AÇÃO DO DICLOFENACO DE SÓDIO EM ANASTOMOSES REALIZADAS NO INTESTINO DELGADO DE RATOS

AÇÃO DO DICLOFENACO DE SÓDIO EM ANASTOMOSES REALIZADAS NO INTESTINO DELGADO DE RATOS¹

José Guilherme Minossi²

Celso Vieira de Souza Leite²

Luiz Eduardo Naresse ²

Maria Aparecida M. Rodrigues ³

Paulo Roberto Curi ⁴

Shoiti Kobayasi ⁵

MINOSSI, J.G.; LEITE, C.V.S.; NARESSE, L.E.; RODRIGUES, M.A.M.; CURI, P.R.; KOBAYASI, S. – Ação do diclofenaco de sódio em anastomoses realizadas no intestino delgado de ratos. Acta Cir. Bras., 13(1): 37-43, 1998.

RESUMO: Este trabalho avaliou a ação do Diclofenaco de Sódio (DS) na cicatrização de anastomoses realizados no íleo terminal de ratos, tendo sido analisados os seguintes parâmetros: evolução clínica, resistência mecânica, colágeno tecidual e alterações histopatológicas. Foram utilizados 519 ratos Wistar divididos em 4 grupos experimentais. O Grupo 1: Controle sem anastomose, 52 ratos tratados com solução fisiológica (SF)3 ml/kg de peso, administrada por via intra-muscular (IM) por 4 dias; Grupo 2: 110 ratos submetidos à anastomose no íleo terminal + SF; Grupo 3: 52 ratos tratados com DS na dose de 3 mg/kg de peso por dia, IM, por 4 dias e o Grupo 4: 295 ratos tratados com DS e submetidos à anastomose no íleo terminal, recebendo DS de maneira idêntica ao grupo anterior. Dez animais sem manipulação, foram utilizados para medidas da força de ruptura e dosagens bioquímicas, com obtenção de parâmetros caracterizados como MO. Os parâmetros foram analisados no 4^o, 7^o, 14^o e 21^o dia de pós-operatório. Os animais do Grupo 1 não apresentaram alterações clínicas durante o período de acompanhamento. No Grupo 3, 15,4% dos animais apresentaram diarréia. Neste grupo houve uma diminuição do colágeno tecidual e da força de ruptura quando comparados com o grupo 1. Entre os animais submetidos à anastomoses no íleo terminal, observou-se taxa de mortalidade maior nos animais que receberam DS, além de retardo na cicatrização, caracterizado por uma maior reação inflamatória polimorfonuclear, retardo na regeneração da mucosa, diminuição de macrófagos e do colágeno tecidual. Pelos resultados obtidos concluiu-se que o DS é deletério à evolução cicatricial de anastomoses realizadas no íleo terminal de ratos.

Subject Heading: Healing: Diclofenaco de Sódio. Anastomose Cirúrgica. Intestino Delgado.

INTRODUÇÃO

A evolução da cicatrização das anastomoses intestinais pode ser adversamente influenciada por vários fatores locais ou sistêmicos, documentados em estudos clínicos e experimentais. Dentre eles, podemos citar a técnica cirúrgica e o fio de sutura utilizados, a desnutrição, a anemia, o diabetes, a irradiação, a utilização de drenos, e a infecção, sendo esta, uma das causas mais freqüentes de deiscência das feridas cirúrgicas ^{1, 2,3,4,5}.

Os efeitos das drogas anti-inflamatórias não hormonais (AINE) sobre a cicatrização intestinal ainda são pouco conhecidos e controversos. Alguns autores relatam que os AINE favorecem a cicatrização intestinal, enquanto outros mostram efeitos deletérios sobre a cicatrização intestinal, por aumentarem a taxa de deiscência das anastomoses e, consequentemente, favorecerem uma maior taxa de mortalidade^6,7,8,9,10.

Embora os AINE sejam estruturalmente diferentes, apresentam mecanismo de ação semelhante, que é atribuído, principalmente, ao bloqueio da biossíntese das prostaglandinas, através da inibição da enzima cicloxigenase e/ou da lipoxigenase^11,12. As prostaglandinas, particularmente as dos grupos E₁ e E_2, exercem um efeito citoprotetor sobre todo trato digestivo, através do aumento do fluxo sangüíneo na mucosa, desempenhando papel importante na proliferação celular e na neovascularização tecidual^13,14,15.

