-o à transferrina (Hellman e Gitlin, 2002)

Moser et al. (1994), ao avaliarem os teores de transferrina em vacas e bezerros em diferentes condições fisiológicas e sanitárias, verificaram valores entre 200 a 660mg/dL em animais sadios, semelhantes aos relatados neste estudo, entretanto não houve diferença entre as faixas etárias, diferente dos resultados obtidos por esses autores, que relataram menor concentração dessa proteína em animais adultos.

Os teores de haptoglobina foram mais baixos que os descritos por Fagliari et al. (2006) e diferentes daqueles verificados por Eckersall e Conner (1988), que citaram sua ausência em animais sadios ou em concentrações muito baixas em bezerros. A concentração dessa proteína de fase aguda foi mais alta que a encontrada por Ramirez et al. (2002), em vacas da raça Holandesa e mestiças (17,5 a 17,7mg/dL); também foi diferente dos achados de Chan et al. (2004), que estudaram as oscilações nos teores dessa proteína, durante o período de um ano, em vacas da raça Holandesa, e obtiveram valor basal de 7,36mg/dL.

Observou-se correlação positiva média entre os valores da α1-glicoproteína ácida e de haptoglobina. Cairoli et al. (2006) descreveram comportamento semelhante e pequena elevação fisiológica dessas proteínas no período pré-parto. A concentração de α1-glicoproteína ácida foi semelhante aos valores encontrados por Fagliari et al. (2006) e próxima à média obtida para vacas adultas da raça Holandesa (28,32±8,23mg/dL), citada por Tamura et al. (1989). É possível que a α1-glicoproteína ácida participe na manutenção da homeostase local, reduzindo os danos teciduais provocados pelos processos inflamatórios, e esteja envolvida no processo de resistência às bactérias (Lecchi et al., 2009).

Embora a raça Curraleiro tenha sua origem em raças europeias, como a Jersey ou a Holandesa, e seja uma adaptação das raças ibéricas, como a Toro de Lídia e a Criollo Argentino, utilizadas para a discussão dos resultados deste trabalho, as diferenças e semelhanças encontradas são compreensíveis, pois pode haver interferência múltipla de fatores genéticos, nutricionais, metabólicos, fisiológicos e imunológicos nos níveis das proteínas (Kaneko, 1997).

CONCLUSÃO

Foi possível verificar variações significativas nas concentrações de PT, G, IgA, IgG e fibrinogênio em relação à idade e correlação positiva entre os níveis séricos de haptoglobina e α1-glicoproteína ácida. Os resultados descritos podem ser úteis em estudos comparativos da raça Curraleiro, entretanto há necessidade de pesquisar sobre a relevância dessas proteínas na avaliação de estados clínicos e fisiológicos desses animais.

Recebido em 10 de agosto de 2008

Aceito em 8 de abril de 2009

E-mail: [e-mail]

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Labtest® - Belo Horizonte, Brasil.

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Bioplus®, modelo Bio-2000 IL-A2 - São Paulo, Brasil.

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Shimadzu CS9000, Shimadzu Corp.- Kyoto, Japão.

4

Sigma Chemical Co. - Saint Louis, MO, EUA.

5

GraphPad Software, Inc. - San Diego, CA, EUA.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Jul 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Aceito
  08 Abr 2009
• Recebido
  10 Ago 2008