Influência do antibiótico nas lesões de isquemia e reperfusão intestinal: estudo experimental em ratos

The influence of antibiotics on intestinal ischemia and reperfusion: experimental study in rats

INFLUÊNCIA DO ANTIBIÓTICO NAS LESÕES DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO INTESTINAL

ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS¹

Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões², Fernando Hintz Greca³, Sergio Ioshi⁴, Imad Izat El Tawil⁵, Carla Martinez Menini⁵, Júlio Cesar Rampazzo⁵

Biondo-Simões MLP, Greca FH, Ioshi S, El Tawil II, Menini CM, Rampazzo JCR. Influência do antibiótico nas lesões de isquemia e reperfusão intestinal: estudo experimental em ratos. Acta Cir Bras 2000; 15 (supl. 3): 83-87.

RESUMO: Muito se tem questionado sobre os efeitos da isquemia intestinal seguida de reperfusão (I/R), chamando a atenção para o papel dos leucócitos na patobiologia da I/R. A fisiopatogenia das lesões está intimamente ligada à geração de radicais de oxigênio durante o período em que se processa a reperfusão. A ruptura da barreira intestinal permitindo a translocação bacteriana agravaria ainda mais estas lesões. Este estudo tem por objetivo avaliar as lesões intestinais na vigência de isquemia e na reperfusão com e sem antibioticoterapia. Submeteram-se 42 ratos Wistar à anestesia e laparotomia mediana. Obteve-se isquemia intestinal por clampeamento das artérias mesentéricas cranial e caudal por 30 minutos. Após reperfundiu-se por igual tempo. Metade destes animais receberam 50 mg/kg de eritromicina por via oral nas 24 horas que antecederam o procedimento. Cada um destes grupos foi subdividido em outros 3, constituíndo os subgrupos de controle, isquemia e isquemia/reperfusão. Ao final, ressecaram-se segmentos do intestins delgado para processamento histológico. Avaliaram-se os resultados pela escala de CHIU e col. e submeteram-se os resultados à tratamento estatístico. Observou-se que a mucosa intestinal apresentava-se com padrão normal nos grupos de controle, tanto com antibioticoprofilaxia como sem. Os intestinos submetidos à isquemia com ou se antibioticoprofilaxia mostraram, lesões com descolamento e perda de vilosidades até infartamento transmucoso. Os intestinos reperfundidos apresentavam lesões semelhantes. Verificou-se que os intestinos reperfundidos que receberam antibioticoprofilaxia apresentavam lesões mais graves do que os que sofreram isquemia sem antibioticoprofilaxia (p=0,0303). Concluiu-se que o uso de antibióticos pré-isquemia não diminui a gravidade das lesões histopatológicas da mucosa intestinal, não protegendo das lesões após a reperfusão.

DESCRITORES: Isquemia. Reperfusão. Intestinos.

Biondo-Simões MLP, Greca FH, Ioshi S, El Tawil II, Menini CM, Rampazzo JC. The influence of antibiotics on intestinal ischemia and reperfusion: experimental study in rats. Acta Cir Bras 2000; 15 (supl.3): 83-87.

SUMMARY: The role of the white blood cells in the ischemia and reperfusion have been studied. Free radicals appear to be envolved in the phisiopathology of the ischemia and reperfusions lesions. The intestinal barrier disruption would allow bacterial translocation and increase in the severity of such lesions. The aim of the present study was to evaluate intestinal injury after ischemia and reperfusion with and without antibiotic coverage. Under ether anesthesia forty-two Wistar male rats were submitted to an abdominal midline incision. The mesenteric arteries were clamped for 30 minutes. After this period of ischemia, reperfusion was induced for equal period of time. Twenty-one rats received eritromicin, 50mg/kg orally, 24 hours before the operation. The remain animals were operated without antibiotics coverage. Each of the two groups animals were divided into 3 others groups: control, ischemia and ischemia-reperfusion groups. After the reperfusion period, a intestinal segment was excised for histopathological studies. Results were evaluated according to the criteria of CHIU and col. and were submitted to statical analysis. In the control group any difference was found in the intestines of the animals with and without antibiotic coverage. The ischemia group, with or without antibiotic, showed lesions that ranged from vilos loss to mucosal infarction. The lesions were similar in the ischemia-reperfusion group. We verified that intestines submitted to reperfusion under antibiotic coverage showed more severe lesions than ischemic intestines without antibiotics coverage (p= 0,0303). We can conclude that the administrations of antibiotics before the induction of ischemia or ischemia-reperfusion does not improve the severity of histological lesions.

