CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS DE MYCOBACTERIUM BOVIS DO ESTADO DE SÃO PAULO BRASIL, UTILIZANDO A TÉCNICA DE SPOLIGOTYPING

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF MYCOBACTERIUM BOVIS ISOLATES FROM THE STATE OF SÃO PAULO, BY THE USE OF THE SPOLIGOTYPING TECHNIQUE

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi estudar, pela técnica de Spoligotyping, 43 isolados de Mycobacterium bovis, provenientes de bovinos abatidos no Estado de São Paulo, em 12 diferentes espoligotipos. Destes isolados 35 foram classificados em 6 espoligotipos já conhecidos (SB0295, SB0121, SB0140, SB0120, AR28 e SB0122) e os outros 8 em 6 novos espoligotipos. Vinte e nove amostras foram classificados nos espoligotipos SB0295, SB0121 e SB0140, sendo o espoligotipo SB0140 majoritário na Argentina e presente no Paraguai e Uruguai. O espoligotipo SB0120 é o mais freqüente na França (26%), tendo sido encontrado na Bélgica, China, Dinamarca, Iran, Japão, Portugal, Rússia, África do Sul, Espanha, Sri Lanka e Holanda. O espoligotipo AR28, já foi encontrado na Argentina e no Brasil. O espoligotipo SB0122 foi referido apenas na Holanda. Dos novos espoligotipos encontrados no presente estudo, é importante ressaltar, que até o momento

6 deles são espoligotipos únicos, dois isolados como espoligotipo N7 e dois isolados como espoligotipo N8. Estes resultados mostram que existem no Brasil espoligotipos que parecem, até o momento, ser compartilhados entre Brasil, Argentina e Europa. Sendo assim a discriminação molecular de isolados de M. bovis através do Spoligotyping constitui-se numa ferramenta para sistemas de vigilância na detecção de focos de tuberculose bovina.

PALAVRAS-CHAVE:
Mycobacterium bovis; Spoligotyping; espoligotipos; caracterização molecular; tuberculose bovina; sistemas de vigilância.

ABSTRACT

This goal of this research was to study, by Spoligotyping, 43 Mycobacterium bovis isolates, from cattle slaughtered in the State of São Paulo, typed in 12 different spoligotypes. Among these isolates 35 were classified in 6 spoligotypes known already, and 8 isolates in 6 new spoligotypes. Within those, 29 isolates corresponded to the SB0295, SB0121 and SB0140 spoligotypes. The SB0140 spoligotype is the major type found in Argentina and is also present in Paraguay and Uruguay. The SB0120 spoligotype is the most frequently observed type in France (26%) and has also benn in Belgium, China, Denmark, Iran, Japan, Portugal, Russia, South Africa, Sri Lanka and the Netherlands. The AR28 spoligotype has also benn found in Argentina and Brazil. SB0122 was only cited in the Netherlands. It is important to emphasize that among the new spoligotypes found in the present study, at the moment, there are 6 unique spoligotypes, 2 of them isolated as N7 spoligotype and 2 isolated as the N8 spoligotype. The results show that there are in Brazil spoligotypes that, up to this moment, seem to be shared between Brazil, Argentina and Europe, and therefore the molecular discrimination of the M. bovis isolates by the Spoligotyping constitutes a tool for surveillance systems in detecting focuses of bovine tuberculosis.

KEY WORDS:
Mycobacterium bovis; Spoligotyping; molecular characterization; bovine tuberculosis; surveillance systems.

INTRODUÇÃO

A tuberculose bovina é uma doença zoónotica, causada pelo Mycobacterium bovis cujo principal hospedeiro é o rebanho bovino. Diversas espécies de mamíferos inclusive o homem podem infectar-se pelo bacilo. Além do risco à saúde publica, existem as perdas econômicas em conseqüência à diminuição de produtividade nos rebanhos acometidos (ACHA & ZYFRES, 2001; NADER & HUSBERG, 1988 apudKANTOR & RITACCO, 1994) e a desvalorização dos produtos de origem animal no mercado internacional (KANTOR & ÁLVARES, 1991).

