CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TIPO A PORTADORES DO GENE CPB-2 ASSOCIADOS À LESÕES EM ÍLEO DE COELHOS

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TYPE-A STRAINS CARRYING THE CPB-2 GENE ASSOCIATED TO THE LESIONS IN RABBIT ILEUM

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo verificar a patogenicidade de cultivos de amostras de Clostridium perfringens tipo A, portadoras do gene CPB-2 codificador da toxina beta-2. Utilizou-se o modelo de alças intestinais ligadas em coelhos, inoculadas com suspensão e filtrado de cultivos de amostras de C. perfringens tipo A, portadoras e não portadoras do gene CPB-2. Comparou-se os efeitos da inoculação das suspensões de culturas com os induzidos pelos filtrados destas suspensões. Obteve-se resultado estatisticamente significante quanto à distensão das alças, a qual foi observada em 19 das 24 alças testadas com inóculos procedentes de amostras CPB-2 positivas e, em apenas uma das 12 testadas com inóculos obtidos de amostra CPB-2 negativa. Não houve diferença estatisticamente significante entre a utilização das suspensões de culturas ou de seus filtrados, no que diz respeito à distensão das alças intestinais devido à exsudação de fluido. O exame histológico dos fragmentos de íleos inoculados com suspensão e filtrado de amostras CPB-2 positivas exibiram lesões acentuadas. Os segmentos inoculados com suspensão e filtrado de amostra CPB-2 negativa e caldo BHI estéril não exibiram alterações. As cepas de C. perfringens tipo A, portadoras do gene codificador da toxina beta-2, demonstraram sua virulência quando inoculadas em íleo de coelho.

PALAVRAS-CHAVE:
Clostridium perfringens tipo A; toxinas; beta-2; diarréia; suínos.

ABSTRACT

The aim of this work was to verify the patogenicity of Clostridium perfringens type-A strains, carrying the CPB-2 gene, that codify the beta-2 toxin production. The rabbit ligated ileal loop model was used, inoculating culture suspensions of C. perfringens type-A CPB-2 carrier strains or its filtrates. The dilatation observed in 19 out of 24 loops receiving innocula from CPB-2 positive strains and in only one out of 12 loops treated with CPB-2 negative innocula constituted a significant statistical difference. There was no statistical difference in the dilatation of loops between using filtrates or bacterial suspensions. In the loops treated with suspensions of CPB-2 positive strains cultures, severe lesions were observed, and for those inoculated with filtrates of the same cultures less severe alterations were observed. In the loops inoculated with culture suspensions or filtrates from a CPB-2 negative strain and in those treated with sterile BHI broth, no histological changes were observed. The C. perfringens biotype-A strains carrying the CPB-2 gene, showed its virulence when inoculated into the rabbit ileum.

KEY WORDS:
Clostridium perfringens type-A; toxins; beta-2; diarrhea; swine.

INTRODUÇÃO

Espécies do gênero Clostridium têm sido consideradas como causa primária de doenças entéricas em diferentes espécies animais.

De acordo com as toxinas produzidas pode-se identificar cinco tipos denominados A, B, C, D e E, estando o tipo C, produtor das toxinas beta e alfa, freqüentemente associado a doenças entéricas em suínos (HATHEWAY, 1990). Os biótipos B, D e E são esporadicamente isolados do trato intestinal desses animais (SONGER,1996).

O tipo A, foi considerado por muito tempo parte da microbiota intestinal e não patogênico, quando se consideram apenas as doenças do trato gastrointestinal.

A toxina alfa, produzida por amostras desse tipo e codificada pelo gene CPA, não tem demonstrado capacidade de produzir doenças entéricas em leitões (SONGER & GLOCK, 1998; HERHOLZ, 1999; HATHEWAY, 1990).

Entretanto, relatos provenientes de países europeus, africanos, Estados Unidos e Brasil, têm atribuído a este tipo a causa de diarréia em leitões (SONGER, 1996; CAMPOS et al., 2001; COLLINS et al., 1989).

Duas toxinas, a enterotoxina e a toxina beta-2, têm sido consideradas como potenciais fatores de virulência nas doenças entéricas relacionadas ao tipo A.

Infecções experimentais em leitões com amostras produtoras de enterotoxina, e a sua detecção em fezes de leitões com diarréia, têm demonstrado a participação desta toxina na etiologia das enterites nestes animais (SONGER & GLOCK, 1998; SONGER, 1996).