SUBJECT HEADINGS: Ischemia. Reperfusion. Intestines.

INTRODUÇÃO

A lesão intestinal resultante da isquemia e subseqüente reperfusão, desempenha papel central em uma variedade de condições clínicas, tais como: transplantes de orgãos, cirurgias cardíacas e vasculares especialmente sobre a aorta em adultos e enterocolite necrotizante em neonatos. Embora o mecanismo de dano ainda permaneça duvidoso, tem sido relatado o aumento da permeabilidade vascular e leucoseqüestração além das próprias lesões mucosas como responsáveis por toda a gama de falências orgânicas que se instala.

Períodos prolongados de isquemia causam morte celular e conseqüente deterioração funcional do órgão. Adicionalmente, após a restauração do fluxo sangüíneo, o tecido morto iniciará o desenvolvimento de uma resposta inflamatória. Zimmerman e col. (1992) relacionaram o papel da xantino-oxidase (XO), encontrada no endotélio bem como no epitélio intestinal, como mediadora da lesao de reperfusão. Em condições normais, esta substância existe predominantemente como xantino-desidrogenase (XD). Contudo, com a isquemia, a xantino-desidrogenase é convertida em xantino-oxigenase. Ao mesmo tempo, ocorre diminuição de ATP com aumento dos níveis de metabólitos de purina: hipoxantina e xantina. Com a reperfusão, o oxigênio torna-se disponível e ocorre a oxidação destes metabólitos através da xantino-oxidase gerando degradação de metabólitos reativos de oxigênio os quais causam lesão tissular¹⁶.

Koike e col. (1992) descreveram que a isquemia seguida de reperfusão ativa a fosfolipase A₂ independentemente da xantino-oxidase e que a mesma libera o fator ativador de plaquetas (PAF) e outros derivados eicosanóides que agem como quimiotáxicos⁸.

Adicionalmente, a aderência de polimorfonucleares no endotélio libera grânulos contendo NADPH-oxidase dependente dos metabólitos reativos do oxigênio ou uma variedade de proteases e elastases que interagem sinergicamente para produzir lesão endotelial como relataram WEISS e col. (1989)¹⁴.

Este padrão de lesão pode ser local ou atingir órgãos distantes a partir da isquemia intestinal a qual é reportada como base na vasocontrição esplâncnica desproporcional que ocorre no choque hipovolêmico. Pogetti e col. (1992) desenvolveram, em ratos, um modelo de isquemia e reperfusão intestinal no qual a artéria mesentérica superior foi ocluída por um período de 30 minutos e logo em seguida reperfundida pelo mesmo período. Neste modelo, observou-se aumento de polimorfonucleares circulantes, aumento da permeabilidade vascular e aumento da atividade da fosfolipase intestinal¹².

Lesões da mucosa intestinal foram descritas por vários autores, tanto imediatamente após a isquemia como após a reperfusão. Estas lesões facilitariam a translocação bacteriana e o desenvolvimento de sepsis, agravadas pelas lesões mediadas pela xantino-oxidase.

Sorkine e col. (1997) estudaram as lesões pulmonares após isquemia e reperfusão intestinal com descontaminação intestinal prévia e relataram que este procedimento pode reduzir a formação de lipopolissacarídios e do fator de necrose tumoral (TNF) e com isto haveria redução dos danos pulmonares¹³.

O objetivo deste presente estudo é verificar o padrão histopatológico das lesões intestinais na isquemia seguida de reperfusão e observar a influência da antibioticoprofilaxia nessas lesões.