No Brasil, testes de tuberculinização realizados em 1989, em quatro regiões do país, revelaram níveis de infecção situados entre 0,9 e 2,9%, com 6,2 a 26,3% dos rebanhos contendo animais reatores (KANTOR & RITACCO, 1994). Estudo realizado em 1999, em 7 regiões do Estado de Minas Gerais, envolvendo aproximadamente 1.600 propriedades e 23.000 animais, estimou a prevalência de animais infectados em 0,8%. No mesmo estudo foram detectadas 5% de propriedades com animais reagentes, sendo importante destacar que este valor subiu a 15% no universo de propriedades produtoras de leite com algum grau de mecanização da ordenha e de tecnificação da produção (BELCHIOR,2 000).

Programas de erradicação baseados em testes de tuberculinização com posterior abate dos animais reatores, têm obtido diversos resultados em vários países como na União Européia, onde a situação sanitária não é homogênea e existem: países que erradicaram a doença.(Dinamarca, Holanda e Luxemburgo), países nos quais a prevalência da doença é extremamente pequena (Alemanha, Bélgica, Inglaterra, França, Grécia e Portugal) e outros onde a doença ainda não está suficientemente controlada (Itália, Irlanda e Espanha). Nestes programas, aos métodos diretos de diagnóstico é reservada uma função estratégica e de apoio às ações de vigilância, tradicionalmente desenvolvidas nas fases de erradicação ou de baixa prevalência de focos.

Quanto aos métodos diretos de diagnóstico, a visualização de micobactérias através da coloração de Ziehl-Neelsen, a despeito de ser rápido e barato, só consegue revelar a presença de bacilo álcool-ácido resistente em concentrações superiores a 10⁴ bactérias por mL. Esta técnica não permite distinguir membros da família Mycobacteriaceae (BARKSDALE & KIM, 1977), e outros microorganismo, tais como Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus, que apresentam as mesmas características tintoriais (PRITCHARD, 1998). As técnicas microbiológicas clássicas empregadas para isolamentos de micobactérias revelam baixa sensibilidade, pois há perdas consideráveis nos processos de descontaminação, além do consumo de várias semanas entres o isolamento primário e a identificação final da espécie (CORNER et al., 1994). Embora resultados promissores tenham sido descritos com a aplicação na reação da cadeia da polimerase (PCR) diretamente da lesão (SAKAMOTO et al., 1999, ZUMARRAGA et al., 2001) ainda não é possível prescindir do isolamento através das técnicas clássicas para fins diagnósticos.

Uma combinação que tem se mostrado eficiente para o diagnóstico direto da tuberculose bovina é o isolamento através de bacteriologia clássica, seguido da identificação por métodos moleculares PRA-PCR (TELENTI et al., 1993); Spoligotyping - (KAMERBEEK et al., 1997) e (VAN SOOLINGEN et al., 1995); MIRU-VNTR (SUPPLY et al., 2000). Além de identificar a espécie, as técnicas de Spoligotyping e MIRU-VNTR permitem discriminar isolados de M. bovis.

Através do Spoligotyping podemos tipificar estirpe de M bovis por meio da presença ou ausência dos espaçadores de seqüência conhecida (KAMERBEEK et al; e 1997 e VAN SOOLINGEN et al., 1995). O primeiro passo no método é amplificar a região de repetição direta - Direct Repeat (DR) da cepa em estudo por PCR. Os primers usados são baseados na seqüência do DR e permite a amplificação dos espaçadores entre as DR’s. O produto de PCR obtido difere em tamanho por duas razões: primeiro, os amplificados contêm muitos espaçadores com suas DR’s se os oligonucleotídeos iniciadores ligarem em DR’s não imediatamente vizinhos; segundo, os amplificados em cada ciclo funcionam eles mesmos como primers e se tornam elongados com uma ou mais DVR's.

Assim, o Spoligotyping possibilita a detecção e a tipificação simultâneas de micobactérias do Complexo tuberculosis (KAMERBEEK et al., 1997), e é indicada como técnica de eleição para a comparação de estirpe com poucas cópias de IS 6110. Outra vantagem é a diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis pela ausência e presença, respectivamente, dos espaçadores 39 ao 43. Novos espaçadores estão sendo estudados para tentar melhorar seu polimorfismo.

