Utilização da lipoproteína de baixa densidade, em diferentes concentrações, em meio diluidor para criopreservação do sêmen ovino

Use of low density lipoprotein in different concentrations in diluent medium for cryopreservation of ovine semen

RESUMO

A utilização da gema de ovo dificulta a padronização de meios diluidores e apresenta riscos biológicos. Assim, este estudo avaliou diferentes concentrações da lipoproteína de baixa densidade (LDL), em substituição à gema de ovo, para a confecção de diluentes para criopreservação espermática em ovinos. Foram utilizados um diluidor controle (CTR= 20% de gema de ovo) e cinco tratamentos, substituindo-se a gema pelas diferentes proporções de LDL (T1=6%; T2=8%; T3=12%; T4=16%; T5=20%), todos à base de TRIS-glicerol. Para o estudo, utilizaram-se dois ejaculados, de seis reprodutores da raça Santa Inês. Sessenta dias após a criopreservação, as amostras foram descongeladas e avaliadas subjetivamente quanto à motilidade total (MT, %) e progressiva (MP, %), ao vigor (1-5) e à integridade funcional (choque hisposmótico com água destilada, %) e estrutural (corante supravital eosina, %) das membranas espermáticas. As avaliações de vigor e funcionalidade de membrana não diferiram (P>0,05) entre os grupos. Entretanto, os grupos T4 (P<0,01) e T5 (P<0,05) foram superiores ao CTR para os parâmetros MT, MP e integridade estrutural de membrana, o que confirma que as LDLs podem ser alternativas eficientes para substituição da gema de ovo em diluidores para criopreservação de sêmen ovino.

Palavras-chave: LDL; espermatozoide; Ovis aires

ABSTRACT

The use of egg yolk makes it difficult to standardize extenders and presents biological hazards. Thus, this study evaluated different concentrations of low-density lipoprotein (LDL) to replace yolk extenders for production of sperm for cryopreservation in ovine. A control extender was used (CTR= 20% yolk) and five treatments, replacing the yolk by different ratios of LDL (T1= 6%; T2= 8%, T3= 12%; T4= 16%; T5= 20%) all based on TRIS-glycerol. For the study, two ejaculates from six Santa Ines breeding were used. Sixty days after cryopreservation, the samples were thawed and evaluated for total motility (MT, %) and progressive motility (MP, %), vigor (1-5) and the functional integrity (hyposmotic shock with distilled water, %) and structural (supravital dye eosin, %) of the sperm membranes. The evaluations of strength and membrane functionality didn’t differ (P> 0.05) between groups. However, T4 (P< 0.01) and T5 (P< 0.05) groups were superior to the CTR for the MT, MP, and membrane structural integrity parameters, which confirms that LDLs can be efficient alternatives for yolk replacement in extenders for cryopreservation of ovine semen.

Keywords:  LDL; sperm Ovis aires

INTRODUÇÃO

A criopreservação espermática é uma ferramenta importante para o melhoramento genético dos ovinos devido à possibilidade de preservar material genético superior por tempo indeterminado (Leboeuf et al., 2000), além de reduzir custos e riscos relacionados à aquisição do reprodutor, facilitar o transporte das doses de sêmen para qualquer região e aumentar o número de progênies por macho, quando associado à técnica de inseminação artificial (IA), o que favorece a disseminação de material genético de qualidade superior em vários locais ao mesmo tempo (Leboeuf et al., 1998). Entretanto, após o processo de congelação e descongelação do sêmen, uma grande parte dos espermatozoides se torna inviável (Bailey et al., 2000).

A fim de obter um maior número de células viáveis após o processo de congelação e descongelação do sêmen, diversos fatores devem ser observados; destaca-se, entre eles, o tipo, a composição do diluente e a concentração do crioprotetor espermático (Castelo et al., 2008; Salamon e Maxwell, 1995). Com isso, diferentes diluidores, a maioria à base de gema de ovo integral, têm sido testados com o intuito de minimizar esses efeitos deletérios (Salamon e Maxwell, 2000). Estudos têm demonstrado que, apesar dos crescentes avanços no processo de criopreservação espermática, a maioria dos protocolos vigentes propõem redução de taxas - entre 50 e 60% - de sobrevivência espermática pós-descongelação (Celeghini et al., 2008). Outro aspecto importante é que existem diversas restrições ao uso da gema de ovo como componente de diluidores para congelação de sêmen de pequenos ruminantes, entre eles, o risco sanitário de contaminação por patógenos nas doses de sêmen (Moussa et al., 2002), assim como a presença da porção granular que interfere na visualização microscópica de gametas, além da ação de alguns constituintes prejudiciais à motilidade e ao metabolismo espermático (Pace e Graham, 1974; Vera-Munhoz et al., 2009).