A toxina beta-2, seu gene codificador e algumas de suas propriedades biológicas foram caracterizados em 1997 (GIBERT et al., 1997). Com base nesses conhecimentos, novos estudos foram realizados com o objetivo de esclarecer a importância da toxina beta-2 como possível fator de virulência. Investigações epidemiológicas utilizando fezes de suínos com e sem diarréia, demonstraram a maior ocorrência do gene CPB-2 entre os animais doentes, sugerindo ter a toxina codificada por este gene uma função relevante no processo patogênico (KLAASEN et al., 1998; GIBERT et al., 1997). GIBERT et al. (1997) também demonstrou o efeito citotóxico da toxina beta-2 em culturas de células da linhagem 1.407 e seu efeito letal em camundongos.

A relevância do tipo A como agente primário nas infecções gastroentéricas e os fatores de virulência envolvidos, ainda não se encontra complemente esclarecida, havendo a necessidade de mais pesquisas para a confirmação de seus efeitos (COLLINS et al.,1989; SONGER & GLOCK, 1998; KLAASEN et al., 1999; CAMPOS et al., 2001).

Com o objetivo de contribuir para o esclarecimento da patogenicidade da toxina beta-2 sobre o trato gastrointestinal, foi proposto comparar as alterações anatomopatológicas induzidas pela inoculação de cultivos de amostras portadoras e não portadoras do gene CPB-2 de C. perfringens tipo A, utilizando como modelo alças intestinais ligadas em coelhos.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras bacterianas

A característica das quatro amostras de C. perfringens utilizadas no teste encontram-se expressas na Tabela 1. Todos os isolados foram submetidos à reação da polimerase em cadeia para a detecção de genes codificadores de toxinas, incluindo o CPB-2, CPB, CPA, CPE, ETX e IA conforme descrito por GARMORY et al. (2000).

Tabela 1
Descrição das amostras de C. perfringens utilizadas no teste de alças ligadas.

Amostra	Origem	Genes presentes
LSS-CP37/01	Isolada de fragmento intestinal de leitão com diarréia	cpa, cpb-2
LSS-CP21/01	Isolada de fragmento intestinal de leitão com diarréia	cpa, cpb-2
LSS-CPIBA/01	Coleção do Instituto Biológico de São Paulo	cpa, cpb-2
LSS-CPD2/01	Isolada de fezes de leitão sadio	cpa

Animais

Seis coelhos machos, da raça Nova Zelândia, pesando 1 - 1,5kg foram utilizados para o teste em alças intestinais ligadas. O procedimento foi aprovado pela Comissão de Ética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

Procedimento cirúrgico

Adotou-se os procedimentos descritos por DUNCAN & STRONG (1969) e TEIXEIRA et al. (1999).

Administrou-se 0,1 mg/kg de droperidol e citrato de fentanila (Nilperidol^®) como pré-anestésico, pela via intramuscular e, em seguida anestesiou-se os animais com uma associação de tiletamina e zolazepam (Zoletil^®), sendo injetada a dose de 10 mg/ kg, pela via intramuscular.

Procedeu-se a laparotomia para a exposição do íleo e lavagem do lúmen intestinal com injeção de 20 mL de solução fisiológica estéril, sendo realizada massagem manual para a drenagem da solução através da válvula íleo-cecal.

Preparou-se sete alças intestinais, com aproximadamente cinco centímetros de comprimento, mantendo-se uma distância mínima de 5 cm entre as ligaduras das alças.

Preparação dos inóculos

As 4 amostras bacterianas foram incubadas por 24h em caldo BHI contendo 5% de cisteína, sob condições anaeróbicas. Utilizou-se um padrão de culturas com concentração média de 10⁸ células/mL, sendo empregado 0,5 mL como inóculo de cultura em suspensão. Centrifugou-se 2 mL das culturas a 8.000 rpm durante cinco minutos. Após este procedimento, filtrou-se o sobrenadante em filtro Milipore^® de 0,45 µ e do produto obtido utilizou-se 0,5 mL como inóculo, livre de células vegetativas e esporos.

Teste de alças intestinais ligadas

Cada alça previamente preparada recebeu um tipo de inóculo, conforme descrito na Tabela 2.

Tabela 2
Delineamento experimental.

