ESTUDO COMPARATIVO DA SENSIBILIDADE DE CULTURAS PRIMÁRIAS DE CÉLULAS EPITELIAIS DE OVIDUTO BOVINO E MURINO AO HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1 (BHV-1)

COMPARATIVE STUDY OF THE SENSITIVITY OF BOVINE AND MURINE OVIDUCT EPITHELIAL CELL PRIMARY CULTURE TO BOVINE INFECTIOUS RINOTRACHEITIS VIRUS (BHV-1)

RESUMO

A co-cultura de células epiteliais de oviduto bovino (BOEC) supre as necessidades de desenvolvimento dos embriões bovinos do estádio de mórula até blastocisto expandido no processo de fecundação in vitro (FIV). Este estudo avaliou a sensibilidade das células epiteliais de oviduto bovino e murino ao vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina. As culturas primárias de células epiteliais de oviduto bovino e murino foram infectadas com o vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (10^5.6 TCID 50/mL). O efeito citopático foi observado 48 horas após a infecção, e o vírus titulado em células MDBK. A avaliação preliminar mostrou que tanto as células de oviduto bovino quanto as de oviduto murino apresentaram efeito citopático característico do vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina, com título, respectivamente de 10^6.5 TCID 50/mL e 10^4.8 TCID 50/ mL. Este estudo mostra que as células de oviduto murino são menos susceptíveis ao vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina, as quais podem apresentar vantagens no co-cultivo de embriões bovinos fecundados in vitro

PALAVRAS-CHAVE:
Rinotraqueíte infecciosa bovina; oviduto; cultura primária; BHV-1.

ABSTRACT

Bovine oviduct epithelia cell co-culture provides the development needs of bovine embryos in the in-vitro fecundation (IVF) process. This study evaluated bovine and murine oviduct epithelial cell sensitivity to bovine infectious rinotracheitis virus (BHV-1). Their cultures were infected with the bovine infectious rinotracheitis virus (105.6 TCID 50/mL). The cytopathic effect was observed 48 hours after the infection, and the virus was titred in MDBK cells. The evaluation showed that both cell types, bovine and murine, presented BHV-1 characteristic cytopathic effect. The titres found were 106.5 TCID 50/mL for the bovine oviduct and 104.8 TCID 50/mL for the murine oviduct. This study showed that murine oviduct cells are less susceptible to BHV-1 than the bovine ones. This could be advantageous in terms of the embryos co-culture system in IVF.

KEY WORDS:
Infectious bovine rinotracheithys; oviduct; primary culture; BHV-1.

INTRODUÇÃO

As linhagens celulares permanentes têm como principais vantagens a ótima reprodutibilidade, a facilidade de manutenção e o controle de qualidade assegurado pelos fornecedores, principalmente, no que se refere à presença de contaminantes e endotoxinas. Porém, deve-se levar em consideração que, assim como ocorre em todos os tipos de cultivo in vitro, a sua manipulação deve seguir critérios rigorosos que evitem a contaminação posterior no ambiente do laboratório. Uma das maiores desvantagens do uso de linhagens permanentes é o fato de que as células sofrem um processo de desdiferenciação que pode levar à perda de características funcionais importantes, como por exemplo, a de atividades enzimáticas (DALTON et al.,1994; HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1993; KAWASHIMA, 1994; OESH & DIENER, 1995).

Uma maneira de contornar-se esse problema é o uso de culturas primárias que, embora não sejam submetidas a um controle de qualidade semelhante ao das culturas permanentes, são de fácil obtenção e manipulação e dentro de certos limites de tempo permitem a fácil reprodutibilidade do experimento.