A utilização da lipoproteína de baixa densidade (LDL) tem sido uma alternativa promissora em substituição à gema de ovo na técnica de criopreservação espermática (Pillet et al., 2011), pois é a fração da gema de ovo que protege os espermatozoides contra os efeitos deletérios do processo de criopreservação e age apresentando um ambiente favorável à sobrevivência espermática (Amirat-Briand et al., 2010; Varela Junior et al., 2009). A utilização das LDLs nos diluidores seminais tem se mostrado eficiente para manutenção dos parâmetros espermáticos in vitro e mantido ou melhorado os índices de fertilidade em comparação ao sêmen congelado em meios diluidores convencionais (Moustacas et al., 2011). Contudo, faz-se necessária a realização de mais trabalhos para a padronização da melhor concentração de LDL a ser incorporada ao diluidor à base desse constituinte na espécie ovina (Moussa et al., 2002). Com isso, este estudo teve como objetivo avaliar, em um único estudo, as principais concentrações de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), testadas anteriormente em diferentes trabalhos, para a substituição da gema de ovo em diluidores para criopreservação espermática em ovinos.

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (Ceua), licença 41/2014. Para o estudo, foram utilizados seis ovinos da raça Santa Inês, com idades variando entre 10 e 36 meses, todos submetidos à vermifugação e à nutrição balanceada, composta por ração própria para ovinos, além de fornecimento de feno, sal mineral e água ad libitum. Trinta dias antes do início das congelações de sêmen, cada reprodutor foi submetido a duas coletas de sêmen, por meio de vagina artificial, em dias alternados. Aqueles que possuíam os parâmetros preconizados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução (Manual..., 2013) foram incluídos no trabalho.

Posteriormente à coleta, os ejaculados foram avaliados quanto às características físicas, tais como o volume, a cor, o aspecto e o odor, bem como quanto às características microscópicas, por meio de turbilhonamento, motilidade total e progressiva, vigor espermático e viabilidade funcional e estrutural de membrana, pelo choque hiposmótico com água destilada e corante supravital eosina, respectivamente (Manual..., 2013; Menezes et al., 2013; Barth e Oko, 1989).

A fim de avaliar a melhor concentração das LDLs, foram formulados cinco diluidores com diferentes concentrações de LDL, além do diluidor controle (Bittencourt et al., 2008) à base de TRIS-gema de ovo (CTR- 20% de gema de ovo). Compuseram o estudo o tratamento 1 (T1-6% de LDL), o tratamento 2 (T2-8% de LDL), o tratamento 3 (T3-12% de LDL), o tratamento 4 (T4-16% de LDL) e o tratamento 5 (T5-20% de LDL). Para a composição do meio base, foi utilizada a solução TRIS-gema de ovo e glicerol (Bittencourt et al., 2014), substituindo-se totalmente a gema de ovo por LDL para os diferentes tratamentos.

Posteriormente às análises iniciais e à concentração espermática, um total de 1mL dos seis diluidores foi adicionado lentamente a microtubos aquecidos, cada um contendo 320 x 10⁶ espermatozoides com motilidade progressiva. Isso compôs quatro doses inseminantes com 80 x 10⁶ de espermatozoides com motilidade progressiva/0,25mL por grupo experimental. Na sequência, as amostras foram submetidas ao resfriamento a 5^oC (0,47^oC/min), tempo de equilíbrio (total de duas horas), e, então, congeladas em nitrogênio líquido (Bittencourt et al., 2008).

As descongelações das amostras foram realizadas ao menos 60 dias depois, incubando-se as palhetas em banho-maria a 37°C, por 30 segundos (Lucidi et al., 2001), e, em seguida, foram submetidas à análise subjetiva, conforme preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (Manual..., 2013), de motilidade total (MT, %), motilidade progressiva (MP, %) e vigor espermático (VIG, 1-5). A avaliação da integridade funcional (HOST, %) da membrana plasmática foi realizada pelo choque osmótico, com água destilada (Menezes et al., 2013), e, quanto à integridade estrutural (SV, %), foi utilizado o corante supravital eosina (Barth e Oko, 1989). Todas as análises de todos os diluidores testados foram realizadas pelo mesmo avaliador, que recebia as amostras identificadas por números aleatórios. Dessa forma, apenas o auxiliar responsável pelas anotações tinha conhecimento de que grupo experimental se tratava.

