COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS DE IMUNO-HISTOQUÍMICA E BIOENSAIO EM CAMUNDONGOS PARA PESQUISA DE TOXOPLASMA GONDII EM TECIDOS DE CAPRINOS, EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS

COMPARATION TECHNIQUE BETWEEN THE IMMUNOHISTOCHEMICAL TEST AND THE BIOASSAY IN MICE TO DIAGNOSE EXPERIMENTAL INFECTION OF GOATS WITH TOXOPLASMA GONDII

RESUMO

Para testar se a imuno-histoquímica (IH), técnica diagnóstica bastante rápida e de alta especificidade, poderia substituir o bioensaio em camundongos, técnica sensível, porém demorada, nove caprinos foram inoculados com 10⁵ oocistos da cepa AS-28 de Toxoplasma gondii e sacrificados oito semanas depois. Dois animais não inoculados formaram o grupo testemunha. Amostras de cérebro, medula espinhal, retina, fígado, baço, linfonodos cervicais e mesentéricos, rins, pulmões, musculatura cardíaca e esquelética, diafragma, pâncreas, glândula adrenal, glândulas salivares e intestino delgado foram colhidas para pesquisa do parasito através da IH e do bioensaio. Embora todos os caprinos inoculados tenham apresentado sinais clínicos entre o terceiro e o oitavo dias pós-infecção e um deles até o 14º dia, no momento da necrópsia mostravam-se saudáveis. Comprovou-se pelo bioensaio que todos os inoculados estavam parasitados, e cérebro e medula foram os tecidos que se mostraram positivos em maior número de casos. Examinando oito cortes de cada fragmento, corados pela IH nenhum taquizoíta, cisto ou fragmento do parasito foram encontrados. Concluiu-se que o bioensaio ainda é o melhor método para a pesquisa de T. gondii em tecidos de animais infectados, mas assintomáticos e que cérebro e medula espinhal são os órgãos de eleição para o isolamento do agente.

PALAVRAS-CHAVE:
Toxoplasma gondii; caprinos; diagnóstico; imuno-histoquímica; bioensaio.

ABSTRACT

The immunohistochemical test (IH) was compared with the bioassay in mice to diagnose experimental infection of goats with Toxoplasma gondii. The first technique is specific and fast, while the bioassay, a technique widely used to confirm the diagnostic, is sensible but takes many weeks to be done. This study was conducted with the aim to observe the possibility of IH to substitute bioassay in mice. Nine goats received 10⁵ oocists of T. gondii (AS 28) per os and two were kept as non-infected controls, receiving a placebo. Diarrhoea, inapetence and fever were present in all infected goats from 3 to 8 days post-infection and in one of them until the 13th. Control animals showed no symptoms. Eight weeks later all these animals were slaughtered and fragments of brain, spinal cord, retina, liver, spleen, cervical and mesenteric lymph nodes, kidneys, lungs, heart and skeletal muscles, diaphragm, pancreas, adrenal gland, salivary glands and small intestine were collected and submitted to bioassay and IH. Macroscopic lesions were not observed to the necropsy. Eight slides of each fragment were submitted to IH, but no taquizoites, cysts or fragments of the parasite were detected. All the infected goats were positive to the bioassay, and brain and spinal cord were the tissue with many positive cases. None of the controls were positive to these tests. In conclusion: the bioassay is still the best technique to diagnose chronic toxoplasmosis in goats without clinical symptoms.

KEY WORDS:
Toxoplasma gondii; goats; diagnosis; immunohistochemical test; bioassay.

INTRODUÇÃO

Em caprinos, as primeiras evidências da ocorrência da toxoplasmose foram obtidas por FELDMAN & MILLER (1956), nos E.U.A. Nesses animais, o T. gondii pode ser causa primária de danos reprodutivos, provocando sérias perdas econômicas, como já citado por diferentes autores no país e no mundo (JACOBS & LUNDE, 1957; WORK et al., 1970; APTL et al., 1973; MOYA & SERRATO, 1985; DUBEY et al., 1986; DUBEY & TOWLE, 1986; SELLA et al., 1994; GIRALDI et al., 1996).

Entre os animais domésticos, os caprinos são os mais suscetíveis ao T. gondii (DUBEY,1989). Como a toxoplasmose geralmente não produz doença clínica em fêmeas na época do abortamento, não preocupa tanto os criadores quanto as infecções bacterianas e virais (DUBEY, 1987b).