A partir do final da década de 1990, sugiram os primeiros estudos com isolados de M. bovis de várias partes do mundo através dessas técnicas. Zumarraga et al, (1999a) e HADDAD et al. (2001) descreveram o espoligotipos SB 0140 como majoritário na Argentina e também presente nos paises limítrofes como Paraguai e Uruguai. HADDAD et al. (2001); e ARANAZ et al. (1996) descreveram os espoligotipos SB0140, SB0295, SB0121 e SB0122 na Inglaterra, Bélgica, Holanda e França. O padrão SB0120, também denominado BCG like, representa 26% das estirpes da França e já foi detectado em diversos outros paises como Bélgica, Brasil, China, Dinamarca, Iran, Japão, Portugal, Rússia, África do Sul, Espanha, Sri Lanka, Holanda, mas não são encontrados na Inglaterra e Irlanda (HADDAD et al., 2001; ARANAZ et al., 1996; VAN EMBDEN et al., 2000; KREMER et al., 1999).

O objetivo do presente trabalho foi estudar, pela técnica de Spoligotyping, 43 isolados de M. bovis, provenientes de bovinos abatidos no Estado de São Paulo e que apresentaram lesões sugestivas de tuberculose durante a inspeção de carnes.

MATERIAIS E MÉTODOS

Lesões sugestivas de tuberculose bovina foram colhidas em abatedouros do Estado de São Paulo, durante o período de agosto de 2002 à março de 2003. Essas lesões foram acondicionadas em frascos plásticos contendo solução saturada de borato de sódio (Na₂B₄O₇·10H₂O, 140 g/L) (RICHARDS & WRIGHT, 1983; HERNÁDEZ DE HANDA et al., 1997). Essas amostras foram transportadas para o Laboratório de Zoonoses Bacterianas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, onde foram processadas no prazo máximo de 60 dias para a tentativa de isolamento de micobactérias, conforme descrito pelos métodos de laboratório de micobacteriologia veterinária para o isolamento e identificação de micobactérias (CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1973). Dos isolados caracterizados como BAAR foi extraído o DNA para a realização da técnica de Spoligotyping (KAMERBEEK et al., 1997).

Os padrões polimórficos foram comparados com banco de dados internacional, disponível na literatura (ZUMARRAGA et al., 1999a; HADDAD et al., 2001; ARANAZ et al., 1996; VAN EMBDEN et al., 2000; KREMER et al., 1999.) A nomenclatura adotada para os espoligotipos encontrados foi a mesma que encontra-se disponível no site www.mbovis.org . Os novos espoligotipos encontrados foram nomeados pelos autores.

Com o apoio da Coordenadoria de Defesa Agropecuária, foi realizado o rastreamento das propriedades de origem dos animais infectados.

RESULTADOS

Os resultados obtidos estão organizados nas Tabelas 1 e 2.

Tabela 1
Perfil dos espoligotipos encontrados. São Paulo, 2004.

Espoligotipo segundo www.mbovis.org	Espécie	Perfil do espoligotipo
SB0140	M. bovis	1101101000001110111111111111111111111100000
SB0121	M. bovis	1101111101111110111101111111111111111100000
SB0120	M. bovis	1101111101111110111111111111111111111100000
SB 0295	M. bovis	1101111101111110111101111111111111110100000
SB0122	M. bovis	0101111101111110111101111111111111111100000
Ar 28*	M. bovis	1101111101111000001101111111111111111100000
N 7**	M. bovis	0000000000011110111111111111111111111100000
N 8**	M. bovis	1101111101111110111111110000000000111100000
N 9**	M. bovis	1101111101111110111101011111111111111100000
N 10**	M. bovis	1101111001111110111101111111111111110100000
N 11**	M. bovis	1101111101111110111101111110111111110100000
N 17**	M. bovis	1101111101111110111101111000000111111000000

• ^*
  Espoligotipo ausente do site www.mbovis.org, mas já descrito por ZUMARRAGA et al., 1999b.
• ^**
  Novos espoligotipos encontrados e que foram nomeados pelos autores.

Tabela 2
Espoligotipos, segundo o número de isolados e a procedência. São Paulo, 2004.

