FUNÇÃO FISIOLÓGICA DE LIPOXIGENASES DE FOLHAS DE SOJA SUBMETIDAS AO ATAQUE DE LAGARTA (ANTICARSIA GEMMATALIS HÜBNER.)

PHYSIOLOGICAL FUNCTION OF SOYBEAN LEAVES LIPOXYGENASES SUBMITTED TO ATTACK BY VELVET CATERPILLAR (ANTICARSIA GEMMATALIS HÜBNER.)

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi investigar se a “Via das Lipoxigenases” está envolvida no mecanismo de resposta da planta de soja ao ataque por lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis Hübner - inseto mastigador). Para isto, foi realizada a caracterização bioquímica e cinética do pool de lipoxigenases, cultivar IAC-100 (presença de lipoxigenases na semente) e genótipo IAC-100 TN (ausência de lipoxigenases na semente), bem como a determinação dos produtos finais da via. Os valores de K_Mapp decresceram até 48 horas, após a remoção do inseto, e os níveis de inibidores de proteases, aldeídos totais e hexanal, produtos finais da via, aumentaram. Esses dados sugerem alterações do pool das lipoxigenases e ativação dessas isoenzimas, em resposta ao ataque de lagartada-soja. Adicionalmente, foi verificado que a remoção genética de lipoxigenases das sementes não influenciou na expressão dessas isoenzimas em folhas.

PALAVRAS-CHAVE:
Soja; “Via das Lipoxigenases”; inibidores de proteases; mecanismo de defesa.

ABSTRACT

The objective of this work was to investigate the role of the “Lipoxygenases Pathway” in the mechanisms of response of the soybean plant subjected to attack of velvet caterpillar (Anticarsia gemmatalis Hübner - chewing insect). For this, the biochemical and kinetic characterization of the lipoxygenases pool was undertaken, cultivar IAC-100 (normal soybean cultivar) and the genotype IAC-100 TN (absence of seed lipoxygenase), as well as the determination of the final products of that pathway. The values of K_Mapp decreased up to 48 hours, after the removal of the insect, and the levels of proteases inhibitors, total aldehydes and hexanal, final products of the pathway, increased. Those data suggest alterations of the pool of the lipoxygenases and activation of those isozymes, in response to the attack of velvetbean caterpillar. In addition, it was verified that the genetic removal of lipoxygenases from the seeds has not changed the expression of these isozymes in the leaves which act on the defense mechanism of the soybean plant.

KEY WORDS:
Soybean; “Lipoxygenase Pathway”; inhibitors proteases; defense mechanisms.

INTRODUÇÃO

A soja constitui um dos produtos agrícolas de maior importância para o Brasil, ocupando lugar de destaque na pauta de exportação do país, sendo cultivada praticamente em todo o território nacional. Com a ampliação da área de soja plantada, problemas como perdas decorrentes do ataque de insetos-praga tendem a se agravar. Dentre aqueles que trazem conseqüências econômicas mais significativas na soja destacam-se a lagarta-da-soja (desfolhadora) e os percevejos (sugadores).

A lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae), é uma praga desfolhadora bastante problemática em culturas brasileiras. Mesmo em baixas densidades populacionais, este inseto causa grandes danos à lavoura de soja, que vai desde o desfolhamento até a destruição completa da planta. A lagarta-da-soja é um inseto mastigador e se alimenta de folhas jovens. Quando a folhagem é removida, ataca outras partes da planta. O desfolhamento compromete o enchimento das vagens, com conseqüente redução da produção de grãos. Quando se alimentam, além de remover nutrientes, as lagartas injetam toxinas na planta.

No sistema de interação planta-inseto, as plantas têm utilizado diversos mecanismos de defesa, os quais incluem a “Via das Lipoxigenases”, relacionada com o aumento da expressão diferencial de genes de defesa da planta ao ataque de insetos, principalmente àqueles que expressam para inibidores de proteases. HILDER et al. (1987) sugerem o envolvimento de inibidores de proteases na proteção de plantas contra predação de Lepidoptera.