O Brasil já conta com cerca de 12,8 milhões de caprinos, o nono rebanho do mundo, mas contribui com apenas 1,3% da produção mundial de leite de cabra. No período de 1980 a 1992 observou-se um aumento na produção nacional, indicando um crescente interesse na atividade (SELLA et al., 1994;CORDEIRO, 1998). Considerando-se que uma das formas de transmissão do T. gondii é pela ingestão de carne crua, ou mal cozida, os caprinos podem representar uma fonte de infecção para o homem e para os animais carnívoros.

O diagnóstico desta protozoose pode ser realizado por métodos indiretos como a sorologia, ou pela pesquisa direta de cistos e taquizoítas em tecidos, através de cortes histológicos, seja corados pela Hematoxilina e Eosina (HE), seja pela Imunohistoquímica (IH), ou ainda através do Bioensaio, inoculando-se digeridos de tecido do animal suspeito em camundongos.

Em cortes histológicos corados pela HE torna-se difícil a identificação do T. gondii, pois o parasita não possui características tintoriais próprias que permitam distinguí-lo nitidamente das células adjacentes, podendo ser confundido com núcleos ou fragmentos nucleares que se coram de forma semelhante (FARRELL et al., 1952; TSUNEMATSU et al., 1964; BARBOSA, 1988).

Métodos de diagnóstico imuno-histoquímico são específicos e a partir do desenvolvimento do método da peroxidase-antiperoxidase (PAP) por STERNBERGER et al. (1970), vêm sendo usados no diagnóstico pósmorte de diversos agentes infecciosos, particularmente do T. gondii na intimidade dos tecidos (CONLEY et al., 1981; DAVIDSON et al., 1993; FALANGOLA & PETITO, 1993; BREZIN et al., 1994; VIOTTI et al., 1995). Modificações foram introduzidas e DUBEY & LIN (1994), utilizando a técnica imunoenzimática da avidina-biotina, detectaram a presença de cistos do T. gondii no cérebro de uma raposa. VIOTTI et al. (1995), através do PAP, observaram lesões e/ou a presença do T. gondii e seus antígenos nos tecidos de suínos sacrificados na fase aguda da doença, enquanto que pela técnica histológica da HE, o parasita não foi visualizado.

O bioensaio, método usado para a confirmação de casos suspeitos, por sua vez, é muito sensível porém muito oneroso e demorado. Supondo que se a IH, técnica altamente específica e bem mais rápida, se mostrasse tão sensível quanto o bioensaio, essa poderia ser uma alternativa para o diagnóstico da infecção por T. gondii. Neste estudo esses dois métodos foram comparados, bem como se estabeleceu quais os tecidos de eleição para a pesquisa do agente.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados onze caprinos, com quatro a nove meses de idade, criados livres de infecção por parasitas. No início do experimento todos estavam sorologicamente negativos para T. gondii, pela reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e clinicamente sadios.

Os animais testemunha (C1 e C2) receberam solução de NaCl 0,15 M (salina fisiológica) como placebo. Os caprinos C3 a C11 foram inoculados com dose única de uma suspensão de 10⁵ oocistos de T. gondii (cepa AS28), por via oral. Esses caprinos foram mantidos em gaiolas metabólicas com ração, feno de capim Coast Cross (Cynodon dactilon) e água ad libitum, no infectório do VPS/FMVZ/USP. Durante esse período foram examinados clinicamente.

Oito semanas após a inoculação dos oocistos, todos os caprinos foram sacrificados. Amostras de 16 tecidos de cada animal (cérebro, retina, fígado, baço, rins, pulmões, musculatura cardíaca e esquelética, diafragma, pâncreas, medula espinhal, glândula adrenal, linfonodos mesentéricos e cervicais, glândulas salivares e intestino delgado) foram colhidas para pesquisa do parasita através de ensaio biológico em camundongos, segundo JACOBS & MELTON (1957); SHARMA & DUBEY (1981) e da IH, segundo HSU et al. (1981). Na ocasião, para cada tecido, de cada um dos caprinos, foram inoculados cinco camundongos.

Todos os camundongos do bioensaio foram monitorados clinicamente e, após seis semanas, sacrificados para pesquisa de cistos cerebrais e colheita de soro para determinação de anticorpos anti-Toxoplasma, pela RIFI. Nos animais que morreram nesse período, pesquisou-se taquizoítas em lavados peritoniais, pelo exame a fresco. Os camundongos foram considerados Toxoplasma-negativos quando não foram visualizadas formas do parasita à microscopia óptica e pela ausência de anticorpos séricos específicos pela RIFI, segundo técnicas de REMINGTON et al. (1961); DUBEY & FRENKEL (1973); DUBEY (1980).

