COMPARAÇÃO DE CALDOS DE ENRIQUECIMENTO INCUBADOS EM DUAS DIFERENTES TEMPERATURAS E DE MEIOS DE CULTURA NA PESQUISA DE SALMONELLA GALLINARUM

COMPARISON OF ENRICHMENT BROTHS INCUBATED IN TWO DIFFERENT TEMPERATURES AND OF CULTURE MEDIUMS USED IN SALMONELLA GALLINARUM RESEARCH

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de duas temperaturas de enriquecimento (37º e 42º C) e o desempenho de dois caldos de enriquecimento seletivo e 2 meios de cultura, utilizados para isolamento de Salmonella Gallinarum em aves. Alíquotas de cada amostra de órgãos das aves contaminadas experimentalmente com S. Gallinarum foram inoculadas em caldos Tetrationato-Novobiocina e Rappaport-Vassiliadis. Os ágares Verde Brilhante e Hektoen foram usados para o isolamento de salmonela. Os resultados mostraram que o caldo TetrationatoNovobiocina a 42º C associado com ágar Hektoen proporcionou a maior eficiência de isolamento de S. Gallinarum.

PALAVRAS-CHAVE:
Aves; enriquecimento seletivo; Salmonella Gallinarum

ABSTRACT

The present study was aimed to evaluate the effect of two enrichment temperatures (37º and 42º C) and the acton of two selective enrichment broths and two culture agars, used for isolation of Salmonella Gallinarum in poultry. Aliquots of each sample of organs of the poultry experimentally infected with S. Gallinarum were inoculated in Tetrationato-Novobiocina and Rappaport-Vassiliadis broths. Brilliant Green and Hektoen agar were used for isolation of salmonela. The results showed that the Tetrationato-Novobiocina broth at 42º C associated with Hektoen agar provided the greatest efficiency of isolation of S. Gallinarum.

KEY WORDS:
Poultry; selective enrichment; Salmonella Gallinarum

INTRODUÇÃO

As salmoneloses aviárias são enfermidades provocadas por bactérias do gênero Salmonella. Infectam aves e podem causar o tifo aviário, cujo agente etiológico é a Salmonella enterica sorovar Gallinarum (OLIVEIRA et al., 2001). Este sorotipo, conhecido por ser hospedeiro-adaptado, produz uma doença sistêmica bastante severa em galinhas, que causa perdas econômicas na avicultura mundial, pois provoca alta morbidade e mortalidade, queda na produção de ovos e pintinhos de baixa qualidade (BERCHIERI JÚNIOR, 2001).

A S. Gallinarum pode ser identificada por meio de reações bioquímicas, é uma bactéria Gram negativa, imóvel, e sua configuração antigênica é semelhante à de S. Pullorum. Pertence ao grupo D, apresentando os antígenos somáticos (O) 1, 9 e 12 (POMEROY & NAGARAJA, 1991). Sua virulência está relacionada com a composição do lipopolissacarídeo (antígenos somáticos) e com presença de plasmídeos (BERCHIERI JÚNIOR, 2000). O isolamento e identificação desta bactéria é demorado devido ao tempo necessário para obtenção dos resultados. É necessário um dia para a etapa de enriquecimento seletivo, além de 2 a 3 dias para as etapas de isolamento em ágar seletivo, identificação bioquímica e confirmação com testes sorológicos. As colônias da S. Gallinarum são pequenas em relação às das salmonelas paratíficas, apresentando diâmetro entre 1 a 4 micra (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).

Para FAGERBERG & AVENS (1976) os resultados das análises de Salmonella dependem da técnica e dos meios de cultura utilizados.

Apesar de sua morosidade e labor, o método tradicional para detectar presença das salmonelas incluídas no Plano Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) é amplamente utilizado em laboratórios credenciados pelo Ministério de Agricultura, sendo este, o método oficial recomendado pela legislação brasileira.

Muito embora, o tifo aviário seja uma doença erradicada (SILVA, 1984; POMEROY & NAGARAJA, 1991), no Brasil, tem sido diagnosticada em áreas de exploração de aves de postura comercial, mas também pode ocorrer em aves reprodutoras (para corte e postura) (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).