Lipoxigenases (linoleato: oxigênio oxidorredutase, EC 1.13.11.12) são enzimas que catalisam a hidroperoxidação de ácidos graxos poliinsaturados contendo o sistema cis,cis-1,4-pentadieno, produzindo hidroperóxidos de ácidos graxos (HILDEBRAND et al., 1988). Os hidroperóxidos são seqüencialmente metabolizados e formam várias substâncias com atividades fisiológicas pronunciadas (KOCK et al., 1992), as quais incluem aldeídos (CROFT et al., 1993; PARÉ & TUMLINSON, 1997) e ácido jasmônico. Este último está envolvido na indução dos genes que expressam para inibidores de proteases (FARMER & RYAN, 1992; CREELMAN et al., 1992).

Aumento na expressão de lipoxigenases tem sido detectado, em plantas, durante ou após uma variedade de estresses, incluindo ataque por insetos (HILDEBRAND et al., 1989), infecção por patógenos (MELAN et al., 1993), ferimento mecânico (VIEIRA et al., 2001) e em processos fisiológicos, como crescimento e desenvolvimento, senescência, armazenamento temporário de nitrogênio e biossíntese de moléculas regulatórias (HILDEBRAND et al., 1989; CREELMAN & MULLET, 1997; FEUSSNER et al., 1995).

As lipoxigenases de sementes de soja afetam as propriedades e a qualidade de produtos alimentícios derivados, particularmente, pela participação na formação de compostos responsáveis pelo sabor indesejável, característico desses produtos. A eliminação genética de lipoxigenases de sementes de soja é, sem dúvida, uma das melhores alternativas para a eliminação do sabor característico da soja, desde que esta manipulação genética não altere a composição e, em conseqüência, as funções fisiológicas das lipoxige nases presentes nas folhas; tendo em vista sua participação nos mecanismos de defesa da planta a insetos e patógenos. Assim, foi utilizada uma cultivar (IAC-100), contendo as três lipoxigenases nas sementes e a isolinha IAC-100 TN, modificada geneticamente, apresentando ausência completa das lipoxigenases das sementes.

A caracterização bioquímica e cinética das isoenzimas lipoxigenases, após ataque por lagartada-soja, em especial daquelas presentes em folhas, pode auxiliar na elucidação das funções bioquímicogenética e fisiológica dessas isoenzimas no sistema de defesa de plantas a insetos e na regulação do metabolismo vegetal pela “Via das Lipoxigenases”.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas plantas de soja (Glycine max (L.) Merrill) da cultivar IAC-100, com lipoxigenases nas sementes e do genótipo sem lipoxigenases nas sementes (IAC-100 TN). O genótipo IAC-100 TN, desenvolvido pelo Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja do BIOAGRO/UFV, é uma linhagem avançada obtida a partir da cultivar IAC-100 que se encontra no primeiro ciclo de retrocruzamentos. A alta similaridade genética entre IAC-100 e IAC-100 TN foi confirmada por meio de análise de DNA, utilizando-se marcadores moleculares do tipo RAPD “Random Amplified Polymorphic DNA” e, também, através de características fenotípicas. As plantas foram cultivadas em vasos com capacidade para 4,0 kg de solo, sob condições de casa de vegetação.

A fonte de enzimas foi a primeira folha trifoliolar de plantas de soja no estádio vegetativo V3 de desenvolvimento (FEHR & CAVINESS, 1977). Os três folíolos da primeira folha trifoliolar foram coletados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ^oC.

As plantas foram colocadas em gaiolas de filó e submetidas a uma população de lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis Hübner). Após 6, 12 e 24 horas de ataque, os três folíolos da primeira folha trifoliolar foram coletados para posterior obtenção de extratos foliares. Após estes tempos, as lagartas foram retiradas das plantas e o mesmo procedimento de coleta foi efetuado nos tempos 6, 12, 24 e 48 horas após a retirada dos insetos.

O preparo do extrato bruto foliar nos testes e respectivos controles foi realizado de acordo com o método de OTHA et al. (1986). A determinação de proteínas totais, no extrato bruto, foi realizada de acordo com o método de SMITH et al.(1985).