Oito cortes histológicos de cada tecido foram submetidos à IH. Três cortes foram corados pela HE, para pesquisa de lesões e parasitos. Para a IH dos tecidos foram utilizados o anticorpo primário anti-T.gondii na diluição 1:100 e um anticorpo secundário biotinilado, anti-imunoglobulinas de camundongos, e o conjugado estreptavidina-biotina-peroxidase (do kit comercial DUET, Dako, Dinamarca) na diluição 1:400. Para cortes de cérebro e medula utilizou-se como anticorpo secundário o sistema EnVision (Dako, Dinamarca) sem diluição.

RESULTADOS

Os caprinos inoculados apresentaram hipertermia, apatia e hiporexia entre o terceiro e oitavo dias pós-inoculação (dpi), recuperando-se a seguir. Observou-se diarréia em três deles. Apenas um, o C5, apresentou quadro mais severo com hipertermia, anorexia e emagrecimento além da diarréia, recuperando-se após o 14^o dpi. Os animais testemunha não apresentaram sinais clínicos.

Os camundongos inoculados com tecidos dos caprinos, e nos quais se detectou taquizoítas, apresentaram pelos arrepiados, hipoatividade, ascite e olhos semicerrados. Naqueles em que foram encontrados cistos, esses sintomas nem sempre estavam presentes.

No bioensaio o parasita foi isolado de pelo menos um dos tecidos de cada caprino inoculado, enquanto os animais testemunha apresentaram-se sempre negativos para todos os tecidos testados, como se observa pela Tabela 1.

A análise estatística dos resultados do bioensaio, submetidos ao teste Q de Cochran, identificou diferença significativa no isolamento de T. gondii entre os 16 tecidos bioensaiados. Na análise de freqüência simples verificou-se que o cérebro foi o tecido com maior número de isolamentos, tendo 88,9% de casos positivos. Utilizou-se, então, o teste de McNemar para determinar quais tecidos seriam comparáveis com o cérebro no isolamento do parasito. Correlacionando, dois a dois, os resultados de isolamento dos diferentes tecidos, foi possível verificar que na medula espinhal o isolamento do protozoário foi comparável ao observado no tecido cerebral.

À necropsia não foram observadas lesões macroscópicas, nem nos caprinos inoculados, nem nos testemunha.

As alterações vistas nos cortes de tecidos corados pela HE, dos caprinos inoculados foram: congestão e esplenite aguda, esplenite eosinofílica e hemossiderose no baço; discreta gliose e congestão no cérebro; degeneração vacuolar microgoticular com necrose focal e macrogoticular moderada no fígado; hiperplasia da glândula salivar; enterite eosinofílica e enterite crônica com necrose de vilosidades; discreta linfadenite eosinofílica e discreta hemossiderose dos linfonodos; discreta congestão no tecido medular e congestão do miocardio, mas não foram observados nem taquizoítas nem cistos de T. gondii.

Alterações semelhantes foram observadas nos animais testemunha: áreas de congestão na medula e no cérebro; enterite com predomínio de eosinófilos; degeneração vacuolar microgoticular com necrose focal no fígado; discreta linfadenite, com predomínio de eosinófilos dos linfonodos cervicais e mesentéricos; discretos focos de miocardite crônica e congestão no miocardio; nos pulmões: congestão, hemorragia e pneumonia crônica discreta e esplenite eosinofílica com discreta congestão. Portanto as alterações observadas nos caprinos inoculados foram consideradas inespecíficas, não sugestivas de toxoplasmose.

DISCUSSÃO

DUBEY (1989) e HAGIWARA et al. (1978) observaram que o T. gondii raramente produz doença clínica severa em caprinos. Porém todos os animais deste estudo apresentaram sinais clínicos no início da infecção, semelhantes aos observados por DUBEY (1988) em cabras gestantes. Após o 14º dpi., todos os animais se recuperaram, permanecendo clinicamente sadios até o dia da necropsia.

Apesar de não terem sido detectadas alterações macroscópicas, todos os caprinos inoculados apresentaram o parasita em pelo menos um dos tecidos pesquisados pelo bioensaio, concordando com DUBEY et al. (1980), que isolaram o T. gondii de 100% dos caprinos estudados.

O isolamento do agente pelo bioensaio dos tecidos cerebral, renal, cardíaco e do diafragma assemelhamse aos de DUBEY et al.(1980) e DUBEY (1982, 1988). Entretanto resultados diversos, em relação a alguns desses tecidos, foram citados nesses mesmos trabalhos, comprovando que a distribuição do parasito nos tecidos animais é aleatória.