MÉTODOS

Utilizaram-se 42 ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), machos, com idade entre 100 e 120 dias e peso entre 200 e 250g. Os animais permaneceram no Biotério Central da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, mantidos em caixas padronizadas, com número máximo de quatro animais por caixa, sob temperatura e luminosidade naturais, recebendo água potável e ração padrão comercial em regime livre. Nas 24 horas precedentes ao procedimento cirúrgico os animais tiveram acesso somente à água.

Dividiu-se a amostra em seis grupos de sete ratos, com a seguinte denominação: grupo A: grupo controle sem antibiótico

grupo B: grupo controle com antibiótico

grupo C: grupo isquemia sem antibiótico

grupo D: grupo isquemia com antibiótico

grupo E: grupo isquemia seguida de reperfusão sem antibiótico

grupo F: grupo isquemia seguida de reperfusão com antibiótico

Nos grupos B, D e F administrou-se, por sonda orogástrica, 50mg/kg de eritromicina, nas vinte e quatro horas precedentes ao procedimento cirúrgico.

Utilizou-se para anestesia éter etílico 97%, por via inalatória em campânula fechada para a indução e a mesma substância, em sistema aberto, para manutenção anestésica.

Imediatamente antes do início do procedimento cirúrgico, realizou-se a tricotomia da região ventro-lateral do abdômen e região ventral do terço inferior do tórax.

Fixaram-se, os ratos, à mesa cirúrgica em decúbito dorsal, com os quatro membros em abdução. Realizou-se a limpeza mecânica e anti-sepsia da região operatória com polivinilpirrolidona _ iodo ativo 1% e colocação de campo cirúrgico estéril.

Em seguida obteve-se anticoagulação, administrando-se 0,02 ml de heparina sódica pela veia dorsal do pênis.

Seguiu-se laparotomia mediana supra e infra-umbilical . Inicialmente realizou-se a identificação e mobilização cuidadosa das artérias mesentéricas cranial e caudal. Nos grupos submetidos a isquemia, interrompeu-se o fluxo sangüíneo através destas artérias com falsa ligadura de fio multifilamentar de algodão 2-0. Manteve-se o quadro de isquemia por um período de trinta minutos. Nos grupos submetidos a isquemia e posterior reperfusão, após o período de isquemia desfez-se a falsa ligadura permitindo a reperfusão por período de 30 minutos. Durante este período manteve-se a parede abdominal aproximada, deixando-se na cavidade gase embebida em solução salina isotônica morna.

Terminado o procedimento proposto para cada grupo, procedeu-se à ressecção de segmentos do intestino delgado para análise histológica e em seguida, a eutanásia.

As peças cirúrgicas de intestino delgado, após preparação histológica, forneceram cortes de 4 micrômetros que foram corados pela hematoxilina-eosina e analisados. Utilizou-se a graduação de CHIU e col. (1970)³ modificada por HAGLIND e col. (1980)⁶ que classifica as lesões intestinais de acordo com os seguintes parâmetros:

grau 0: mucosa normal

grau I: aparecimento de espaço subepitelial na extremidade da vilosidade;

grau II: espaço subepitelial extendido para além da extremidade;

grau III: levantamento epitelial ao redor da vilosidade;

grau IV: descolamento total da vilosidade;

grau V: perda do tecido viloso;

grau VI: infarto das criptas;

grau VII: infarto transmucoso e

grau VIII: infarto transmural.

Consideraram-se as lesões que variavam estavam entre o grau I e o grau IV como lesões reversíveis e a partir daí como lesões irreversíveis.

Submeteram-se os resultados à tratamento estastítico pelo teste exato de Fisher considerando-se p ­ 0,05 como nível para rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS

Nos grupos nos quais realizou-se somente o processo de isquemia, encontrou-se como padrão macroscópico palidez, friabilidade e enrugamento da parede intestinal (Figura1).

Nos grupos submetidos ao processo de isquemia seguida de reperfusão, visibilizou-se um padrão macroscópico de hiperemia e edema de alças (Figura 2).

O grupo A (controle sem antibioticoprofilaxia) não apresentou nenhum grau de lesão intestinal observado à microscopia óptica, permanecendo a mucosa intestinal inalterada (Figura 3). Já o grupo B (controle com antibioticoprofilaxia) mostrou apenas padrão de aumento de fluxo sangüíneo nos espaços subepiteliais, mas preservando a mucosa intestinal (Figura 4).