Animal	Alça	Amostra	Gene cpb2	Tipo de inóculo
1	1	LSS-CP37/01	+	Filtrado
	2	LSS-CP37/01	+	Suspensão
	3	LSS-CP21/01	+	Filtrado
	4	LSS-CP21/01	+	Suspensão
	5	LSS-CPD2/01	-	Filtrado
	6	LSS-CPD2/01	-	Suspensão
	7	Caldo BHI estéril
2	1	LSS-CP37/01	+	Filtrado
	2	LSS-CP37/01	+	Suspensão
	3	LSS-CP21/01	+	Filtrado
	4	LSS-CP21/01	+	Suspensão
	5	LSS-CPD2/01	-	Filtrado
	6	LSS-CPD2/01	-	Suspensão
	7	Caldo BHI estéril
3	1	LSS-CP37/01	+	Filtrado
	2	LSS-CP37/01	+	Suspensão
	3	LSS-CPIBA/01	+	Filtrado
	4	LSS-CPIBA/01	+	Suspensão
	5	LSS-CPD2/01	-	Filtrado
	6	LSS-CPD2/01	-	Suspensão
	7	Caldo BHI estéril
4	1	LSS-CPIBA/01	+	Filtrado
	2	LSS-CPIBA/01	+	Suspensão
	3	LSS-CP37/01	+	Filtrado
	4	LSS-CP37/01	+	Suspensão
	5	LSS-CPD2/01	-	Filtrado
	6	LSS-CPD2/01	-	Suspensão
	7	Caldo BHI estéril
5	1	LSS-CPIBA/01	+	Filtrado
	2	LSS-CPIBA/01	+	Suspensão
	3	LSS-CP21/01	+	Filtrado
	4	LSS-CP21/01	+	Suspensão
	5	LSS-CPD2/01	-	Filtrado
	6	LSS-CPD2/01	-	Suspensão
	7	Caldo BHI estéril
6	1	LSS-CPIBA/01	+	Filtrado
	2	LSS-CPIBA/01	+	Suspensão
	3	LSS-CP21/01	+	Filtrado
	4	LSS-CP21/01	+	Suspensão
	5	LSS-CPD2/01	-	Filtrado
	6	LSS-CPD2/01	-	Suspensão
	7	Caldo BHI estéril

Após a inoculação, realizou-se a sutura da incisão, mantendo-se os animais sob o efeito de cloridrato de tramadol (Tramal^®) por 12h. Decorrido esse período, os animais foram eutanasiados com uma associação de iodeto de mebezônio, embutramida e cloridrato de tetracaína (T-61^®), e necropsiados para a observação macroscópica das lesões. Classificou-se como resultados positivos as alças distendidas devido a exsudação de fluído e negativo as que não exibiam este aspecto.

Exame histopatológico

Para o exame histopatológico, foram colhidos fragmentos de alças intestinais, medindo aproximadamente dois centímetros, os quais foram mantidos em solução de formol à 10%, por 24h. Após este período, os espécimes foram desidratados em soluções de álcool em diferentes concentrações e incluídos em parafina. Obteve-se cortes de 5 µ que foram corados pela hematoxilina-eosina.

Análise dos dados

Análise 1

Aplicou-se o teste qui-quadrado de MantelHaenszel para verificar se havia diferença entre a distensão determinada pela exsudação de fluído induzida pelos inóculos obtidos de amostras CPB-2 positivas e negativas, sem considerar a natureza do inóculo (suspensão ou filtrado).

Análise 2

Utilizou-se o teste exato de Fisher, não paramétrico (SIEGEL, 1956), para verificar se havia diferença entre a exsudação de fluído induzida pelos inóculos obtidos das suspensões e dos filtrados bacterianos das amostras CPB-2 positivas.

Análise 3

Empregou-se o teste exato de Fisher, não paramétrico (SIEGEL, 1956), para verificar se havia diferença entre a exsudação de fluído induzida pelos inóculos obtidos das suspensões e dos filtrados bacterianos da amostra CPB-2 negativa e CPA positiva (LSS-CPD2/01).

RESULTADOS

Exame macroscópico

Os resultados do exame macroscópico, baseado na distensão das alças inoculadas, encontram-se expressos na Tabela 3.

Tabela 3
Resultado da exsudação de fluído associado à natureza do inóculo.

Análise	Natureza do inóculo	No. de alças distendidas	No. de alças sem distensão	No total de alças
1	Cpb-2+ a	19	5	24
	Cpb-2- b	1	11	12
		20	16	36
2	Cpb-2+ filtrado c	9	3	12
	Cpb-2+ suspensão c	10	2	12
		19	5	24
3	Cpb-2- filtrado d	1	5	6
	Cpb-2+ suspensão d	0	6	6
		1	11	12

a, b: para a análise 1, qui-quadrado Mantel-Haenszel = 15,80 e p < 0,001; c: para a análise 2, teste exato de Fisher p = 0,5; d: para a análise 3, teste exato de Fisher p = 0,5.

Os resultados referentes as seis alças inoculadas com caldo BHI estéril, foram considerados negativos.

Na análise 1, detectou-se uma diferença estatisticamente significante entre inóculos CPB-2 positivos e negativos, no que se refere à propriedade de induzir exsudação de fluído, sendo este resultado observado em dezenove das 24 alças testadas com inóculos CPB2 positivos e, em uma alça das doze testadas com inoculo CPB-2 negativo, para o valor de p < 0,001 e de qui-quadrado Mantel-Haenszel igual a 15,80.

As análises 2 e 3, baseadas no teste exato de Fisher, não paramétrico, mostraram não haver diferença significante entre os inóculos de amostras CPB-2 positivas e negativas.