Sistemas de co-cultura com células epiteliais de oviduto bovino têm sido muito utilizadas para obtenção de um maior número de embriões, quando esses são provenientes de técnicas de fecundação in vitro (FIV) (HERNANDEZ-LEDEZMA et al, 1993; MENCK, 1994; MINAMI, 1996; SPARKS et al., 1992). Embora o sucesso dessas técnicas tenha sido constatado em uma grande variedade de espécies, sugerindo que os efeitos embriotróficos benéficos das células do oviduto sejam espécie-específicos (GOTO et al., 1993; KAWASHIMA et al., 1994; MINAMI, 1996), existem relatos que não verificaram diferença significativa no desenvolvimento de embriões in vitro quando co-cultivados em monocamadas de células provenientes de espécies diferentes (DESAI et al.,1994; GOTO et al.,1992; GOTO et al.,1993; HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1993; KANNO et al., 1995; LEPPENS et al.,1996; SENDAI et al.,1995; SHARIF et al.,1991; THIBIER et al.,1993). Entretanto, recentemente foi verificado que células epiteliais de oviduto murino utilizadas como co-cultura para o desenvolvimento de embriões bovinos apresentam fatores embriotróficos tão eficientes quanto às próprias células de oviduto bovino (DALTON et al.,1994; KIM et al.,1996; MINAMI et al., 1991; MINAMI, 1996; SPARKS et al.,1994; THIBIER et al.,1993).

A ausência ou a baixa sensibilidade das células somáticas utilizadas no co-cultivo ao vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina é uma característica vantajosa em fertilização in vitro, já que se visa a produção de embriões sadios e o controle da disseminação de doenças. Porém, pouco se conhece sobre as implicações epidemiológicas desses procedimentos (DESAI et al., 1994; ZUROVAC et al., 1994). O objetivo desse estudo foi avaliar a sensibilidade de culturas primárias de células epiteliais de oviduto bovino e murino ao vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta e Preparo do Material

Células Epiteliais de Oviduto Bovino

Os ovidutos foram obtidos em abatedouros, lavados em álcool 70% e transportados em solução salina tamponada estéril (PBS), a 4º C. Inicialmente, eram dissecados e colocados em uma placa de Petri onde cada um deles foi raspado com auxílio de duas lâminas de vidro estéreis no sentido fímbria/ístimo para obtenção das células epiteliais. As células foram lavadas 3 vezes por decantação com PBS. Após a última lavagem, foi aliquotado 200 µL do pellet para cada frasco de cultivo. A cada frasco foi adicionado meio TCM199 acrescido de 10% de soro fetal bovino, piruvato e antibiótico. Os frascos foram mantidos em estufa umidificada, a 37º C, a 5% de CO₂ e a cada 48 horas o meio era renovado, com a monocamada atingindo confluência total em 5 a 7 dias, quando então eram utilizadas para o inóculo do vírus (MENCK et al., 1994). As fotos foram feitas após 48 horas de infecção tanto no grupo controle quanto no grupo experimental (Figs. 1 e 2).

Fig. 1
Cultura primária de células epiteliais de oviduto bovino (BOEC) - controle (aumento de 100x).

Fig. 2
Cultura primária de células epiteliais de oviduto bovino após 48 horas de exposição ao BHV-1 (aumento de 100x).

Células Epiteliais de Oviduto de Camundongo

Foram utilizadas fêmeas púberes, nulíparas, da linhagem Balb C (e/ou variedade Swiss), entre 6 a 8 semanas de idade, acasaladas com machos vasectomizados da mesma linhagem. As fêmeas foram sacrificadas por deslocamento da junção cérebro/espinal, aberto o abdômen, com exposição e extirpação dos ovidutos,os quais foram então colocados em solução salina tamponada estéril acrescida de 10% de soro fetal bovino. Para a obtenção das células da luz, os ovidutos foram submersos em solução de pronase por 90 minutos e mantidos em estufa umidificada a 37º C, a 5% de CO₂. Após esse período os ovidutos eram raspados com agulhas estéreis e as células da luz transferidas para placas de cultivo contendo meio TCM 199 acrescido de 10% de soro fetal bovino, piruvato e antibiótico, e reincubados nas mesmas condições descritas acima, até formação de monoestrato celular confluente (5º dia de cultivo).

Vírus

Amostra

Vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina, BHV-1, amostra Los Angeles (título de 10^5.76 TCID₅₀/mL). As amostras foram estocadas a -80º C em meio MEM sem soro fetal bovino.