A atividade de lipoxigenase sobre o ácido linoléico foi determinada segundo o método descrito por AXELROD et al. (1981). O método baseia-se no aumento da absorvância a 234 nm, resultante da formação de um sistema de duplas ligações conjugadas no hidroperóxido formado.

Para determinação do pH, ótimo os seguintes sistemas-tampão foram usados: ácido cítrico/ fosfato dissódico (pH 2,0-2,5); ácido cítrico/citrato de sódio (pH 3,0-3,5); ácido acético/acetato de sódio (pH 4,0-4,5); ácido cítrico/citrato de sódio (pH 5,0-5,5); monofosfato/fosfato dissódico (pH 6,0-7,0); Tris-HCl (pH 7,5-8,5) e ácido bórico/borato de sódio (pH 9,0-10,0), na concentração de 50 mmol.L^-1. A absorvância da mistura de reação a 234 nm foi determinada de 30 em 30 segundos por um período de 2,5 minutos, a 25 ^oC.

Para determinação da temperatura ótima, foi utilizado banho-maria bem como espectrofotômetro com sistema de temperatura controlada a 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 ^oC.

Os parâmetros cinéticos, no estado estacionário, foram obtidos por meio de regressão não-linear, empregando-se o programa de computação Enzifitter (LEATHERBARROW, 1987).

A determinação de inibidores de proteases foi realizada baseada na inibição da atividade da tripsina utilizando-se D,L-BApNA como substrato. Os resultados obtidos foram convertidos em mg de tripsina inibida por grama de proteína de acordo com o método de KAKADE et al. (1974).

A determinação de hexanal foi realizada por cromatografia gasosa, segundo o método de UTUMI et al. (1998). A determinação de aldeídos totais foi realizada pelo método colorimétrico desenvolvido por SANTOS et al. (1993), utilizando 3-metil-2benzotiazolinona hidrazona (MBTH) como reagente de cor.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os valores de pH ótimo, para o pool de lipoxigenases foliares, foram 4,5 e 6,0, para os dois genótipos analisados e seus respectivos controles (Fig. 1). No perfil de pH, a atividade específica de lipoxigenases apresentou-se maior nas plantas submetidas ao ataque por lagarta da soja, sugerindo ocorrer ativação das lipoxigenases foliares como conseqüência do estresse. Esses resultados estão de acordo com KATO et al. (1993); LANNA et al. (1996) e VIEIRA et al. (2001), cujos estudos foram realizados com soja. Em outras culturas também pode-se verificar que a faixa de pH ótimo é muito semelhante: REDGEL et al. (1995) em sementes de ervilha, pH ótimo 6,8; AVDIUSHKO et al. (1994) em pepino, pH ótimo 5,0; MINGUES-MOSQUEIRA et al. (1993) em pimentão, pH ótimo 6,5; KOCK et al. (1992) em folhas de tomate inoculadas com Pseudomonas, pH ótimo entre 6,4 e 7,2; LEONI et al. (1985) em sementes de girassol, pH ótimo 6,2; e GALLIARD & PHILLPS (1971) em tubérculos de batata, pH 5,5-6,0.

Fig. 1
Atividade específica de lipoxigenases de folhas de soja da cultivar IAC-100 (A) e do genótipo IAC-100 TN (B). Folíolos da primeira folha trifoliolar coletados 48 horas após remoção do inseto, a vários valores de pH. (pool de lipoxigenases foliares das plantas controle.) representa a atividade específica do pool de lipoxigenases foliares das plantas atacadas por lagarta-dasoja. () representa a atividade específica do

O pico de atividade de lipoxigenase mais acentuado foi observado a 25 ^oC para os dois genótipos e seus respectivos controles (Fig. 2). Além disso, os valores de atividade específica apresentaram-se maiores nas plantas atacadas pela lagarta quando comparados aos valores obtidos nas plantas controle. Esses resultados novamente sugerem que um dos mecanismos de resposta da planta de soja ao ataque da lagarta seja a ativação da “Via das Lipoxigenases”.

Fig. 2
Atividade específica de lipoxigenases de folhas de soja da cultivar IAC-100 (A) e do genótipo IAC-100 TN (B). Folíolos da primeira folha trifoliolar coletados 48 horas após a retirada do inseto, a vários valores de temperatura. () representa a atividade específica do pool de lipoxigenases foliares das plantas atacadas por lagarta-dasoja. () representa a atividade específica do pool de lipoxigenases foliares das plantas controle.