A S. Gallinarum é altamente patogênica para as aves em qualquer idade e embora sua ocorrência seja mais comum em aves adultas (OLIVEIRA et al., 2001). Quando a enfermidade acomete aves jovens, o quadro é diferenciado somente após o isolamento e identificação do agente (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).

O diagnóstico do tifo aviário baseia-se nos achados: clínico, anatomopatológico e exames laboratoriais. Provas sorológicas, como soroaglutinação rápida e soroaglutinação lenta, detectam os anticorpos anti-S. Gallinarum. Os órgãos de eleição para pesquisa do agente etiológico em questão são: coração, fígado e baço (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).

ANDREWS (1986) destaca que a temperatura de incubação, a composição do meio de cultura, a reação do meio com a amostra e o pH são fatores importantes para a reabilitação fisiológica das células de salmonela. O enriquecimento em caldo seletivo, objetiva inibir a multiplicação da microbiota acompanhante e promover a elevação preferencial do número de células de Salmonella. Nesta etapa recomenda-se a utilização de 2 meios de enriquecimento, porque a resistência de Salmonella aos agentes seletivos varia de cepa para cepa. O plaqueamento seletivo diferencial, objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colônias de Salmonella, com características típicas que as distinguam dos competidores. Recomenda-se que o plaqueamento diferencial seja feito em mais de um tipo de meio de cultura (SILVA et al., 1997).

A temperatura ideal para multiplicação de Salmonella é 35-37º C, sendo a mínima de 5º C e a máxima 47º C. Vários estudos indicam, no entanto, que valores máximo e mínimo dependem do sorotipo (FRANCO & LANDGRAF, 1996).

Diante do acima exposto, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de duas temperaturas de enriquecimento (37º e 42º C) no isolamento de S. Gallinarum em órgãos de aves inoculadas experimentalmente com esta bactéria e verificar o desempenho de dois caldos de enriquecimento seletivo e dois ágares de isolamento, em relação às temperaturas de enriquecimento testadas.

MATERIAL E MÉTODOS

Setenta e cinco pintainhos de corte (machos e fêmeas) de um dia de idade, com peso médio de 48 gramas, da linhagem Cobb, procedentes de matrizes de corte com idade de 42 semanas, foram aleatoriamente selecionados e enviados ao laboratório. Cinco deles foram submetidos a exames sorológico e microbiológico, certificando de serem livres de S. Gallinarum. O restante foi aleatoriamente distribuído em 2 grupos: controle e experimental, contendo 36 aves cada e alojados em biotérios em condições semelhantes ao campo. Foram tratados "ad libitum" com água clorada e ração comercial.

O inóculo foi preparado com cepa de Salmonella Gallinarum proveniente de lote de matriz de postura, tipificado no Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola/IB e no Instituto Fio Cruz. A cepa bacteriana foi mantida em ágar nutriente (Difco) com glicerina tamponada e estocada a 4º C. A cultura foi preparada a partir de uma alçada da cultura pura em 3 mL de caldo BHI (Brain Heart Broth) e incubada a 37º C, durante 24 horas. A cultura continha aproximadamente 1,2 x 10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC) por mL. No 20º dia de vida, foram administrados 0,4 mL de cultura de S. Gallinarum (concentração bacteriana de 10⁸ UFC) em cada uma das 36 aves do grupo experimental, via esofágica.

Aos 31 dias de idade das aves, após 11 dias da inoculação, 30 aves de cada grupo foram sacrificadas e retiradas amostras dos órgãos: fígado, coração e baço para avaliação microbiológica, fazendo-se um "pool" desses órgãos que foram macerados em gral e pistilo.