O T. gondii não foi detectado nos cortes de tecidos corados pela HE. Somente alterações inflamatórias e degenerativas foram observadas e consideradas inespecíficas, por se apresentarem em ambos os grupos de caprinos. Estes achados concordam com os de MCSPORRAN et al. (1985), DUBEY (1987a), VIDOTTO et al.(1987), VIOTTI et al.(1995) e REDONDO & INNES (1998) que, além das lesões, também detectaram o protozoário nos tecidos de animais inoculados com diferentes doses de oocistos de diferentes cepas de T. gondii. Tais lesões foram consideradas sugestivas de toxoplasmose por DUBEY (1987b) e VIDOTTO et al. (1987).

DUBEY (1989) demonstrou que animais jovens são mais susceptíveis que os adultos e que os taquizoítas são mais freqüentemente detectados em animais debilitados, o que não ocorreu no presente estudo, no qual os caprinos se apresentavam em bom estado geral quando do sacrifício.

Tabela 1
Detecção de Toxoplasma gondii a partir de tecidos de caprinos inoculados por via oral, com 10⁵ oocistos da cepa AS-28, determinada pelo bioensaio em camundongos, segundo o critério usado para considerar o material positivo e o percentual de positividade, São Paulo, 1999.

Tecido	CAPRINOS
	Testemunhas (n=2)		Inoculados (n=9)
	Negativos	%	Positivo
			cistos	taquizoítas	RIFI dos camundongos	total de positivos	% de positivos
baço	2	100	2	1	-	3	33,3
cérebro	2	100	3	5	-	8	88,9
fígado	2	100	1	3	-	4	44,4
glândula adrenal	2	100	1	1	-	2	22,2
glândula salivar	2	100	-	2	-	2	22,2
intestino delgado	2	100	-	3	-	3	33,3
linfonodos cervicais	2	100	-	1	-	1	11,1
linfonodos mesentéricos	2	100	1	3	-	4	44,4
medula espinhal	2	100	3	3	1	7	77,8
músculo cardíaco	2	100	1	4	-	5	55,6
diafragma	2	100	3	3	-	6	66,7
músculos esqueléticos	2	100	2	4	-	6	66,7
pâncreas	2	100	3	2	-	5	55,6
pulmões	2	100	-	3	-	3	33,3
retina	2	100	2	-	-	2	22,2
rins	2	100	3	2	-	5	55,6

^o

Em nenhum dos cortes de tecidos corados pela imuno-histoquímica detectou-se a presença de taquizoítas ou cistos de T.gondii, enquanto UGGLA et al. (1987) e VIOTTI et al. (1995) observaram a presença de T. gondii e seus antígenos, respectivamente, nos tecidos de ovinos e suínos experimentalmente infectados. Essas divergências talvez se devam ao fato de se estar comparando resultados de experimentos em que os animais foram sacrificados na fase aguda da infecção ou, muito debilitados, com os deste experimento, em que os caprinos se encontravam na fase crônica (VITOR et al., 1999) e em bom estado de saúde. Deve-se considerar também as vias de inoculação e a forma infectante utilizadas, a espécie do hospedeiro e a imunogenicidade da cepa que podem influir na dinâmica da infecção, bem como a distribuição aleatória do agente nos diferentes tecidos do hospedeiro.

Ressalte-se que a utilização de cortes histológicos, corados pela HE e pela IH, para pesquisa de T. gondii, não deve ser desestimulada, principalmente em casos clínicos suspeitos de toxoplasmose, pois tecidos como placenta, membranas fetais e/ou tecidos de fetos não foram alvo desta investigação e há vários autores que relatam a observação freqüente de taquizoítas nos tecidos citados, assim como lesões macro e microscópicas sugestivas de toxoplasmose (MCSPORRAN et al., 1985; DUBEY et al., 1986; DUBEY, 1987a; DUBEY, 1988; UGGLA et al., 1987).

CONCLUSÕES

Conclui-se que o bioensaio em camundongos continua sendo melhor método para a detecção do T.gondii em tecidos de caprinos do que a imuno-histoquímica, na fase assintomática da infecção, sendo que o cérebro e a medula mostraram ser os tecidos mais adequados para o isolamento do agente.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP pelo apoio financeiro (Processo 97/ 1177-7) e pela bolsa de Mestrado de Cristiene Rosa (Processo P97/12609-5), aos estagiários e pósgraduandos do Setor de Doenças Parasitárias do VPS/ FMVZ/USP, pelo auxílio no trato com os animais.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Set 2024
• Data do Fascículo
  Jan-Jun 2001

Histórico

• Recebido
  26 Jul 2000