Os dados estão de acordo com os resultados obtidos por LANNA et al. (1996) para lipoxigenases foliares de soja no estádio V4 de desenvolvimento dos genótipos IAC-100, UFV-TN e Cristalina e também com os dados obtidos por VIEIRA et al. (2001) para lipoxigenases foliares de soja, no estádio V3 de desenvolvimento, de plantas da cultivar IAC-100 e da linhagem IAC-100 TN, submetidas a ferimento mecânico, onde apresentaram pico de atividade a 25 ^oC.

Ambos os genótipos apresentaram gráficos de Michaelis-Menten com curva hiperbólica, mostrando que o pool de lipoxigenases de folhas de soja, submetidas ao ataque da lagarta-da-soja, seguem a cinética de Michaelis-Menten, na faixa de concentração de substrato analisada (Figs. 3 e 4). Os valores de K_Mapp determinados a 6, 12 e 24 horas em presença do inseto, apresentaram-se menores do que os respectivos controles; além disso, os valores de K_Mapp decresceram, para ambos os genótipos, com o tempo de ataque do inseto à planta (Tabela 1). Esses resultados indicam uma mudança no pool de isoenzimas lipoxigenases quando as plantas são atacada pelas lagartas, aumentando a eficiência catalítica através da diminuição nos valores de K_Mapp, consequentemente, respondendo mais acentuadamente ao estresse.

Tabela 1
Parâmetros cinéticos do pool de lipoxigenases de plantas de soja, obtidos a partir dos folíolos da primeira folha trifoliolar, coletados 6, 12 e 24 horas (presença do inseto) e 6, 12, 24 e 48 horas (após remoção).

Tempo (horas)	IAC-100		IAC-100 TN
	KMapp (mmol.L-1) 122,47 (Controle)	Vmáx app (nmol.L-1.s-1) 227,70 (Controle)	KMapp (mmol.L-1) 116,74 (Controle)	Vmáx app (nmol.L-1.s-1) 112,22 (Controle)
Em presença do inseto 6	105,7150	217,4070	118,1620	280,6000
12	101,1060	134,6990	112,5050	167,6710
24	94,0622	228,6910	92,4810	176,5040
Após remoção do inseto 6	66,3952	121,6390	65,2444	106,1270
12	46,9640	115,8350	48,5869	116,3663
24	46,8881	81,1135	45,0425	77,1612
48	31,5046	95,6214	32,9958	68,1459

Fig. 3
Gráfico de Michaelis-Menten para a formação de hidroperóxido do ácido linoléico catalisada pelas lipoxigenases de folhas de plantas controles da cultivar IAC-100, folíolos da primeira folha trifoliolar no estádio V3 de desenvolvimento, coletadas 48 horas após a retirada do inseto (lagarta-da-soja). Condições experimentais: reação em tampão fosfato de sódio 50mmol.L^-1, pH 6,0, a 25 ^oC. Concentração do ácido linoléico 0,01 mmol.L^-1 a 0,64 mmol.L^-1. Quantidade de extrato bruto: 1mL. Concentração de proteína total no extrato bruto: 1,13 mg/mL. A linha contínua foi traçada baseada em dados teóricos utilizando-se a equação de Michaelis-Menten para a obtenção de K_Mapp e V_{máx app}. Os pontos são experimentais. Inserção: gráfico de Lineweaver-Burk.