O "pool" de órgãos macerados de cada ave foi transferido para dois diferentes caldos de enriquecimento seletivo: Tetrationato-Novobiocina (Difco) e Rappaport-Vassiliadis (Difco), na proporção de 1 g e 0,1 g em 10 mL, respectivamente, incubados à 37 e 42º C em estufa bacteriológica durante 24 horas. A partir dos caldos, cada amostra foi semeada com alça bacteriológica em placas de Petri, contendo ágar Verde Brilhante (Difco) e ágar Hektoen (Difco) e foram incubadas a 37ºC, durante 24 horas. As colônias obtidas nas placas com características típicas do gênero Salmonella foram confirmadas por meio de provas bioquímicas e sorológicas. Foi realizada uma identificação bioquímica presuntiva, onde 3 a 5 colônias foram inoculadas com agulha bacteriológica, em tubos contendo o ágar Tríplice Açúcar Ferro (Difco) inclinado, tubos, contendo ágar Lisina (Difco), tubos com Caldo Uréia (Difco), tubo com o meio SIM (Difco) para visualização de indol, H₂S e motilidade e em tubo, contendo ágar Nutriente (Difco) e foram incubados a 37º C durante 24 horas. As colônias que apresentaram perfil bioquímico com o gênero Salmonella foram submetidas à identificação sorológica para detecção de antígenos somáticos (O) e flagelares (H), mediante o uso de soros polivalentes anti-antígenos "O" (Sanofi Pasteur) e anti-antígenos "H" (Sanofi Pasteur) de Salmonella. A prova de detecção destes antígenos foi realizada mediante colheita do crescimento bacteriano em ágar Nutriente, com auxílio de alça bacteriológica e ressuspensão em solução fisiológica a 0,85% esterelizada, depositada em uma lâmina de vidro e adição de igual volume de anti-soro. Após a homogeneização, a prova foi considerada positiva, quando se evidenciou a presença de aglutinação. Cepas imóveis que apresentaram resultados positivos frente ao soro anti-somático "O" polivalente de Salmonella foram caracterizadas antigenicamente com soro-anti somático "D" (09). As cepas que apresentaram resultados compatíveis com Salmonella foram prosseguidas com testes bioquímicos complementares: meio de Clark e Lubs para realização das provas do Vermelho de Metila e de Voges-Proskauer, ágar Citrato de Simons, ágar Fenilalanina, caldo malonato, caldo para descarboxilação de Lisina e Ornitina, caldo para desidrolação de Arginina, caldo para a fermentação de: Glicose, Manitol, Lactose, Sacarose, Dulcitol e Maltose. As cepas foram então identificadas sorológica e bioquimicamente como S. Gallinarum.

Os resultados obtidos foram analisados pelo teste t de Student (FONSECA & MARTINS,1996) ao nível de significância 5%, para comparação das médias de duas temperaturas distintas e a eficiência dos caldos de enriquecimento seletivo e dos ágares utilizados para o isolamento de Salmonella Gallinarum.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos no presente estudo, onde comparou-se duas diferentes temperaturas, dois diferentes caldos de enriquecimento e dois diferentes ágares para isolamento de S. Gallinarum com os respectivos números positivos de isolamento e percentagens, encontram-se na Tabela 1. Independente das temperaturas que os caldos de enriquecimento foram incubados, observa-se que o caldo Tetrationato-Novobiocina apresentou as melhores percentagens de isolamento de S. Gallinarum. O ágar Hektoen apresentou as maiores percentagens de isolamento de S. Gallinarum quando comparado com o ágar Verde Brilhante.

Calculando-se as médias dos números de isolamentos de S. Gallinarum nas temperaturas utilizadas e os resultados dos isolamentos, observou-se que não houve diferença estatisticamente significativa (p > 0,05) entre as duas temperaturas (37º e 42º C), conforme demonstra Tabela 2.

Calculando-se as médias dos números de isolamentos de S. Gallinarum dos caldos de enriquecimento seletivo, Tetrationato-Novobiocina e RappaportVassiliadis, observou-se que houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) entre os caldos, mostrando que o caldo Tetrationato-Novobiocina é mais eficiente para o isolamento da S. Gallinarum, conforme demonstrado na Tabela 3.

Calculando-se as médias dos números de isolamentos de S. Gallinarum dos meios de cultura, ágar Hektoen e ágar Verde Brilhante, observou-se que não houve diferença estatisticamente significativa (p > 0,05) entre os meios, conforme mostra a Tabela 4. BERCHIERI et al. (1993) em um estudo realizado com amostras de ração para isolamento de Salmonella, observaram diferenças estatísticas significativas nas temperaturas de pré-enriquecimento realizadas a 43º C, em relação à 37º C.