Os AINE, por sua vez, também determinam alterações importantes na fosforilação oxidativa mitocondrial, podendo resultar na perda da junção intercelular dos enterócitos, favorecendo a translocação bacteriana^16,17,18.

Desta forma, os AINE, poderiam levar a um retardo na cicatrização intestinal através de dois mecanismos, o primeiro, inibindo a formação de prostaglandinas, e, conseqüentemente, retardando a regeneração, celular e a revascularização da cicatriz. O segundo, por um processo direto de injuria celular, ao nível mitocondrial dos enterócitos, que favorece o aumento do processo inflamatório através da proliferação e da translocação bacteriana¹⁹.

Apesar desses conhecimentos os efeitos dos AINE sobre a cicatrização intestinal, ainda são muito discutíveis. Por essa razão este trabalho teve como objetivo, investigar a evolução clínica e as possíveis alterações biomecânicas e histopatológicas induzidas pelo diclofenaco de sódio sobre a cicatrização do íleo terminal de ratos.

MÉTODO

Foram utilizados 519 ratos da linhagem Wistar, pesando em média 180 gramas, e divididos em 4 grupos experimentais. O grupo 1, controle sem anastomose (C), constituído de 52 ratos, submetidos à laparotomia e manipulação das alças intestinais e tratados com solução fisiológica (SF), por via intramuscular, em dose única diária, durante 4 dias. O grupo 2, controle com anastomose (CA), com 110 animais submetidos à anastomose no íleo terminal e tratados com solução fisiológica nas mesmas condições do grupo anterior. O grupo 3 (DS) com 52 ratos submetidos à laparotomia e manipulação das alças intestinais, tratados com Diclofenaco de Sódio, na dose de 3 mg/kg de peso corporal por dia, administrado por via intramuscular, em dose única diária por 4 dias. O grupo 4 (DSA) com 295 animais submetidos à anastomose no íleo terminal e tratados com DS de maneira idêntica ao grupo anterior. Dez animais, sem manipulação, foram utilizados para medidas da força de ruptura e dosagens bioquímicas, como parâmetros do momento caracterizado como M0.

Em cada grupo foram analisados cinco momentos de avaliação: M0=momento inicial, dados obtidos em animais sem anastomose e sacrificados imediatamente após a coleta do material; M1= 4^o dia após a intervenção cirúrgica: M2=7^o dia; M3=14^o dia e M4=21^o dia após a intervenção cirúrgica. Em cada momento foi realizado estudo macroscópico dos órgãos da cavidade peritoneal, estudo da força de ruptura, colágeno tecidual e exame histopatológico.

Os animais foram anestesiados com éter sulfúrico e submetidos à laparotomia mediana, onde o íleo terminal foi seccionado transversalmente, 5cm acima da válvula íleo /cecal e realizada anastomose em plano único com pontos separados, utilizando fio de polipropileno 6-0. O DS foi administrado logo após o término do fechamento da parede abdominal, por via intramuscular, na coxa posterior esquerda. Todos os animais foram observados clinicamente em relação à distensão abdominal, cicatrização da parede abdominal e presença de diarréia; os que evoluíram para óbito foram submetidos à necrópsia.

Nos momentos preconizados para o sacrifício, os animais foram anestesiados com éter e submetidos à laparotomia, sendo anotadas as características dos órgãos da cavidade peritoneal, incluindo alças intestinais e anastomoses. Para o estudo da força de ruptura foi utilizado um segmento do íleo terminal, contendo ou não a anastomose e medindo cerca de 3 cm de comprimento. Esses segmentos foram lavados em soro fisiológico e transferidos para um recipiente contendo solução fisiológica e cloridrato de papaverina (250 mg/l) e mantidos em banho maria a 37^oC por meia hora, sendo a seguir, realizado o estudo da força de ruptura em um tensiômetro de resistência elétrica²⁰.

Os segmentos intestinais de três animais, de cada momento, foram encaminhados para exame histopatológico. As amostras foram imersas em solução fisiológica a 37^oC, abertas pela borda contramesenterial, estendidas pela face serosa sobre papel de filtro e fixadas em formol a 10%. Foram realizados três cortes em cada segmento intestinal e obtidas duas lâminas coradas pela Hematoxilina-Eosina e pelo Tricômio de Masson. Os critérios adotados para o estudo microscópico do processo de cicatrização foram a regeneração da mucosa, intensidade e tipo do processo inflamatório, tecido de granulação e colágeno tecidual.