Nos grupos isquemia C (sem antibioticoprofilaxia) e D (com antibioticoprofilaxia) houve pouca alteração quanto ao grau de lesão intestinal. No grupo C 71,5% cortes histológicos apresentaram lesão grau II e 28,5% lesão grau I. Os intestinos dos animais do grupo D obtiveram 100% de lesão grau II. Os grupos sem antibioticoprofilaxia e com antibioticoprofilaxia não foram, contudo diferentes (p=0,30).

Os grupos que sofreram o processo de isquemia seguido de reperfusão, sem antibioticoprofilaxia (Grupo E) e com antibioticoprofilaxia (Grupo F) mostraram diferença significante. O grupo E apresentou 28,5% dos cortes histológicos intestinais com lesão grau III e 71,5% com lesão grau IV. No grupo F (Figura 5), 100% dos cortes histológicos apresentaram lesão intestinal grau V, isto é, com perda do tecido viloso.

Quando compara-se os padrões de lesão intestinal no grupo isquemia com antibioticoprofilaxia (Grupo D) e no grupo isquemia seguida de reperfusão com antibioticoprofilaxia (Grupo F), percebe-se que as lesões no grupo de isquemia seguida de reperfusão com antibioticoprofilaxia os padrões lesionais são mais graves (p=0,0300).

DISCUSSÃO

Quando um tecido é submetido à isquemia ocorre uma seqüência de reações que culminam com a disfunção e a necrose celular. Embora um simples processo não possa ser identificado como evento crítico na isquemia induzida, muitos estudos indicam que a depleção das energias celulares armazenadas e o acúmulo de metabóticos tóxicos contribuem para a morte celular. É evidente que o restabelecimento do fluxo sangüíneo é necessário para salvar os tecidos isquêmicos e permitir a regeneração das células e a retirada dos metabólicos tóxicos. Entretanto, a reperfusão de tecidos isquêmicos pode levar a uma seqüência de eventos paradoxais.

Parks e Granger (1986) demonstraram que lesões relativamente pequenas ocorrem na isquemia e que a maioria se desenvolvem durante a reperfusão. Estes autores promoviam isquemia mantendo o fluxo em 20% do normal durante 3 horas e reperfundiam por 1 hora. Descreveram que as lesões encontradas ao final eram mais graves do que aquelas vistas após 4 horas de isquemia. Justificaram que as lesões iniciadas pela reperfusão envolvem a formação de oxidantes citotóxicos derivados do oxigênio molecular¹¹.

A concentração de oxigênio resulta do arranjo anatômico dos vasos sangüíneos nas vilosidades intestinais, isto é, o vaso central supre os vasos que se estendem como capilares subepiteliais⁹. Disto resulta diminuição da tensão de oxigênio do ápice da vilosidade comparada com a base². Assim, durante o período de isquemia observam-se hipóxias severas que levam, primeiramente, à morte as células dos ápices das vilosidades dando origem às lesões típicas da isquemia¹.

Na década de 80 autores demonstraram que a origem dos radicais livres de oxigênio, na isquemia intestinal, levavam a responsividade e aumento da permeabilidade vascular e estava associada às lesões intestinais^4,5,10.

Granger e col. (1981) propuseram que a origem dos radicais livres de oxigênio na isquemia intestinal, era a enzima xantino-oxidase⁴. A atividade desta enzima é encontrada quase que exclusivamente na camada mucosa, com atividade aumentada na base das vilosidades. O papel da xantino-oxidase na lesão por reperfusão é suportada pela observação de que a infusão local intra-arterial de hipoxantina e xantino-oxidase resulta em aumento da permeabilidade vascular intestinal comparável à observada na reperfusão após isquemia⁵.

Wilmore (1988) estabeleceu que a translocação bacteriana está relacionada com a perda da barreira intestinal por diminuição da produção de fatores protetores e por aumento de radicais livres de oxigênio¹⁵.

Horrie (1996) descreveu que a adesão leucocitária na parede dos vasos, tem relação com a fase de seqüestração leucocitária pelos hepatócitos, no período chamado de leucoseqüestração hepática, logo em seguida ao processo de reperfusão⁷.

