STRATEGY FOR DETECTION OF TOSPOVIRUSES

Radioactive probes were synthesized for the simultaneous detection of tospoviruses by a quick and sensitive dot blot hybridization assay. Total RNA of Tomato spotted wilt virus (TSWV) - infected Nicotiana benthamiana plants was used as template for RT-PCR using sequences of the nucleoprotein (N) and polymerase (L) genes as oligonucleotide primers. Hybridization assays using N gene-derived probes were found to be TSWV-specific, whereas the L gene-derived probe was able to detected all tospoviruses simultaneously.

KEY WORDS:
TCSV; GRSV; INSV; CSNV; ZLCV; IYSV; hybridization.

Authorship

M. Eiras

Centro de Sanidade Vegetal, Instituto Biológico, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, BrasilInstituto BiológicoBrasilSão Paulo, SP, BrasilCentro de Sanidade Vegetal, Instituto Biológico, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, Brasil

R.O. Resende

Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília (UnB)Universidade de BrasíliaDepartamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília (UnB)

A.C. de Ávila

Embrapa - Hortaliças (CNPH)Embrapa - HortaliçasEmbrapa - Hortaliças (CNPH)

*
Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor, junto à Universidade de Brasília

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Fig. 1
Representação esquemática indicando as regiões de anelamento dos oligonucleotídeos nos RNAs genômicos de Tospovirus e os respectivos fragmentos de DNA, amplificados via RT-PCR, utilizados como sondas para hibridização.

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Fig. 2
Hibridização via “slot-blot” com sonda radioativa específica para o gene N (fragmento de 453 pares de bases) (A), e para o gene L (fragmento de 731 pares de bases) (B), sintetizadas a partir da espécie Tomato spotted wilt virus (TSWV). Amostras constituem 1µg (30 µL) de RNAs totais extraídos para as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV). Temperatura de hibridização de 45 ^oC.

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Fig. 3
Hibridização via “slot-blot” com sonda radioativa do gene L (fragmento de 731 pares de bases), sintetizadas a partir da espécie Tomato spotted wilt virus (TSWV). Amostras constituem 1µg (30µL) de RNAs totais extraídos para as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV). Temperatura de hibridização de 45 ^oC.

Fig. 1 Representação esquemática indicando as regiões de anelamento dos oligonucleotídeos nos RNAs genômicos de Tospovirus e os respectivos fragmentos de DNA, amplificados via RT-PCR, utilizados como sondas para hibridização.

Fig. 2 Hibridização via “slot-blot” com sonda radioativa específica para o gene N (fragmento de 453 pares de bases) (A), e para o gene L (fragmento de 731 pares de bases) (B), sintetizadas a partir da espécie Tomato spotted wilt virus (TSWV). Amostras constituem 1µg (30 µL) de RNAs totais extraídos para as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV). Temperatura de hibridização de 45 ^oC.

Fig. 3 Hibridização via “slot-blot” com sonda radioativa do gene L (fragmento de 731 pares de bases), sintetizadas a partir da espécie Tomato spotted wilt virus (TSWV). Amostras constituem 1µg (30µL) de RNAs totais extraídos para as seguintes espécies de tospovírus: TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus (IYSV). Temperatura de hibridização de 45 ^oC.

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E-mail: arquivos@biologico.sp.gov.br

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Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor, junto à Universidade de Brasília