Após a realização da força de ruptura, as amostras foram reconstituídas e os segmentos resultantes, contendo ou não as anastomoses, foram pesados e, posteriormente, realizadas as dosagens de hidroxiprolina e proteína tecidual^21,22,23. Estabelecemos a relação hidroxiprolina/proteína para a verificação da proporção de colágeno existente no componente protéico do tecido.

Para a interpretação estatística dos resultados foi utilizada a Análise de Variância. Os resultados foram considerados significativos para p<0,05.

RESULTADOS

Nenhum animal do grupo 1 teve intercorrências clínicas ou foi à óbito durante o período de acompanhamento. Entre os animais do grupo tratado sem anastomose, (grupo 3) observamos uma incidência de 15% de diarréia, verificada entre o 2^o e o 4^o dia após a administração do DS, com consequente perda de peso.

Nos animais tratados com DS e submetidos à anastomose no íleo terminal (grupo 4) observamos uma taxa de mortalidade de 79,6% (235 em 295 animais) significativamente maior (p<0,05) que a taxa de mortalidade observada nos animais controles (grupo 2), que foi de 45,45% (50 em 110 animais). As principais causas de óbitos e o dia em que aconteceram estão listados nas Tabelas I e II. Entre os animais que não foram a óbito no grupo 4, observamos diarréia em 10,17% ratos, abcesso de parede em 22 e deiscência bloqueada da anastomose em 8 animais.

O exame macroscópico da cicatriz observada pela face mucosa, não revelou alterações dignas de nota entre animais controles ou tratados, submetidos à anastomose no íleo terminal.

Ao exame microscópico, as paredes das alças intestinais de animais não submetidos à anastomose, e que receberam DS, também não apresentaram diferenças significativas quando comparadas com os com os do grupos controles.

Já nos animais submetidos à anastomoses ocorreram importantes alterações microscópicas entre animais dos grupos controles e tratados, principalmente em relação à regeneração da mucosa, reação inflamatória, tecido de granulação e colagenogênese. Nos animais submetidos à anastomose e que não receberam o DS, a regeneração da mucosa se processou a partir do 7^o dia de pós-operatório, completando-se no 14^o dia. Nesse grupo a reação inflamatória caracterizou-se por abundante exsudato neutrofílico junto às bordas da anastomose, que diminuiu no 14^o dia do pós-operatório (PO), sendo substituído por um infiltrado mononuclear, constituido principalmente por macrófagos. No 4^o e no 7^o dia de PO, o tecido de granulação caracterizou-se por proliferação de pequenos vasos, os quais encontravam-se dispostos perpendicularmente às bordas da anastomose, presença de moderada quantidade de fibroblastos, macrófagos e pouca quantidade de fibras colágenas, em meio ao edema intersticial. No 14^o e 21^o dia de pós-operatório observou-se redução acentuada e progressiva do número de vasos, fibroblastos e macrófagos. Quanto ao colágeno, havia pequena quantidade de fibras cianofílicas, em meio ao abundante edema, no 4^o dia de PO. No 7^o e 14^o dia notou-se redução do edema intersticial e aumento progressivo da quantidade de fibras colágenas, as quais no 21^o dia estavam mais densas e estruturalmente organizadas.

Na cicatriz dos animais que receberam DS a regeneração completa da mucosa só se processou no 21^o dia de PO; sendo que um acentuado processo exsudativo com intenso edema e infiltrado neutrofílico foi observado no 4^o dia de PO desses animais, que persistiram até o 14^o dia. Em todos os momentos avaliados observou-se fenômenos hemorrágicos nas anastomoses, os quais estavam predominantemente, localizadas na submucosa e serosa, das alças intestinais. Discreta proliferação de vasos e moderada e/ou discreta infiltração de fibroblastos e macrófagos, também foram observados nesses animais. O colágeno depositado na cicatriz dos animais desse grupo, mostrou-se estruturalmente desorganizado nos momentos finais da avaliação (M4 e M5).

A força de ruptura observada nos animais sem anastomose, foi menor nos animais tratados com DS nos momentos 1 e 2 e, não diferiu, estatisticamente nos momentos 3 e 4. Nos animais com anastomose a força de ruptura não diferiu estatisticamente entre animais controles e tratados em todos os momentos estudados (Fig. 1).

A concentração de proteína tecidual observada no íleo terminal de animais sem anastomose foi menor no grupo controle nos momentos 1, 2 e 3 não havendo diferenças significativas no momento 4. Nos animais com anastomose a concentração de proteína tecidual foi similar nos animais controles e tratados no momento 1, 2 e 4, sendo menor no grupo controle no momento 3 (Fig. 2).