Espoligotipo segundo www.mbovis.org	Número de isolados	Município de procedência do animal ou do abatedouro
SB0295	2	Birigui
SB0295	1	Descalvado
SB0295	1	Franca*
SB0295	1	Monte Aprazível
SB0295	1	Jose Bonifácio
SB0295	1	João Ramalho
SB0295	1	Macaubal
SB0295	1	Rinopólis
SB0295	1	Salmourão
SB0295	1	Votuporanga
SB0121	1	Álvares Florence
SB0121	1	Assis
SB0121	1	Barbosa
SB0121	1	Coroados
SB0121	1	Ipigúa
SB0121	3	Franca
SB0121	1	Monte alto
SB0121	1	Palestina
SB0121	1	Promissão
SB0140	1	Bebedouro
SB0140	2	Conchas*
SB0140	1	Echaporã
SB0140	1	Luiziânia
SB0140	1	Penápolis
SB0140	1	Viradouro
Ar 28*	1	Assis
Ar 28*	1	Santa Albertina
BCG SB0120	1	Monte Azul Paulista
BCG SB0120	1	Guarani do O’este
SB0122	1	Ipigúa
SB0122	1	Santa Adelina
N 7 **	1	Sorocaba*
N 7**	1	Cosmorama
N 8**	1	Mogi Mirim*
N 8**	1	Santa Adelina
N 9**	1	Sorocaba
N 10**	1	Cosmorama
N 11**	1	Assis*
N 17**	1	Pirapozinho

• ^*
  Espoligotipo ausente do site www.mbovis.org, mas já descrito por ZUMARRAGA et al., 1999b.
• ^**
  Novos espoligotipos encontrados e a serem descritas com nomenclatura sugerida pelos autores.

DISCUSSÃO

Dos 43 isolados de M. bovis estudados pelo Spoligotyping, foram encontrados 12 diferentes espoligotipos (Tabela 1). Trinta e cinco foram classificados em 6 espoligotipos já conhecidos e descritos pela literatura internacional. Os outros 8 isolados foram classificados em 6 novos espoligotipos, ainda não descritos.

Vinte e nove isolados (67% dos M. bovis aqui estudados), foram classificados nos espoligotipos SB0295 (25,6%), SB0121 (25,6%) e SB0140 (16%). Zumarraga et al. (1999b) descreveram o espoligotipo SB0140 como majoritário na Argentina e também presente no Paraguai e Uruguai e, apesar de terem estudado 23 isolados brasileiros, inclusive do Estado de São Paulo, não referiram a presença deste espoligotipo no Brasil. Os espoligotipos SB0295 e SB0121, que se mostraram majoritários no presente estudo, ainda não foram descritos em paises da América Latina, exceto no Brasil (ZUMARRAGA et al., 1999a) - SB0121; (ZANINI et al., 2001) - SB0295). HADDAD et al. (2001) descreveram o SB0295 na Holanda e o SB0121 na Bélgica.

O espoligotipo SB0120 (4,6% dos isolados) é o mais freqüente na França (26%) e também já foi encontrado na Bélgica, China, Dinamarca, Iran, Japão, Portugal, Rússia, África do Sul, Espanha, Sri Lanka e Holanda. Não foi detectado na Inglaterra e Irlanda (HADDAD et al., 2001; ARANAZ et al., 1996; VAN EMBDEN et al., 2000; KREMER et al., 1999).

O espoligotipo AR28 (4,6% dos isolados), já foi encontrado na Argentina e no Brasil (ZUMARRAGA et al., 1999b).

O espoligotipo SB0122 (4,6%) foi referido apenas na Holanda (www.mbovis.org).

Relativamente aos novos espoligotipos encontrados no presente estudo, importante ressaltar que até o momento 6 deles são espoligotipos únicos, 2 isolados foram classificados provisoriamente como espoligotipo N7 (isolados de animais de diferentes propriedades) e 2 isolados no espoligotipo N8 (provenientes de animais localizados em municípios diferentes).

Estes resultados mostram que existem no Brasil espoligotipos que parecem, até o momento, ser compartilhados entre Brasil, Argentina e Europa (SB0140 e AR28) e exclusivamente pelo Brasil e Europa (SB0295, SB0121, SB0120 e SB0122), demonstrando relações epidemiológicas entre o Brasil e estas duas regiões.

A discriminação molecular de isolados de M. bovis através do Spoligotyping é uma técnica nova, sofistiticada, mas não apresenta grandes dificuldades na sua realização. Constitui-se numa ferramenta valorosa para dar apoio e racionalidade aos sistemas de vigilância para detecção de focos de tuberculose bovina, sistema este de grande importância para as áreas de baixa prevalência de focos, como parece ser grande parte do território brasileiro.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jun 2024
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2004

Histórico

• Recebido
  05 Jul 2004
• Aceito
  04 Set 2004