Fig. 4
Gráfico de Michaelis-Menten para a formação de hidroperóxido do ácido linoléico catalisada pelas lipoxigenases de folhas de plantas controles do genótipo IAC-100 TN, folíolos da primeira folha trifoliolar no estádio V3 de desenvolvimento, coletadas 48 horas após a retirada do inseto (lagarta-da-soja) - controle (folíolos da primeira folha trifoliolar). Condições experimentais: reação em tampão fosfato de sódio 50 mmol.L^-1, pH 6,0, a 25 ^oC. Concentração do ácido linoléico 0,01 mmol.L^-1 a 0,64 mmol.L^-1. Quantidade de extrato bruto: 1mL. Concentração de proteína total no extrato bruto: 1,13 mg/mL. A linha contínua foi traçada baseada em dados teóricos utilizando-se a equação de Michaelis-Menten para a obtenção de K_Mapp e V_{máx app}. Os pontos são experimentais. Inserção:gráficodeLineweaver-Burk

Após a retirada do inseto da planta de soja, os valores de K_Mapp das lipoxigenases continuaram diminuindo, em ambos os genótipos. Os dados sugerem que a planta continuou respondendo ao ataque de lagarta-da-soja, através da “Via das Lipoxigenases”, até 48 horas após remoção do inseto.

A pequena diferença nos valores de K_Mapp entre os dois genótipos indica que a remoção genética das lipoxigenases de sementes, com o propósito de aumentar a aceitabilidade da soja na dieta alimentar, não alterou a expressão das lipoxigenases foliares.

Vários trabalhos têm demonstrado que plantas de soja respondem a diferentes estresses bióticos e abióticos, incluindo ataque de insetos, com aumento da atividade de lipoxigenases e da síntese de inibidores de proteases em suas folhas. Esses resultados também foram observados nesse experimento, em que ocorreu aumento da produção de inibidores de proteases, nos dois genótipos e em todos os tempos analisados, tanto durante a presença do inseto na planta quanto após a sua remoção (Tabela 2).

Tabela 2
Inibição de tripsina por inibidores de proteases, obtidos a partir do extrato bruto dos folíolos da primeira folha trifoliolar coletados 6, 12 e 24 horas (presença do inseto) e 6, 12, 24 e 48 horas (após remoção).

		Inibição tríptica (mg tripsina inibida.g-1 de proteína)
Tempo (horas)		IAC-100	IAC-100 TN
	Controle	lagarta	Controle	lagarta
Em presença do inseto 6	8,35 ± 0,85	24,71 ± 0,87	3,38 ± 0,25	43,01 ± 7,42
12	32,19 ± 12,37	48,94 ± 1,37	10,53 ± 3,84	40,18 ± 10,58
24	27,97 ± 2,99	30,47 ± 0,52	13,59 ± 4,94	17,57 ± 0,62
Após remoção do inseto 6	12,14 ± 3,08	95,26 ± 3,01	13,26 ± 2,80	16,15 ± 2,63
12	32,35 ± 4,79	87,67 ± 0,035	14,48 ± 0,95	16,90 ± 3,01
24	57,69 ± 15,13	91,06 ± 2,16	4,36 ± 1,15	20,44 ± 0,97
48	76,20 ± 6,91	156,81 ± 9,77	48,42 ± 1,32	97,23 ± 0,53

• ^1V
  alores são a média das análises de três repetições ± desvio padrão.

Esses resultados, juntamente com os dados de parâmetro cinético, indicam ativação da “Via das Lipoxigenases”, provavelmente, através do aumento da eficiência catalítica de lipoxigenases e concomitante ação da hidroperóxido ciclase. Esta catalisa a formação do ácido 12-oxo-fitodienóico e, posteriormente, ácido jasmônico, tendo como substrato hidroperóxido de ácidos graxos, produzidos pela ação das lipoxigenases. O ácido jasmônico é considerado um regulador do crescimento e está envolvido na transdução de sinais em resposta ao estresse vegetal. Especificamente, ele interage com um receptor na membrana plasmática para ativar a expressão de genes que codificam inibidores de proteases (FARMER & RYAN, 1992).

Resultados similares foram encontrados por GREEN & RYAN (1972), os quais mostraram que ferimentos em folhas de batata ou folhas de tomate pelo Leptinotarsa decenlineata ou suas larvas, induzem a um rápido acúmulo de inibidores de proteases por todos os tecidos aéreos da plantas. TAYLOR & LEE (1997) também sugerem que os inibidores de proteases atuem na proteção de plantas contra Lepidoptera. Assim, inibidores de proteases em plantas mostram afetar o desenvolvimento de vários herbívoros (PEÑACORTÉS et al., 1993; JONGSMA et al., 1994; HILDER et al., 1987)

Portanto, os resultados obtidos no presente trabalho reforçam a hipótese de que o acúmulo de inibidores de proteases em resposta ao ataque de herbívoros seja, provavelmente, um mecanismo de resposta da planta a inseto.