A concentração de hidroxiprolina observada no íleo terminal de animais sem anastomose foi maior nos animais do grupo 1 nos momentos 1 e 3 e não diferente nos momentos 2 e 4. Nos animais com anastomose a concentração de hidroxiprolina foi maior nos animais controles nos momentos 2 e 4 e similar nos momentos 1 e 3 (Fig.3).

A relação hidroxiprolina/proteína tecidual no íleo terminal nos animais sem anastomose foi maior nos animais controles nos momentos 1,2 e 3 e estatisticamente similar no momento 4. Nos animais com anastomose a relação hidroxiprolina/proteína tecidual não diferiu nos animais controles e tratados no momento 1, sendo maior nos animais controles nos demais momentos (Fig.4).

DISCUSSÃO

Os AINE estão entre as drogas mais utilizadas no mundo, tendo por isso particular importância os seus efeitos sobre a cicatrização intestinal. Atualmente, 80% dos pacientes portadores de doenças reumáticas utilizam regularmente esses medicamentos, sendo que rotineiramente 10% da população do hemisfério ocidental os utilizam rotineiramente.²⁴

No período pós-operatório os AINE são utilizados como analgésicos e anti- inflamatórios, tendo sido administrados de forma preventiva (antes da incisão cirúrgica) ou terapêutica (após o término do efeito anestésico) com o objetivo de bloquear a liberação de substâncias que modificam o limiar de excitabilidade dos nociceptores periféricos. Como agentes isolados, são úteis nas dores de intensidade leve e moderada e, associados aos opióides, nas dores intensas²⁵ ou no pós-operatório por períodos curtos, 1 a 4 dias, sendo no início administrados preferentemente por via parenteral, oral ou retal²⁶.

Os primeiros relatos sobre os efeitos dos AINE sobre a cicatrização intestinal foram feitos por Ballantyne, 1984, tidos como promotores da cicatrização intestinal²⁷. Outros estudos, no entanto revelam que os AINES são prejudiciais à evolução da cicatrização intestinal ^7,8,9,28,29 .

Neste experimento, animais submetidos à anastomose no íleo terminal tiveram alta taxa de mortalidade por deiscência da anastomose, tanto no grupo controle como no tratado. É provável que o elevado índice de complicações das anastomoses ileais observadas no grupo controle seja devido ao calibre reduzido da alça intestinal, com maior dificuldade para realizar a sutura extramucosa; sendo, também possível que o fio utilizado na anastomose (6-0) seja de diâmetro inadequado para a confecção de anastomose no íleo terminal³⁰.

A maior taxa de deiscência e conseqüentemente a mortalidade nos animais tratados deve- se provavelmente ao bloqueio de biossíntese de prostaglandinas que leva a uma diminuição na taxa de proliferação celular e neovascularização tecidual, ainda que os AINES aumentaram a concentração proteica e de hemoglobina no intestino, por favorecer a ulceração da mucosa intestinal e, consequentemente, o aumento de flora bacteriana. A administração de Indometacina em ratos leva ao aumento de proliferação de bactérias no íleo terminal, onde triplica a quantidade de Escherichia coli, Bacterióides fragilis, Clotisdiun e Proteus Mirabilis ³¹.

A modificação qualitativa e quantitativa da flora do íleo distal, associada às alterações da membrana do enterócito e à agressão da ressecção intestinal, deve favorecer maior translocação bacteriana através da anastomose. Isto provavelmente pode explicar o maior índice de deiscência observada nas anastomose ileais, podendo sugerir que a ultilização de antibióticos profiláticos na clínica, possa ser justificado em pacientes em uso crônico de AINE e que necessitam de intervenção cirurgica nesse segmento intestinal.

O estudo histológico das anastomoses revelou retardo na regeneração da mucosa e má evolução da reparação da cicatriz nos animais que receberam DS, provavelmente decorrente da maior intensidade dos fenômenos exsudativos (infiltrado polimorfonuclear). Esse fato, associado ao depósito mais intenso de crosta fibrino- leucocitária e menor infiltração de macrófagos dificultou o processo reparativo da cicatriz. Por termos utilizado o DS, o resultado teoricamente esperado seria a diminuição do processo inflamatório. Entretanto, em nosso experimento, paradoxalmente observamos aumento do processo inflamatório. Esse ocorreu provavelmente pela inibição da síntese das prostaglandinas, com secundário retardo na regeneração celular e na revascularização da cicatriz. Esses processos associados à injúria celular ao nível mitocondrial dos enterócitos, favoreceu o aumento do processo inflamatório através da proliferação e translocação bacteriana.