Para o delineamento estatístico, os ejaculados foram considerados repetições e os diferentes meios diluidores foram considerados tratamentos. As médias e o desvio-padrão das características de interesse do estudo foram obtidos por meio de análise descritiva. Os resultados foram submetidos ao pacote estatístico SAS, versão 9.0 (2002). Como todas as amostras apresentaram padrão não normal de distribuição (Shapiro-Wilk), procedeu-se ao teste de Kruskal-Wallis para estudo de eventuais diferenças das características espermáticas entre os diluidores testados. Quando confirmada a diferença entre os grupos, o parâmetro espermático foi comparado entre os grupos, individualmente, com o teste de Bonferroni. Todas as análises consideraram o nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Como pode ser observado na Fig. 1, as porcentagens de MT nos tratamentos T4 (53%) e T5 (50%) foram significativamente maiores (P<0,05) quando comparadas à do tratamento CTR (31%). Na comparação entre grupos com LDL, a MT do grupo T4 (53%) foi superior (P<0,05) às obtidas no T1 (34%), T2 (34%) e T3 (41%). Em relação à MP, os grupos T4 (P<0,01) e T5 (P<0,05) foram superiores ao grupo CTR, apresentando percentuais de 45% e 43% para os grupos T4 e T5, respectivamente, versus 24% para o grupo CTR, sem diferença entre os demais grupos estudados.

Figura 1
Comparação dos percentuais médios obtidos para: (a) motilidade espermática total (MT) e (b) motilidade espermática progressiva (MP) pós-descongelação, de sêmen criopreservado de ovinos Santa Inês, entre os diferentes tratamentos experimentais. CTR - tratamento controle com 20% de gema de ovo; T1 - tratamento com 6% de LDL; T2 - tratamento com 8% de LDL; T3 - tratamento com 12% de LDL; T4 - tratamento com 16% de LDL; e T5 - tratamento com 20% de LDL. * Representa diferença significativa com P<0,05. ** Representa diferença significativa com P<0,01. Foram empregados os testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Bonferroni.

Na avaliação da SV, o valor obtido para o grupo T5 (24%) foi superior (P<0,05) aos grupos CTR (16%), T1 (12%) e T2 (13%); no entanto, não diferiu (P>0,05) dos encontrados para T3 (18%) e T4 (19%). Para os parâmetros de VIG e HOST, entretanto, não houve diferença estatística (P>0,05) entre os grupos experimentais (Tab. 1).

Tabela 1
Análise do vigor espermático (VIG), dos percentuais de células com integridade estrutural da membrana plasmática avaliada pelo corante eosina (SV) e da integridade funcional da membrana plasmática avaliada pelo choque osmótico (HOST) pós-descongelação, de sêmen criopreservado de ovinos Santa Inês, entre os diferentes tratamentos experimentais. Os valores expressam as médias de cada tratamento

Parâmetros	Tratamentos
	CTR	T1	T2	T3	T4	T5
VIG (1-5)	3,15	3,4	3,4	3,4	3,6	3,6
SV (%)	16b	12b	13b	18ab	19ab	24a
HOST (%)	11	10	10	5	12	7

• CTR - tratamento controle com 20% de gema de ovo; T1 - tratamento com 6% de LDL; T2 - tratamento com 8% de LDL; T3 - tratamento com 12% de LDL; T4 - tratamento com 16% de LDL; e T5 - tratamento com 20% de LDL. ^{a, b} Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística entre os grupos experimentais (P<0,05). Foram empregados os testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Bonferroni.

DISCUSSÃO

Após a criopreservação, a qualidade do sêmen descongelado é reduzida em várias espécies, sendo associada principalmente aos estresses térmico, osmótico e oxidativo (Martinez-Páramo et al., 2012). O Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (Manual..., 2013) preconiza, para ovinos, valores ≥ 30% para o parâmetro MT, após descongelação. Neste estudo, a média para MT (40,5%) foi superior à recomendada pelo CBRA. Conclui-se que todos os diluidores estudados, com gema de ovo integral ou LDL, proporcionaram índices adequados de manutenção da MT pós-descongelação.

Lipoproteínas de baixa densidade é a fração da gema de ovo responsável pelo seu efeito crioprotetor, pois impede o efluxo de fosfolipídios e colesterol da membrana plasmática da célula espermática, ao se aderir à membrana (Majunath et al., 2002; Moussa et al., 2002; Amirat Briand et al., 2004), além de promover a incorporação de fosfolipídios e colesterol na membrana espermática (Graham e Foote, 1987; Bergeron et al., 2004), melhorando, assim, a resistência espermática ao choque térmico, o que favorece o aumento nos índices de motilidade, integridade acrossomal e integridade de membrana plasmática (Graham e Foote, 1987; Demaniowicz e Strzezek, 1996; Moussa et al., 2002).