Em estudo de GIOMBELLI & SILVA (2002) os resultados mostraram que o maior índice de resultados positivos para detecção de Salmonella em carnes “in natura”, foi obtido com pré-enriquecimento a 42º C. O caldo Rappaport-Vassiliadis apresentou menor número de isolamento de salmonela nas duas temperaturas testadas. Entretanto, SILVA et al. (1997) ressalta que o caldo Rappaport-Vassiliadis vem ganhando cada vez mais aceitação, tendo sido recentemente aprovado pelo ISO (International Organization for Standardization), como alternativa para o caldo Tetrationato.

Tabela 1
Desempenho dos caldos de enriquecimento seletivo incubados a 37º C e 42º C, dos meios de cultura e percentagens do número de amostras positivas para S. Gallinarum.

Caldos de enriquecimento seletivo/Temperatura (ºC)	Ágares de isolamento	Número de isolamentos de S. Gallinarum	Percentagem (%) de isolamentos de S. Gallinarum
Tetrationato-Novobiocina/42	Hektoen	30	100
	Verde Brilhante	25	88,3
Tetrationato-Novobiocina/37	Hektoen	26	86,7
	Verde Brilhante	20	66,7
Rapapport-Vassiliadis/42	Hektoen	21	70
	Verde Brilhante	17	56,7
Rapapport-Vassiliadis/37	Hektoen	19	63,3
	Verde Brilhante	15	50

Tabela 2
Comparação das temperaturas a 42º C e 37º C utilizadas para o isolamento de S. Gallinarum e o número de isolamentos positivos.

Caldos/Ágares	Nº de isolamento de S. Gallinarum a 42º C	Nº de isolamento de S. Gallinarum a 37º C
Tetrationato-Novobiocina/Hektoen	30	26
Tetrationato-Novobiocina/Verde Brilhante	25	20
Rappaport-Vassiliadis/Hektoen	21	19
Rapapport-Vassiliadis/Verde Brilhante	17	15
µ	23,25a	20a
S	30,9	20,7

Médias seguidas pela mesma letra, não difere estatiscamente pelo teste t a 5% de probabilidade.µ - média aritmética do número de isolamento das diferentes temperaturas.S - desvio padrão do número de isolamento com as diferentes temperaturas.

Tabela 3
Desempenho dos diferentes caldos de enriquecimento seletivo a 37ºC e 42º C para o isolamento de S. Gallinarum.

Ágares/Temperatura (ºC)	Nº de isolamento de S. Gallinarum do Tetrationato-Novobiocina	Nº de isolamento de S. Gallinarum do Rappaport-Vassiliadis
Hektoen/42	30	21
Hektoen/37	25	17
Verde Brilhante/42	26	19
Verde Brilhante/37	20	15
µ	25,25a	18b
S	16,92	6,7

Médias seguidas pelas mesmas letras distintas, diferem estatiscamente pelo teste t a 5% de probabilidade.µ - média aritmética do número de isolamernto dos diferentes caldos.S - desvio padrão do número de isolamento com diferentes caldos de enriquecimento.

Tabela 4
Desempenho dos diferentes meios de cultura seletivo, ágar Hektoen e ágar Verde Brilhante para o isolamento de S. Gallinarum.

Caldos/Temperatura (ºC)	Nº de isolamento de S. Gallinarum em ágar Hektoen	Nº de isolamento de S. Gallinarum em ágar Verde Brilhante
Tetrationato-Novobiocina/42	30	25
Tetrationato-Novobiocina/37	26	20
Rappaport-Vassiliadis/42	21	17
Rappaport-Vassiliadis/37	19	15
µ	24a	19,25a
S	24,66	18,75

Médias seguidas pela mesma letra, não difere estatiscamente pelo teste t a 5% de probabilidadeµ - média aritmética do número de isolamernto dos diferentes ágaresS - desvio padrão do número de isolamento com os diferentes meios de cultura

CONCLUSÃO

Os resultados deste estudo indicam que 100% das amostras de SG foram isoladas pela combinação do caldo Tetrationato-Novobiocina incubado à temperatura de 42º C associado ao ágar Hektoen.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Set 2024
• Data do Fascículo
  Jan-Mar 2004

Histórico

• Recebido
  20 Fev 2004
• Aceito
  10 Mar 2004