Infectividade do Vírus Sobre as Células

As culturas foram infectadas com 0,5 mL do vírus. Após 48hs de incubação a 37º C foi observada a ocorrência de efeito citopático e as células foram congeladas e descongeladas e, a infectividade do vírus foi determinada pelo método de microtitulação.

Microtitulação

Volumes de 0,1 mL contendo 3x10⁴ células MDBK foram distribuídos em cada cavidade da placa de microtitulação. As placas foram incubadas a 37º C em estufa com 5% de CO₂ e, após 24 horas, lavadas com solução de Hank's. Os monoestratos foram inoculados com 0,1 mL de diluições de base 10, variando de 10^-2 a 10^-7 das amostras dos sobrenadantes das culturas. As placas foram incubadas a 37º C e examinadas após 24, 48 e 72 horas para a verificação da ocorrência de efeito citopático. Os títulos foram calculados, após 72 horas, em dose infectante em cultura de tecidos (DICT₅₀/0,1mL) expressa em logaritmo decimal (SAKKAS et al., 1992).

DISCUSSÃO

A ausência de informações necessárias para o desenvolvimento de embriões bovinos de uma célula até o estádio de blastocisto tem dificultado o desenvolvimento de um meio quimicamente definido para manutenção de embriões bovinos in vitro. A obtenção de um sistema de co-cultivo celular pode auxiliar em muito a aplicação de técnicas de micromanipulação (SPARKS et al., 1992).

Os resultados mostraram que células epiteliais de oviduto bovino e murino podem ser cultivadas in vitro em meio TCM199 acrescido de 10% de soro fetal bovino, piruvato e antibiótico, atingindo confluência respectivamente em 7 e 5 dias de cultivo. Ambas as células, com trocas de meio de dois em dois dias se mantém viáveis por até 16 dias, o que possibilita a manutenção de embriões in vitro, onde são utilizadas até o 14º dia.

Estudos sobre a eficiência da co-cultura com oviduto murino para o desenvolvimento de embriões bovinos maturados e fertilizados in vitro mostraram que as células de oviduto podem provocar a indução da atividade de enzimas nos embriões que auxiliam o seu desenvolvimento (MINAMI et al., 1996). Sakkas trabalhando com pré-implantação de embriões de camundongo em diversos tipos de co-cultivos observou que os embriões cultivados em células epiteliais de oviduto murino, em comparação as outras células, apresentam uma maior viabilidade após a transferência (SAKKAS et al., 1992). A análise da expressão do fator de crescimento na pré-implantação de ovidutos de camundongo sugere que os esteróides ovarianos não têm um papel importante na modulação da expressão desses genes no oviduto durante o período de pré-implantação, mostrando que vários fatores de crescimento são sintetizados pelo próprio oviduto murino (DALTON et al., 1994).

Em relação a susceptibilidade dessas células ao vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina nossos resultados mostram que tanto as células de oviduto bovino (Figs. 1 e 2) quanto as de oviduto murino (Figs. 3 e 4) apresentaram efeito citopático característico do vírus da rinotrauqeíte infecciosa bovina, sendo que as de oviduto murino apresentam menor sensibilidade do que as de oviduto bovino. Os títulos foram, respectivamente, 10^4.8 TCID₅₀/mL e 10^6.5 TCID₅₀/mL.

Fig. 3
Cultura primária de células epiteliais de oviduto murino - controle (aumento de 100x).

Fig. 4
Cultura primária de células epiteliais de oviduto murino após 48 horas de exposição ao BHV-1. A seta indica a presença de efeito citopático. (aumento de 100x).

Portanto, as células de oviduto murino, com essa característica, podem oferecer vantagens, se utilizadas em co-cultivo de embriões bovinos in vitro, já que proporcionam um sistema com menor possibilidade para a transmissão do vírus, e com isso auxiliar o controle e disseminação da doença, como também o desenvolvimento de embriões bovinos in vitro (BIELANSKY et al., 1996).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Set 2024
• Data do Fascículo
  Oct-Dec 2002

Histórico

• Recebido
  29 Maio 2002
• Aceito
  27 Out 2002