Com relação a força de ruptura, nos animais não operados e que receberam DS, constatamos diminuição da resistência mecânica nos dois primeiros momentos. Esse achado pode estar correlacionado à atuação do DS, que ao quebrar a barreira mucosa pode propiciar a translocação bacteriana e acarretar alterações ultra-estruturais e lise do colágeno, com conseqüente diminuição da resistência mecânica.

Já a evolução da curva de ganho e perda da resistência mecânica nas cicatrizes do íleo terminal foram semelhantes entre os grupos com ou sem DS; mostrando que esse método pode não ser adequado para estudar os complexos fenômenos envolvidos na reparação tecidual, quando há anastomose.

Quando estudamos o colágeno tecidual pela relação hidroxiprolina-proteína tecidual, comprovamos que o DS é responsável pela queda do colágeno tecidual no íleo terminal de animais com ou sem anastomose na maioria dos momentos estudados. O retorno à normalidade do colágeno tecidual tende a ocorrer apenas em torno do 21^o dia de pós-operatório, isto é, 14 dias após a interrupção do DS. Outros autores mostram uma importante interferência de AINE sobre o metabolismo do colágeno com consequente prejuizo da cicatrização intestinal ^7,8,9,29 .

Apesar dos elevados índices de complicações anastomóticas observadas em animais não tratados, importantes conclusões foram tiradas na análise dos parâmentros avaliados nesse estudo, onde demonstramos, de maneira marcante, os efeitos deletérios do Diclofenaco de sódico sobre a cicatrização ileal.

Assim, nossos resultados sugerem que o DS tem um efeito imediato, aumentando a lise do colágeno e, posteriormente, retardando a síntese do colágeno. Se os resultados desse experimento pudessem ser extrapolados para a clínica, a realização de anastomoses intestinais, em pacientes que utilizam AINE, somente seria aconselhável após a normalização do colágeno tecidual, que ocorre após o 14^o dia de interrupção do DS.

O resultado de nossos experimento e de outros autores demonstram que os AINE são lesivos à evolução normal da cicatrização, por diminuir a concentração de hidroxiprolina, propiciando a deiscência da anastomose intestinal. O mecanismo exato pelo qual ocorre essa interferência não está ainda esclarecido na literatura. Entretanto, nossos achados sugerem que o mecanismo pelo qual ocorre esta interferência está ligado a uma lise aumentada do colágeno na fase inicial do processo de cicatrização, o que, posteriormente, interfere na síntese colagênica.

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SUMMARY

The effect of the diclofenac sodium (DS) on the healing of anastomosis carried- out in the ileum of rats was studied. Five- hundred and nineteen Wistar rats were randomly assigned to the 4 experimental groups: Group I included 52 rats treated with 3 mg/kg/day of saline, administered intramusculary during 4 days, group II included 110 rats submitted to ileal anastomosis and treated with saline as described previously, group III included 52 rats treated with DS in a dose of 3 mg/kg/day, administered IM during 4 days, and group IV included 295 rats submitted to ileal anastomosis and treated with DS as prior described. In all rats from the 4 experimental groups clinical parameters and measurements of tensile strength, tissue collagen and histological analyses were documented at 4, 7, 14, and 21 postoperative days. There are no clinical alterations in group I rats all over the study. Diarrhoea was observed in 8 rats (15,4%) from group III. In this group both tensile strenght and tissue collagen were descrease when compared with group I rats. Mortality in DS treated rats submitted to ileal anastomosis was higher than those of control groups. In group IV we also observed reard in the healing, with intense PMN inflamatory response, decrease of macrophages and of tissue collagen, and mucosae regeneration. We concluded that DS is deleterious on the healing of anastomosis performed in the ileum of rats.

Endereço para correspondência:

Dr. José Guilherme Minossi

Dept^o de Cirurgia e Ortopedia

Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP

18.618-970 - Botucatu - São Paulo

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1

. Trabalho realizado no Laboratório de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e Ortopedia, Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP.

2

. Professores Ass. Doutores do Departamento de Cirurgia e Ortopedia, Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP.

3

. Prof

^a. Livre Docente do Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP.

4

. Prof. Titular do Departamento Bioestatística, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP.

5

. Prof. Adjunto do Departamento de Cirurgia e Ortopedia, Faculdade de Medicina de Botucatu.

Publication Dates

• Publication in this collection
  18 Nov 1998
• Date of issue
  Jan 1998