Exame microscópico

Os fragmentos de íleo que receberam os inóculos CPB-2 positivos sob a forma de suspensão, revelaram lesões representadas por necrose das camadas mucosa, submucosa, muscular e serosa (Figs.1 e 2). Os espécimes inoculados com filtrado CPB-2 positivos, apresentaram necrose das vilosidades, congestão e edema da submucosa (Fig. 3).

Fig. 1
Fotomicrografia de corte histológico de íleo inoculado com amostra LSS-CP37/01; suspensão de cultura. Notar necrose das camadas mucosa, submucosa, muscular e serosa. HE, 35X.

Fig. 2
Fotomicrografia de corte histológico de íleo inoculado com amostra LSS-CPIBA; suspensão de cultura. Notar necrose das camadas mucosa, submucosa, muscular e serosa. HE, 14X.

Fig. 3
Fotomicrografia de corte histológico de íleo inoculado com amostra LSS-CP37/01; fultrado de cultura. Notar necrose das vilosidades e edema da submucosa. HE, 35X.

Nos segmentos de íleos inoculados com amostras CPB-2 negativas sob a forma de suspensão ou filtrado e nos que receberam caldo BHI estéril, notou-se que os inóculos preenchiam a luz intestinal, com ausência de alterações estruturais. (Figs. 4, 5 e 6).

Fig. 4
Fotomicrografia de corte histológico de íleo inoculado com amostra LSS-CPD2/01; suspensão de cultura. Notar ausência de lesões estruturais. HE, 35X.

Fig. 5
Fotomicrografia de corte histológico de íleo inoculado com amostra LSS-CPD2/01; filtrado de cultura. Notar ausência de alterações estruturais e presença do inóculo na luz, caracterizado por substância rósea. HE, 25X.

Fig. 6
Fotomicrografia de corte histológico de íleo inoculado com caldo BHI estéril. Notar ausência de alterações estruturais e presença do inoculo na luz, caracterizado por substância rósea. HE, 14X.

DISCUSSÃO

Tem-se questionado a relevância do C. perfringens tipo A, como agente etiológico responsável por doenças entéricas em suínos, especialmente, no que diz respeito a patogenicidade da toxina beta-2.

O presente estudo, revelou ser mais profusa a exsudação presente nas alças intestinais de coelhos inoculadas com as amostras CPB-2 positivas, não havendo diferença entre a inoculação sob a forma de suspensão ou filtrado. Associado a essas observações, evidenciou-se aspectos importantes a respeito das lesões causadas pela inoculação das suspensões e filtrados de amostras CPB-2 positivas. Notou-se que as alterações microscópicas relacionadas aos segmentos de íleos variaram quanto a sua intensidade, sendo a inoculação de suspensões caracterizadas por necrose extensa e severa das camadas mucosa, submucosa, muscular e serosa e, as induzidas pelo filtrado, representadas por necrose das vilosidades, congestão e edema da camada submucosa. Estudos conduzidos por SONGER & GLOCK (1998) e GARMORY et al. (2000) descreveram alterações semelhantes às verificadas para os fragmentos inoculados com filtrados de amostras CPB-2 positivas.

Considerando que, o inóculo sob a forma de suspensão, obtido das amostras CPB-2 positivas, determinou lesões mais proeminentes do que sob a forma filtrada, pode-se supor que as células vegetativas presentes nas suspensões tenham sido as responsáveis por esta característica, devido à produção adicional de toxina. Outra possibilidade relaciona-se à instabilidade da toxina beta-2, como relatado por GIBERT et al. (1997), podendo a ausência de células vegetativas no inóculo filtrado, estar relacionada a lesões menos severas. Ainda, deve-se considerar a possibilidade do envolvimento de outros fatores de virulência como o fator de adesão ao epitélio intestinal, descrito por TEIXEIRA et al. (1999).

Em relação, aos efeitos da inoculação da suspensão e filtrado de amostras CPB-2 negativa e CPA positiva (LSS-CPD2/01), não se evidenciou lesões nas estruturas teciduais, ressaltando a participação da toxina beta-2 como fator de virulência capaz de causar lesões significativas e demonstrando não haver relação entre a toxina alfa e a presença de alterações, estando de acordo com os dados observados por DUNCAN & STRONG (1969).

Embora, a literatura apresente escassas informações sobre o assunto, pôde-se concluir diante dos resultados obtidos, que a toxina beta-2 induziu exsudação de fluído e lesões estruturais expressivas nos segmentos de íleos de coelho testados com amostras de C.perfringens tipo A portadoras do gene CPB2, agindo como potente fator de virulência.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jun 2024
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2004

Histórico

• Recebido
  05 Jul 2004
• Aceito
  09 Ago 2004