As variações observadas para os parâmetros de MT entre os grupos estudados justificam-se pelas diferentes concentrações de LDL utilizadas, as quais proporcionaram diferentes níveis de proteção espermática. De uma forma geral, todos os diluidores que continham LDL promoveram médias de MT semelhantes ou superiores ao diluidor controle com gema de ovo. Essa superioridade (P<0,05), verificada por diluidores que sofreram substituição completa da gema de ovo integral por percentuais mais altos de LDL, ainda não havia sido relatada, mesmo em estudos que empregaram concentrações de LDL semelhantes às dos diluidores deste estudo, o T4 (16%) e o T5 (20%) (Moustacas et al., 2011). Já quanto aos diluidores com menores percentuais de LDL (T1-6%, T2-8%), apesar de não apresentarem índices superiores de manutenção da MT pós-descongelação, quando comparados ao diluidor controle com gema de ovo, suas médias não diferiram (P>0,05). Relato semelhante foi descrito por Silva et al. (2014), que compararam diluidores com 4 e 8% de LDL e grupo controle com 15% de gema de ovo integral e não observaram diferença (P>0,05) na MT.

Outra possibilidade que contribuiu para a maior eficiência dos diluidores T4 e T5 para manutenção da MT pós-descongelação, em relação ao CTR, é que, nos grupos com LDL, estão ausentes constituintes, como as lipoproteínas de alta densidade (HDL), da gema de ovo, as quais interferem na cinética e no metabolismo da célula espermática (Vera-Munhoz et al., 2009).

Estudo de Moustacas et al. (2011), com ovinos, avaliaram a utilização da LDL como alternativa à gema de ovo integral (16%), na composição de diluidores seminais, e, diferentemente do presente estudo, não constataram diferença significativa para os parâmetros de motilidade total e progressiva pós-descongelação nos meios à base de gema de ovo ou LDL. Já Moussa et al. (2002), em estudo com bovinos, verificaram que a MT pós-descongelação foi superior quando se utilizou, para a criopreservação espermática, diluidor com percentual intermediário de LDL (8%), em comparação com percentuais superiores (9 e 10%), o que diferiu dos resultados obtidos no presente estudo, que apresentou melhores (P<0,05) índices de manutenção da MT com percentuais mais elevados de LDL (16 e 20%). Essas discordâncias entre os trabalhos podem ser explicadas por inúmeros fatores que podem interferir no resultado, como as diferenças na composição dos diluidores empregados, bem como de espécie, da variabilidade individual e dos distintos protocolos de processamento do sêmen e descongelação.

Assim como verificado para a motilidade espermática, os resultados obtidos pós-descongelação para o vigor espermático, em todos os diluidores estudados, mantiveram-se acima dos padrões exigidos pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (Manual..., 2013), que estabelece que o VIG seja ≥ 3,0 (1-5). Esse achado reforça a observação feita anteriormente de que os diluidores com LDL foram eficientes para a manutenção dos parâmetros subjetivos de cinética espermática. Embora não tenha ocorrido, um menor VIG para os espermatozoides criopreservados com gema de ovo era esperado, já que esse componente na forma integral dificulta a movimentação da célula espermática, devido à presença de HDL, que causa redução de cinética espermática (Demaniowicz e Strzezek, 1996).

Embora a integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozoides não tenha sofrido influência dos diluidores testados, o mesmo fato não aconteceu com a integridade estrutural da membrana plasmática, cujo maior (P<0,05) percentual de espermatozoides com membrana íntegra (SV) foi verificado para o grupo com maior percentual de LDL (T5-20%), quando comparado aos grupos com menores percentuais (T1-6% e T2-8%). Esse resultado, possivelmente, ocorreu pela maior estabilidade conferida à membrana plasmática com a maior oferta de moléculas de LDL, que, ao se romperem durante a criopreservação, forneceram quantidades adequadas de fosfolipídios e colesterol, os quais se incorporam à membrana plasmática do espermatozoide, durante o processo de criopreservação, além de inibirem a toxicidade de algumas proteínas do plasma seminal, que acabam ligando-as às LDLs (Moussa et al., 2002).

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos demonstraram que as lipoproteínas, nas diferentes concentrações estudadas, podem substituir a gema de ovo integral no diluidor de congelação do sêmen ovino, com índices de manutenção dos parâmetros espermáticos superiores nos tratamentos T4-16% LDL e T5-20% LDL.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Dez 2019
• Data do Fascículo
  Nov-Dec 2019

Histórico

• Recebido
  25 Jul 2018
• Aceito
  24 Jan 2019