Como um dos caminhos da “Via das Lipoxigenases” pode produzir aldeídos, foi realizada a determinação dos níveis de hexanal e aldeídos totais, pela ação da hidroperóxido liase. Nos dois genótipos estudados, ocorreu aumento pouco pronunciado nos níveis de hexanal e aldeídos totais em todos os tempos analisados (Tabela 3 e 4). Os resultados sugerem que a planta de soja, em resposta ao ataque de lagarta-da-soja, ative a “Via das Lipoxigenases” e, após a formação de hidroperóxidos de ácidos graxos, o metabolismo segue preferencialmente o caminho da hidroperóxido ciclase, com produção de ácido jasmônico e subsequente ativação e expressão de genes que codificam inibidores de proteases, do que o caminho da hidroperóxido liase com produção de aldeídos. Adicionalmente observa-se que a remoção genética de lipoxigenases das sementes não influenciou na expressão dessas isoenzimas em folhas.

Tabela 3
Níveis de hexanal em plantas de soja, obtidos a partir dos folíolos da primeira folha trifoliolar coletados 6, 12 e 24 horas (presença do inseto) e 6, 12, 24 e 48 horas (após remoção).

		Níveis de hexanal (µvolts.min-1)
Tempo (horas)		IAC-100	IAC-100 TN
	Controle	lagarta	Controle	lagarta
Em presença do inseto 6	1266,00 ± 50,58	1282,33 ± 177,12	577,00 ± 84,97	628,00 ± 90,47
12	1349,67 ± 115,13	1458,00 ± 138,74	550,67 ± 40,66	746,33 ± 174,62
24	1235,67 ± 91,95	1366,67 ± 180,55	597,00 ± 90,88	834,00 ± 108,22
Após remoção do inseto 6	1359,67 ± 89,38	1520,00 ± 89,34	590,26 ± 114,95	772,33 ± 166,61
12	1367,00 ± 21,65	1687,67 ± 186,23	728,33 ± 27,63	932,00 ± 68,63
24	1106,67 ± 122,58	1362,00 ± 33,15	578,00 ± 154,44	584,00 ± 89,23
48	1109,00 ± 33,51	1500,00 ± 118,19	605,00 ± 60,41	784,67 ± 46,45

• ¹
  Valores são a média das análises de três repetições ± desvio padrão.
^-1

Tabela 4
Níveis de aldeídos totais em plantas de soja, obtidos a partir dos folíolos da primeira folha trifoliolar coletados 6, 12 e 24 horas (presença do inseto) e 6, 12, 24 e 48 horas (após remoção).

		Níveis de aldeídos totais (A635)
Tempo (horas)		IAC-100	IAC-100 TN
	Controle	lagarta	Controle	lagarta
Em presença do inseto 6	0,77 ± 0,06	0,78 ± 0,05	0,89 ± 0,01	0,88 ± 0,02
12	0,75 ± 0,05	0,85 ± 0,02	0,83 ± 0,01	0,89 ± 0,03
24	0,77 ± 0,04	0,91 ± 0,07	0,91 ± 0,01	0,86 ± 0,02
Após remoção do inseto 6	0,78 ± 0,01	0,97 ± 0,005	0,85 ± 0,01	0,76 ± 0,03
12	0,84 ± 0,01	0,80 ± 0,03	0,97 ± 0,01	0,84 ± 0,02
24	0,88 ± 0,01	0,87 ± 0,05	0,99 ± 0,01	0,79 ± 0,01
48	0,83 ± 0,01	0,87 ± 0,005	1,02 ± 0,02	0,85 ± 0,02

• ¹
  Valores são a média das análises de três repetições ± desvio padrão.
Solução de extração: etanol 2%. Quantidade de Extrato: 50 µL.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPEMIG pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Set 2024
• Data do Fascículo
  Jan-Mar 2002

Histórico

• Recebido
  02 Nov 2001
• Aceito
  16 Jan 2002