Em 1997, Sorkine estudando situações de isquemia seguidas de reperfusão com antibioticoprofilaxia, observou que esta tinha papel agressor ao invés de protetor, devido a diminuição de lipopolissacarídeos e fator de necrose tumoral, induzindo assim a um aumento da adesão de polimorfonucleares a parede do vaso, diminuindo o fluxo sangüineo local e induzindo a uma maior lesão tecidual¹³.

No presente estudo verificou-se que um período curto de isquemia (30 minutos) seguido de período de reperfusão de mesma duração, em intestino delgado de ratos, leva a significante deterioração da microcirculação, através da deposição de polimorfonucleares na parede de vasos e diminuição do fluxo sangüíneo local. As lesões são maiores nos grupos reperfundidos e atingem valores superiores ao grau V de CHIU e col. nos intestinos reperfundidos que receberan antibioticoprofilaxia. Desta forma este procedimento não diminuiu a gravidade das lesões.

CONCLUSÃO

O uso de antibióticos pré-isquemia não diminui a gravidade das lesões histopatológicas da mucosa intestinal, não protegendo das lesões após a reperfusão.

• 1. Ahren C, Haglund U. Mucosal lesions in the small intestine of the cat during low flow. Acta Physiol Scand 1973; 88:541-50.
• 2. Bohlen G. Intestinal tissue PO₂ and microvascular responses during glucose exposure. Am J Physiol 1980; 238:H164-171.
• 3. Chiu CT, Scott HJ, Gurd FN. Intestinal mucosal lesion in low-flow states: II. The protective effect of intraluminal glucose as energy substrate. Arch Surg 1970; 101:484-8.
• 4. Granger DN, Rutili G, McCord JM. Superoxide radicals in feline intestinal ischemia. Gastroenterology 1981; 81:22-29.
• 5. Granger DN, Hollwarth ME, Parks DA. Ischemia-reperfusion injury; role of oxygen-derived free radicals. Acta Physiol Scand 1986; (supl): 47-53.
• 6. Haglind E, Haglund U, Lundgren O. Graded intestinal vascular obstruction. I description of an experimental shock model in the rat. Circ Shock 1980; 7:83-91
• 7. Horrie Y, Wolf A, Miyasaka M. Leukocyte adhesion and hepatic microvascular responses to intestinal ischemia/reperfusion in rats. Gastroenterology 1996; 111:666-673.
• 8. Koike K, Moore EE, Moore FA, Franciose RJ, Fontes B, Kim FJ. CD1 lb blockade prevents lung injury despite neutrophil priming after gut ischemia/reperfusion . J Trauma 1995; 39:23-7.
• 9. Lundgren O, Haglund U. The pathophysiology of the intestinal counter-current exchanger. Life Sci 1978; 23:1411-22.
• 10. Parks DA, Bulkley DN, Granger DN, Hamilton SR, McCord JM. Ischemic injury to the cat small intestine: role of superoxide radicals. Gastroenterology 1982; 82:9-15.
• 11. Parks DA, Granger N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol 1986; 250:G749-753.
• 12. Poggetti RS, Moore FA, Moore EE, Banerjee A. Simultaneous ischemia/reperfusion induced intestinal dysfunction occurs despite sustained oxygen consumption. J Surg Res 1992; 52:467-71.
• 13. Sorkine P, Szold O, Halperm P, Gutman M, Greemland M, Rudick V, Goldman G.. Gut decontamination reduces bowel ischemia - induced lung injury in rats. Chest 1997; 112:491-5.
• 14. Weiss RL, Sisley AC, Harig JM. Neutrophil depletion atennuates human intestinal reperfusion injury. J Surg Res 1989; 57:192-7.
• 15. Wilmore DW, Smith RJ, O'Dwyer ST, Jacobs DO, Ziegler TR, Wang XD. The gut: a central organ after surgical stress. Surgery 1988; 104:917-23.
• 16. Zimmerman BJ, Granger DN. Reperfusion injury. Surg Clin North Am 1992; 72:65-83.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Abr 2001
• Data do Fascículo
  2000